różnicowanie, nerki, nefrogeneza, progenitory nefronu,

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ABSTRAKCYJNY

Wyposażenie nefronowe, określone w okresie płodowym, dyktuje zdrowie nerek i związanego z nim układu sercowo-naczyniowego przez całe życie. Pokazujemy tutaj, że pomimo jego negatywnego wpływu nawzrost nerek, genetyczny wzrost GDNF przedłuża program nefrogenny poza jego normalne ustanie. Wieloetapowa analiza mechanistyczna wykazała, że ​​nadmiar GDNF utrzymuje prekursory nefronu i nefrogenezę poprzez zwiększoną ekspresję jego wydzielanych celów i wzmocnioną sygnalizację WNT, co prowadzi do dwuczęściowego wpływu na utrzymanie progenitora nefronu. Rażąco wysoki GDNF in nerki embrionalne pobudzają nerkijego znane cele, ale także Wnt9b i Axin2, z towarzyszącym spowolnieniem proliferacji komórek progenitorowych nefronu. Spadek poziomu GDNF w okresie poporodowymnerki normalizują siępączka moczowodu i tworzy sprzyjające środowisko dla kontynuacji programu nefrogennego, jak wykazano przez morfologicznie i molekularnie prawidłową samoodnowę i różnicowanie progenitorów nefronu po urodzeniu. Wyniki te wskazują, że nadmiar GDNF ma dwufazowy wpływ na prekursory nefronu u myszy, które mogą wiernie reagować na manipulację dawkowaniem GDNF w okresie płodowym i poporodowym. Nasze wyniki sugerują, że wykrywanie poziomu aktywności sygnalizacyjnej jest ważnym mechanizmem, poprzez który GDNF i inne cząsteczki przyczyniają się do określania długości życia prekursora nefronu.

Cistanche tubulosa vs suplement Deserticoladlaodżywianie nerek

WPROWADZANIE

Nerka ssaka jest nieregenerującym się narządem filtrującym krew, spełniającym podstawowe funkcje detoksykacyjne i równoważące elektrolity.

Nefrony pełniące te funkcje rodzą się w okresie płodowym, ponieważ nerka dorosłego wykazuje jedynie ograniczoną zdolność naprawczą lub kompensacyjne powiększenie kłębuszków (przerost) (Chawla i Kimmel, 2012; Rinkevich i wsp., 2014; Romagnani i wsp., 2013). Wrodzona niska masa nefronu jest powszechnie akceptowanym czynnikiem ryzyka nadciśnienia tętniczego, białkomoczu, stwardnienia kłębuszków nerkowych i schyłkowej niewydolności nerek (Bertram i wsp., 2011; Hoy i wsp., 2008), a zatem ma duży wpływ na zdrowie nerek przez całe życie. Program nefrogenny kończy się między tygodniem ciąży 35-37 u ludzi a 3 dniem po urodzeniu (P) u myszy (Hartman i wsp., 2007; Hinchliffe i wsp., 1991; Ryan i wsp., 2018), ale mechanizmy przyczyniające się do ustania są słabo rozumiane. Postulowano, że zaangażowane są specyficzne dla stadium zmiany we wzorcach wzrostu (Cebrián et al., 2004) oraz wewnętrzne mechanizmy wykrywania wieku komórek (Chen et al., 2015a). Molekularnie, sygnalizacja SMAD indukowana przez białko morfogenetyczne kości (BMP) (Brown i wsp., 2015), hamartin (Tsc1) (Volovelsky i wsp., 2018) oraz regulacja mikroRNA (Yermalovich i wsp., 2019) uczestniczą w określaniu nefrogennego Czas Trwania Programu. Jednak plastyczność programu nefrogennego nie została w pełni zbadana. Nefrony różnią się od puli prekursorów nefronu (NP), znanej również jako mezenchym metanefryny lub czapeczki. NP wyrażające unikalny repertuar markerów, w tym SIX2, czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF) i CITED1, są obecne tylko w nerce embrionalnej, gdzie otaczają każdą końcówkę pączka moczowodu (UB) od momentu jej powstania (Boyle et al., 2008; Self i in., 2006). Proces nefrogenezy jest zsynchronizowany z rozgałęzieniem UB, które jednocześnie utrzymuje samoodnowę w niezróżnicowanej populacji NP i indukuje podzbiór NP do stopniowego przejścia mezenchymu do nabłonka poprzez dobrze zdefiniowane stadia prekursorowe ( skupiska pretubularne, PA; pęcherzyki nerkowe , RV; ciała w kształcie przecinka, CSB; ciała w kształcie litery S, SSB), które ostatecznie różnicują się w funkcjonalne nefrony (Kobayashi i in., 2008; Lindström i in., 2018). Równowaga między samoodnową a różnicowaniem w obrębie populacji NP zależy od sygnałów pośredniczących we wzajemnych indukcyjnych oddziaływaniach tkankowych zachodzących między UB a sąsiednim mezenchymem. Mezenchymy metanefryczne i sygnały pochodzące z NP, takie jak GDNF i czynniki wzrostu fibroblastów (FGFs), regulują morfogenezę UB, dzięki której nerka zarodka powiększa się, uzyskuje swój kształt i ustanawia system przewodów zbiorczych (Costantini i Kopan, 2010). Sygnalizacja RET aktywowana przez GDNF w końcówkach UB reguluje profil transkrypcyjny odpowiedzialny za kontrolę gromadzenia progenitorów przewodów i morfogenezy UB (Kurtzeborn i wsp., 2018; Li i wsp., 2019; Lu i wsp., 2009; Ola i wsp.). , 2011; Riccio i in., 2016). Transkrypty regulowane przez GDNF zawierają również białka sekrecyjne, takie jak WNT11 i CRLF1, o wykazanym potencjale regulacji programu nefrogennego (O'Brien i wsp., 2018; Schmidt-Ott i wsp., 2005). Innymi regulatorami nefrogenezy pochodzącymi z UB są WNT9b i FGF-ligandy wpływające na utrzymanie i różnicowanie NP (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). Wcześniej informowaliśmy, że genetyczne zaburzenie nieulegającego translacji regionu Gdnf 3′ powoduje 3- do 6-krotnie zwiększoną ekspresję endogennego GDNF i skutkuje hipoplazją nerek z powodu defektu rozgałęzienia UB (Kumar et al., 2015). W przeciwieństwie do śmiertelności noworodków w przypadku nokautu Gdnf, myszy Gdnfhyper/hiper przeżywają do 3 tygodni i ujawniły zasadniczą rolę GDNF w zbieraniu samoodnowy komórek progenitorowych (Costantini, 2012; Kumar i wsp., 2015; Li i wsp., 2019). Tutaj pokazujemy, że nadmiar GDNF, pomimo jego negatywnego wpływu na ogólny wzrost nerek, może wydłużyć żywotność NP, tym samym jeszcze bardziej wzmacniając nowo rozpoznaną plastyczność nerek ssaków.

SŁOWA KLUCZOWE:Różnicowanie, nerka, nefrogeneza, przodkowie nefronu, mysz

WYNIKI

Zarodkowy program nefrogenny zależy od GDNF

Przestrzenne rozmieszczenie SZEŚCIU2-dodatnich nanocząstek w embrionie i wczesnym okresie poporodowymnerkipodąża za stereotypowym, dobrze opisanym wzorcem, w którym początkowa wielokomórkowa tkanka z czasem staje się cieńsza bez większego wpływu na ogólną organizację niszy (Short i in., 2014). NP w nerkach Gdnfhyper/hiper były rozmieszczone wokół nienormalnie szerokiego UB jako cieńsza warstwa (ryc. 1A-F; ryc. S1A, B). Ocena ilościowa NP w E11.5 ujawniła początkowy wzrost, który został przejściowo znormalizowany w E12.5, ale poważnie obniżony w E14.5 w Gdnfhyper/hiper nerki (ryc. 1E-G; ryc. S1C-F). Analiza mitozy wykazała, że ​​zarówno endogennie podwyższony, jak i egzogennie uzupełniony GDNF powoduje znaczne zmniejszenie pHH3 plus NPC (ryc. 1H; ryc. S1G). Łącznie, dane pokazują, że nadmiar GDNF, który działa głównie w UB, gdzie dochodzi do ekspresji jego receptorów (Pachnis i wsp., 1993), indukuje szybki spadek proliferacji komórek NP podczas wczesnego rozwoju nerek.

Wiadomo, że przedwczesne lub przyspieszone różnicowanie NP może powodować zanik komórek NP w ich niszy (Kobayashi i wsp., 2008; O'Brien, 2018). Aby to ocenić, zbadano nefrogenezę poprzez barwienie LEF1 i cykliną D1, które znakują odpowiednio najwcześniejsze komórki zaangażowane w różnicowanie i nefron podlegające pełnej epitelializacji (Lindström et al., 2015). Wykazało to ogólny spadek liczby wczesnych prekursorów nefronów i wskazało na zmniejszone różnicowanie nefronów w embrionalnym hiper/hypernerki(rys. 2). Ocena gęstości kłębuszków dodatkowo potwierdziła to i wykazała niższe ogólne gęstości w hipodysplastycznych nerkach Gdnfhyper/hiper niż w nerkach typu dzikiego (WT) (ryc. S1G). Co ciekawe, analiza kłębuszków korowych w obrębie całego mierzonego obszaru, a zwłaszcza stosunku korowego do kłębuszków całkowitych, wykazała nieco wyższy niż stosunek WT w Gdnfhyper/hiper (Tabela 1; 17% w Gdnfhyper/hiper, 12% w WT). Wskazuje to, że pomimo wczesnego spowolnienia samoodnowy i różnicowania NP, nerki narażone na nadmiar GDNF podczas organogenezy mają trwającą nefrogenezę poporodową z niewielkim wzrostem liczby nowo narodzonych nefronów, które są najbardziej zlokalizowane w korze (Rumballe i in., 2011; Short i in., 2014).

Nadmiar GDNF przedłuża żywotność poporodowej puli NPWiele modeli myszy z niedoborem wwzrost nerek, albo z powodu morfogenezy UB i/lub różnicowania nefronów, umierają natychmiast po urodzeniu (Kuure i Sariola, 2020). Pomimo znacznej hipoplazji, nieprawidłowości w morfologii UB i poważnie zaburzonej nefrogenezy embrionalnej (ryc. 2), myszy Gdnfhyper/hyper przeżywają do 3 tygodni po urodzeniu (Kumar i wsp., 2015; Li i wsp., 2019), zapewniając możliwość zbadać poporodową nefrogenezę.

Jak ustalono (O'Brien, 2018), nasza analiza populacji NP w P1-P10 wykazała dramatyczną utratę w nerkach WT w P3, w której SZEŚĆ2-pozytywności wykryto głównie w

różnicujących prekursorów nefronu i tylko 10 procent analizowanych końcówek UB (nisz) było przykrytych komórkami progenitorowymi nefronu (NPC) (ryc. 3A, n=2 nerek). Jednak SZEŚĆ2-pozytywnych NP wykryto w 59 procentach Gdnfhyper/hiper nisz w P3 (ryc. 3B, n=2 nerki). Podobnie, PAX2-dodatnie NP wykryto w niszach NP Gdnfhyper/hiper nerek w P3, ale komórki PAX2-dodatnie zlokalizowane były wyłącznie w różnicujących się prekursorach nefronów w WTnerki(Rys. 3C,D).

Nefrogeneza w poporodowym Gdnfhyper/hipernerkiwykazali znaczną poprawę w porównaniu z nerkami zarodkowymi, czego przykładem są podobne wzorce prekursorów nefronu w WT i Gdnfhyper/hiper nerkach (Fig. 3E-H; porównaj z Fig. 2). Wreszcie,

odkryliśmy, że mniej więcej 18% nisz NP utrzymywało SZEŚĆ2-pozytywnych NPC w P4, a zaangażowani NPC byli obecni w Gdnfhyper/hypernerkido P6, podczas gdy zaangażowane NPC zostały wykryte w WT

nerkitylko do P4 (Rys. 4; Rys. S1H). Pokazuje to, że długość życia NP in vivo nie jest z góry ustalona i sugeruje, że modulacja poziomów czynnika wzrostu, konkretnie GDNF, przyczynia się do czasu końcowej fali różnicowania nefronów.

Postawiliśmy hipotezę, że utrzymujące się NPC w pourodzeniowym przerostu Gdnfhyper/hiper nerkach mogą wynikać z ogólnych mechanizmów kompensacyjnych wywołanych przez defekty rozgałęzień UB prowadzące do hipoplazji nerek (Kumar i wsp., 2015; Li i wsp., 2019) lub alternatywnie wywodzą się ze swoistych dla GDNF wpływ na populację PN. Aby odróżnić opcje, postnatalne NP przeanalizowano w innych modelach hipoplazji nerek. Fgf9; 20-niedobórnerkiwykazują podobne przerzedzenie embrionalnych warstw komórek NP (Barak et al., 2012), jak wykryto w Gdnfhyper/hypernerki, ale nie udało nam się wykryć SIX2- i/lub PAX2-dodatnich komórek w ich poporodowych niszach NP (ryc. S2). Aby dalej to omówić, przeanalizowaliśmy następnie Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 plus /− nerki (Ihermann-Hella et al., 2014), w których, podobnie jak u myszy Gdnfhyper/hyper, hipoplazja nerek jest spowodowana zaburzeniami rozgałęzień UB. W tym modelu brakowało również oznak przedłużonej nefrogenezy, co wykryto na podstawie obecności komórek SIX2- i/lub PAX2-dodatnich w ich poporodowych niszach NP (ryc. S3), co potwierdza pogląd, że hipoplazja nerek jest to nie wystarcza do utrzymania poporodowej nefrogenezy.

Opublikowane dane pokazują również, że sama hipoplazja nerek nie jest w stanie wspierać utrzymania NP po urodzeniu (Kuure i Sariola, 2020), co dodatkowo sugeruje aktywną rolę GDNF. Nie możemy jednak całkowicie wykluczyć, że nadmiar czynników wzrostu innych niż GDNF miałby taki sam efekt.

Długotrwałe poporodowe NP utrzymują program nefrogenny po jego normalnym ustaniu

Długotrwałe poporodowe NP utrzymują program nefrogenny po jego normalnym ustaniu

Następnie, potencjał różnicowania trwałych NP w poporodowym Gdnfhyper/hypernerkiBył egzaminowany. Analiza Ki67 wykazała porównywalne wzorce proliferacji pourodzeniowej w nerkach WT i Gdnfhyper/hiper do P4 (ryc. 5A, B). Od P5 liczba komórek Ki67-dodatnich zmniejszyła się w korowej strefie różnicowania nerek WT (ryc. 5C, E, G). Taki spadek proliferacji korowej nie został wykryty w Gdnfhyper/hiper nerkach, które wykazywały aktywne cykle komórek w strukturach podobnych do prekursorów nefronu w P7 (ryc. 5D, F,

H), ale już nie w P12 (rys. S4A,B).

Analiza poporodowego różnicowania nefronu wykazała nadmierną ilość prekursorów nefronu w Gdnfhyper/hypernerkido P7, podczas gdy wykryto je w nerkach WT tylko do P4 (ryc. 6; ryc. S4C-F). Taka uporczywa nefrogeneza poporodowa nie zwiększyła jednak gęstości kłębuszków w porównaniu z późnymi stadiami embrionalnymi (ryc. S5A-C; odpowiednio 6,4±2,1 versus 10,2±1,2; średnia±sem). Proporcja kłębuszków korowych w Gdnfhyper/hiper nerkach przy P7 (59 procent) jest 1,5 razy wyższa

Ryc. 1. Wyczerpywanie się prekursorów nefronu w embrionalnym hiper/hiper Gdnfnerki. (A,B) marker progenitorowy nefronu (NP) SIX2 (czerwony) lokalizuje się na końcach pączków moczowodowych (UB) pokrywających mezenchymę (kalbindyna, zielony) w nerkach WT (A; n=4) i Gdnfhyper/hiper (B; n=5 nerki) nerki w E11.5. (C,D) E12.5 WT (C) i Gdnfhyper/hiper (D) nerki hodowane in vitro przez 24 godziny i barwione na SIX2 (czerwony) w celu uwidocznienia populacji NP i kalbindyny (zielony) dla UB (n{{9} } nerki/leczenie, trzy niezależne eksperymenty). (E, F) NP są obfite w E14.5 WT nerki (E; 42,6/końcówka), podczas gdy w Gdnfhyper/nadmiernej nerce NP są wyraźnie zmniejszone (F; strzałki, 29,8/końcówka) (n=207 dla WT i 431 dla końcówek Gdnfhyper/hiper analizowanych w dziewięciu nerkach/genotypie).

Białe strzałki wskazują komórki NP (czerwone).

(G) Analiza SZEŚCIU2-dodatniej ilości NP w WT i Gdnfhyper/hipernerkipokazuje porównywalne początkowe pule NP w E12,5. Dane przedstawiono jako średnią ilość SZEŚĆ2-dodatnich NP±sem w porównaniu z tymi z miotów WT, które są ustawione na 100 procent i odzwierciedlają wyniki uzyskane z czterech niezależnych miotów (WT: 100±15,61 procent, n{{ 7}}; Gdnfhyper/hiper: 124,74±33,89 procent, n=5; P=0,533, dwustronny test t w SPSS). (H) Odsetek proliferujących SZEŚĆ2-dodatnich NP w nerkach Gdnfhyper/hiper przy E12.5 wykazuje znaczny spadek w porównaniu z nerką WT. Dane przedstawiono jako średni odsetek proliferujących SZEŚĆ2-dodatnich NP±sem w porównaniu z tymi z miotów WT, które są ustawione na 100 procent i odzwierciedlają wyniki uzyskane z trzech niezależnych miotów (WT: 100±9,04 procent, n{{ 25}}; Gdnfhyper/hyper: 56,94±12,67 procent , n=5;

*P=0.024, dwustronny test t w SPSS). Słupki skali: 100 µm.

niż w WTnerki(39 procent) (Tabela 1) popiera pogląd, że utrzymująca się pourodzeniowa pula NP w Gdnfhyper/hiper nerkach indukuje nowe nefrony po ustaniu normalnej nefrogenezy.

Myszy Gdnfhyper/hyper z przedłużoną nefrogenezą w nerkach z ciężką hipodysplastyką nie wykazują żadnych objawów neoplazji lub onkogenezy podczas ich krótkiego życia (Kumar i wsp., 2015; Turconi i wsp., 2020).

Gdnfwt/hiper nerki wykazują łagodniejszy embrionalny spadek NPC niż Gdnfhyper/hipernerki. Te myszy żyją normalnie i nie wykazują guzów wnerkas i inne narządy (Turconi i wsp., 2020) (ryc. S6A-D, n=62). Dwukrotny wzrost GDNF podczas embriogenezy nie pozwala jednak na utrzymanie populacji NP w poporodowych Gdnfwt/hiper nerkach (ryc. S6E, F), co sugeruje

Ryc. 2. Wpływ nadmiaru GDNF na nefrogenezę embrionalną. (A) LEF1 (czerwony), marker agregatów pretubularnych, dystalnych pęcherzyków nerkowych i ciałek w kształcie litery S, w nerce WT E14.5. (B) E14.5 Gdnfhyper/hiper nerka wykazuje bardzo mało LEF1-dodatnie różnicujących prekursorów nefronu i typową obfitość nabłonka pączków moczowodowych (UB) wykrytą przez barwienie kalbindyną (zielony).

C WTnerka.

(D) Znacznie mniej różnicujących prekursorów nefronu wykryto w E14.5 Gdnfhyper/hypernerka. (E,F) Lokalizacja cykliny D1 (czerwony) w E16.5 WT (E) i

Gdnfhyper/hyper (F) nerki. Kalbindyna (zielony)

barwienie wizualizuje nabłonek UB na wszystkich obrazach. Dla każdego barwienia na danym etapie n=3 nerek/genotyp. Skala: 100 µm.

Tabela 1. Ilościowa ocena gęstości kłębuszków w nerkach Gdnfhyper/hiper w E18.5 i P7

Dane to średnia ilość nefronu na mm±sem sześcienny (n=4 nerek/genotyp, średnia z ośmiu preparatów analizowanych dla każdej nerki w odstępach 125 µm w celu uniknięcia zliczenia powtórzeń dla tych samych kłębuszków). Odsetek kłębuszków korowych w nerkach WT przy E18,5 wynosi 12%, podczas gdy w nerkach Gdnfhyper/hiper wynosi 17%. W P7 proporcja kłębuszków w korze jest dodatkowo zwiększona w Gdnfhyper/hypernerki,co sugeruje, że nefrony nadal aktywnie różnicują się.

próg dla zdolności GDNF do modulowania programu nefrogennego.

Trwała nefrogeneza poporodowa zależy od zmian w sygnalizacji indukowanej przez GDNF

Ekspresja Gdnf jest tracona z nerek WT przez P2 (www.gudmap.org), podczas gdy jego mRNA i białko są nadal obecne w Gdnfhyper/hyper

Trwała nefrogeneza poporodowa zależy od zmian w sygnalizacji indukowanej przez GDNF

Wyrażenie Gdnf zostało utracone z WTnerkiprzez P2 (www.gudmap.org), podczas gdy jego mRNA i białko są nadal obecne w Gdnfhyper/hyper

nerkidopiero w P7 (ryc. 7A-D). Konserwatywny kompleks receptora GDNF ulega ekspresji tylko w nabłonkowych końcówkach UB (Costantini, 2012;

Golden i wsp., 1999). Ze względu na lokalizację receptora w tkance sąsiadującej z populacją NPC podejrzewaliśmy, że wpływ zwiększonego endogennego GDNF na nefrogenezę musi być pośredniczony

poprzez pochodzące z UB, wydzielane cząsteczki zależne od GDNF (http://www.signalpeptide.de/index.php) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2005) (Tabela 2) lub inne cząsteczki, których ekspresja może ulec zmianie z powodu nadwymiarowego UB.

Analiza ekspresji pochodzących z UB wydzielanych celów GDNF ujawniła znaczącą regulację w górę Crlf1, Srgn i Wnt11 w Gdnfhyper/hiper nerkach w E14,5 (Fig. 7E). Również ekspresja Wnt9b jest znacznie zwiększona (Fig. 7E). Dalsza analiza celów sygnalizacyjnych WNT/-katenina (Clevers i Nusse, 2012) w kontroli E14.5 i Gdnfhyper/hiper nerkach wykazała znaczącą regulację w górę kanonicznej docelowej Aksyny 2 (P=0.003371), podczas gdy WNT z ekspresją NP cele (Karner et al., 2011) wykazały tendencję do zmniejszania się, prawdopodobnie odzwierciedlając zmniejszoną ogólną liczbę NPC (ryc. S7A). Łącznie wskazuje to, że nie tylko zwiększona sygnalizacja indukowana przez GDNF, ale także zwiększona sygnalizacja indukowana Wnt9- i Wnt11- ze znanymi funkcjami w regulacji NPC uczestniczą w pośredniczeniu wzajemnej komunikacji od zmutowanego UB do sąsiedniej puli NP w E14.5 (Karner i in., 2011; Kiefer i in., 2012; Nagy i in., 2016; O'Brien i in., 2018).

Ryc. 3. Różnicowanie nefronu w momencie ustania morfogenezy nerki. (A) Nerka P3 WT utraciła SZEŚĆ2-dodatnich progenitorów nefronu (NP) korowych, na co wskazuje utrata komórek w mezenchymie kapelusza (strzałka). Zamiast tego SIX2 lokalizuje się w bocznych mezenchymach i wczesnych prekursorach nefronu (groty strzałek).

Kwantyfikacja 48 nisz NP (analizowane liczby końcówek) ujawniła tylko pięć nisz z NP. (B) Pozytywny mezenchym czapeczki dla SIX2 jest nadal obecny w Gdnfhyper/hiper nerki w P3 (strzałki). Kwantyfikacja 107 nisz NP (analizowane liczby końcówek) ujawniła 63 nisze z komórkami NP. (C,D) Barwienie PAX2 (czerwony) i kalbindyną (zielony) w WT (C) i Gdnfhyper/hyper

(D) nerki w P3. Strzałki wskazują miejsce, w którym komórki NP są utrzymywane w Gdnfhyper/hipernerki.

(E, F) Porównywalna ilość cyklin D1-dodatnich (czerwonych) prekursorów nefronu w P3 WT (E) i Gdnfhyper/hyper

(F) nerki. (G,H) Wizualizacja LEF1-dodatnich prekursorów nefronu (czerwony) i nabłonka moczowodu (zielony) ujawnia podobną trwającą nefrogenezę w WT

(G) i Gdnfhyper/Hyper (H) nerki. Dla każdego barwienia

n=3 nerki/genotyp. Słupki skali: 100 µm.

Molekularna charakterystyka P5 Gdnfhyper/hypernerkiwykazali utrzymującą się regulację w górę Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 i Uncx4.1 (znaną również jako Uncx), ale także ujawnili zwiększoną ekspresję potencjalnego czynnika niszowego Lama1 (Rayagiri i wsp., 2018), induktora różnicowania nefronów Wnt4 (Stark i wsp. , 1994) i agonista sygnalizacji WNT R-spondyna 1 (Rspo1) (Fig. 7F; Fig. S7B). Taki profil transkrypcji sugeruje zwiększony wpływ UB na NP, które wydają się podlegać fali różnicowania w oparciu o zmniejszoną ekspresję Fgf9 i Fgf20 i przesuniętą lokalizację komórek SIX2 plus (Fig. 4C, D i 7F). Przetestowaliśmy funkcjonalnie, czy najbardziej znacząco zwiększone ekspresje Crfl1, Wnt11 i Wnt9b mogą wpływać na program nefrogenny u myszy. CRLF1 w kompleksie ze swoim fizjologicznym ligandem, cytokiną podobną do kardiotrofiny, indukuje różnicowanie w izolowanych hodowlach mezenchymów nerki szczura (Schmidt-Ott et al., 2005). Charakteryzacja nerek z nokautem Crfl1- wykazała porównywalną wielkość nerek i nefrogenezę z nerkami WT (ryc. S6C-F), co sugeruje zbędne funkcje CRLF1 in vivo. Następnie zbadano wkład zwiększonej kanonicznej sygnalizacji WNT do fenotypów spowodowanych nadmiarem GDNF. IWR1 hamuje tankyrazy 1 i 2, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju nerek (Chen i wsp., 2009; Huang i wsp., 2009; Karner i wsp., 2010). Leczenie IWR1 złagodziło liczbę końcówek UB i morfologię w obecności nadmiaru GDNF (ryc. S8). Na koniec zapytaliśmy, czy znacząco zwiększona ekspresja Wnt11 w Gdnfhyper/hyper nerkach przyczynia się do przedłużonego programu nefrogennego u myszy Gdnfhyper/hyper poprzez skrzyżowanie allelu knockout Wnt11 z tłem Gdnfhyper. Nie udało się wygenerować podwójnej homozygoty

Ryc. 4. Komórki progenitorowe nefronu są stale podtrzymywane w poporodowych nerkach przerostu przerostu gruczołu krokowego. (A,B) Lokalizacja markera progenitorowego nefronu (NP) SIX2 (czerwony) w WT w P4 (A) i P6 (B) wskazuje na utratę NP w nerkach WT, w których SIX2 występuje tylko w słabo dodatnich pęcherzykach nerkowych (gwiazdki) . (C) W Gdnfhyper/hiper nerkach w P4 SIX2 lokalizuje się również w NP pokrywających końcówki pączków moczowodu (zielone) (strzałki) (n=315 końcówki w WT i 245 w Gdnfhyper/hiper analizowane w czterech nerkach/genotypie). (D) Lokalizacja SIX2 (czerwony) i kalbindyny (zielony) w P6 Gdnfhyper/hiper nerki ujawnia przetrwanie zaangażowanych komórek NP (13; * wskazuje na różnicowanie nefronów) w zmutowanej nerce (n=3nerki/genotyp) . Ocena ilościowa nisz komórek NP wykazała bardzo niewiele końcówek, które nie miały SZEŚCIU2-dodatnich NP w nerkach WT, podczas gdy 81 procent nisz w nerkach Gdnfhyper/hiper (n=2, 16 nisz) towarzyszyło z SZEŚĆ2-pozytywnością w zaangażowanych i różnicujących prekursorach nefronów. Skala: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− potomstwo (Tabela 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /− hodowla). Wyniki te wskazują na śmiertelność embrionów dla mutantów Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− i zmusiły nas do skupienia się na analizie nerki Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /−. Usunięcie jednego allelu Wnt11 w Gdnfhyper/hiper tła nieznacznie poprawiło morfologię UB i zmniejszyło rozmiar nerek dalej niż w Gdnfhyper/hiper, prawdopodobnie odzwierciedlając zmniejszone tworzenie torbieli przewodu zbiorczego po zmniejszeniu dawki Wnt11 (ryc. S9A-C). Jednakże, SZEŚĆ2-dodatniej populacji NP została zwiększona (29,8 NPC/końcówkę w porównaniu z 40,7 NPC/końcówkę w E14,5 i 20,3 NPC/końcówkę w porównaniu z 30,9 w P0), a nefrogeneza uległa poprawie w korowej strefie różnicowania Gdnfhyper/hiper ;Wnt1 plus /− nerki (ryc. 8; ryc. S9D-F; porównaj także z ryc. 1F). Zatem wyniki te sugerują, że zwiększone poziomy GDNF zwiększają kilka pochodzących z pąków celów GDNF/Ret, które nie same, ale w połączeniu ze sobą i wraz ze zwiększoną kanoniczną sygnalizacją WNT, regulują NPC w nerkach embrionów.

DYSKUSJA Liczba nefronów jest określana podczas życia płodowego i może się znacznie różnić u poszczególnych osób. Ekspansja i długość życia NP w dużym stopniu wpływa na ostateczne wyposażenie nefronowe, dlatego ważna jest identyfikacja mechanizmów regulacyjnych, które kontrolują samoodnowę NP. Tutaj pokazujemy, że neurotropowy czynnik GDNF, o którym wiadomo, że inicjuje rozwój nerek i reguluje morfogenezę UB (Costantini, 2010; Kurtzeborn i wsp., 2018; Li i wsp., 2019), pomimo negatywnego wpływu na wzrost nerek, jest zdolny przedłużenia programu nefrogennego poza jego normalne ustanie. Nasze wyniki pokazują, że nadmiar GDNF ma dwufazowy wpływ na samoodnowę i utrzymanie NP. Na podstawie naszej analizy proponujemy model funkcjonowania nadmiaru GDNF w Gdnfhyper/hiper nerki

poprzez mechanizmy, które obejmują zmiany w progresji cyklu komórkowego i zdolność do wyczuwania poziomów czynników wzrostu. Początkowo w nerkach embrionalnych, wysokie poziomy GDNF powodują szybki spadek liczby NP w niszy, co jest typowe dla wielu mysich modeli z pierwotnym niedoborem UB (Carroll i Das, 2013; Chen i wsp., 2015b; Costantini i Kopan, 2010; Liu i in., 2018). Przedwczesny spadek NP obserwowany w tych wcześniej opublikowanych modelach jest zwykle spowodowany ich przedwczesnym różnicowaniem, co nie ma miejsca w przypadku hipernerki/hiper nerek. Zamiast tego nadmiar GDNF jest w stanie utrzymać aktywny cykl komórkowy w poporodowej korze nerkowej znacznie dłużej niż obserwowany w nerkach WT. Proliferacja zachodzi w komórkach NP, które utrzymują się dłużej niż w nerkach WT i nadal wytwarzają nowe nefronów. W przyszłości interesujące będzie sprawdzenie, czy będzie możliwe podawanie nadmiaru GDNF w sposób korzystny dla kontynuacji nefrogenezy poporodowej bez poważnego wpływu na morfogenezę UB w celu zniekształcenia ogólnego wzrostu narządów. Nasze dane pokazują, że wczesny spadek embrionalnych nanocząsteczek Gdnfhyper/hiper nerek jest spowodowany raczej zmniejszoną proliferacją komórek niż zwiększonym przedwczesnym różnicowaniem. Ten mechanizm komórkowy jest wspierany przez zmiany molekularne wykryte w znanych celach GDNF (Crlf1, Wnt11 i Srgn) (Lu i wsp., 2009; Ola i wsp., 2011) oraz w ważnych regulatorach sygnalizacji utrzymania komórek NP (Wnt9b, Wnt11 i ich cele transkrypcyjne) (Karner i wsp., 2011; Kiefer i wsp., 2012; O'Brien i wsp., 2018). Wcześniejsze badanie długowieczności i odporności komórek NP poprzez ablację populacji NP toksyną błonicy A lub zakłócenie aktywacji MAPK/ERK, które skutkowały szybkim spadkiem liczby komórek NP bez pozytywnego wpływu na ich długość życia (Cebrián et al., 2014 ; Ihermann-Hella i wsp., 2018) wraz z naszymi wynikami sugerują, że proliferacja komórek NP z natury odgrywa główną rolę w określaniu ich całkowitego czasu życia. Zgodnie z tym, komórki NP w nerkach późnych zarodków wykazują znacznie zmniejszone tempo proliferacji i przyspieszone różnicowanie, podczas gdy przeszczep starych komórek NP do nerek we wcześniejszym stadium wydłuża ich żywotność (Chen i wsp., 2015a). Na podstawie naszych wyników proponujemy, że GDNF przyczynia się do mechanizmu, dzięki któremu komórki NP wyczuwają swój wiek rozwojowy i ostatecznie długość życia. W prawidłowej nerce ekspresja GDNF jest wysoka na początku morfogenezy nerki i podczas fazy aktywnego wzrostu, podczas gdy wyraźny spadek poziomów GDNF występuje w późnych nerkach embrionalnych, co skutkuje utratą ekspresji we wczesnym stadium pourodzeniowym (ryc. 7 i 9) . Poziomy GDNF we wczesnych Gdnfhyper/hiper nerkach są nienormalnie wysokie, co wydaje się hamować proliferację komórek NP, prawdopodobnie z powodu wykrytych zmian komórkowych i molekularnych w zmutowanym UB, takich jak zmieniony szlak WNT

(Ryc. 7E, F; Ryc. S7A, B), który ma znany wpływ na biologię NPC (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Podobnie jak w przypadku nerek WT, poziomy mRNA Gdnf i białka GDNF zmniejszają się w pourodzeniowych nerkach hiper/hiper Gdnf, w których Gdnf jest manipulowany na poziomie potranskrypcyjnym, umożliwiając endogenną czasową regulację ekspresji (Kumar et al., 2015). Prawdopodobnie zmniejsza to ekspresję GDNF do poziomu, który pozwala na samoodnowę i różnicowanie komórek NP, które są wykrywane jako utrzymujący się program nefrogenny w nerkach pourodzeniowych (ryc. 9). Tak nowo rozpoznana plastyczność zależna od czynnika wzrostu w różnicowaniu nerek daje nadzieję na jej wykorzystanie w przyszłości w celach regeneracyjnych. Pierwsze wskazówki dotyczące możliwości wydłużenia okresu różnicowania nefronu pochodzą z eksperymentów hamujących BMP/

Ryc. 5. Utrzymująca się proliferacja korowa w nerkach poporodowych z przerostem gruczołu krokowego/przerostem nerek. (A, B) Barwienie Ki67 w nerkach P4 WT (A) i Gdnfhyper/hiper (B) wykazuje podobny wzór komórek proliferacyjnych w nerkach korowych (czerwone strzałki) obu genotypów. (C,D) W nerkach P5 WT (C) Ki67-dodatni jest znacznie zmniejszony w korze (czerwona strzałka), podczas gdy nerki Gdnfhyper/hiper (D) nadal wykazują ogniskowo bardzo wysoką proliferację (czerwone strzałki). (E, F) Proliferacja w korowej nerce WT (E) jest dalej zmniejszona w P6, podczas gdy pozostaje wysoce aktywna w Gdnfhyper/hiper nerki (F). (G,H) Ki67-dodatnie komórki proliferacyjne lokalizują się w rdzeniowych kanalikach nerkowych (czarna strzałka) w nerkach P7 WT (G), ale aktywna proliferacja jest nadal wykrywana w korowych, różnicujących się strukturach nefronowych (czerwone strzałki) przerostu/przerostu nerek (H). W każdym stadium poporodowym n=3 nerek/genotyp. Skala: 1 mm.

P7 tylko w Gdnfhyper/hiper nerkach. (A,B) Prekursorowy marker nefronu LEF1 (czerwony) w nerkach WT (A) i Gdnfhyper/hiper (B) w P4 wykazuje trwającą nefrogenezę w obu genotypach (strzałki) (n=2 nerki/genotyp). (C,D) P5 WT nerki (C) wykazują bardzo niewiele komórek LEF1-dodatnich w korze, podczas gdy obfita nefrogeneza jest wykrywana w Gdnfhyper/hiper nerki (D; strzałki; n=4 nerki/genotyp) . (E, F) LEF1 nie jest już obecny w korze nerek WT w P6 (E), podczas gdy liczne prekursory nefronu są nadal wykrywane w Gdnfhyper/hiper nerki (F) (n=3nerki/genotyp). (G) Cyklina D1 (biała) i JAG1 (czerwona) lokalizują się w zróżnicowanych kanalikach dystalnych nefronu (żółta strzałka i grot strzałki) w nerce P7 WT (n=3 nerkach). (H) W P7 Gdnfhyper/hiper nerki cyklina D1 i JAG1 lokalizują się w ciałach prekursorów nefronu w kształcie przecinka (grot strzałki) i S (strzałka) w korowej strefie różnicowania, wykazując tym samym trwałą nefrogenezę w tym późnym okresie poporodowym (n{ {19}} nerki). Słupki skali: 100 µm.

Sygnalizacja SMAD1/5, która doprowadziła do nieco większych nerek z większą liczbą nefronów niż w nerkach leczonych nośnikiem (Brown i wsp., 2015). Zmniejszona dawka Tsc1, kodującego inhibitor mTOR, utrzymuje komórki NP przez dodatkowy dzień, bez doniesień o wpływie na liczbę embrionalnych komórek NP (Volovelsky i wsp., 2018). Przedłużoną nefrogenezę obserwowano również u myszy z nadekspresją Lin28, Lin28b lub inaktywowanym Let-7 (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) (Urbach et al ., 2014; Yermalovich i wsp., 2019), które również wykazują bezpośrednią nowotworzenie lub aktywację loci Igf2 lub H19h związanych z nowotworem nerki u dzieci i młodzieży (Chen i wsp., 2018; Ogawa i wsp., 1993). Należy zauważyć, że nie wykryto zmian w lokalizacji lub poziomach pSMAD1/5 w nerkach Gdnfhyper/hiper, które są hipodysplastyczne i są zgodne z życiem przez trzy tygodnie.

Niniejsze badanie koncentruje się na charakterystyce funkcji GDNF w nefrogenezie, która została wcześniej zbadana poprzez zmniejszenie dawki endogennego Gdnf i skutkuje zmniejszeniem wyposażenia nefronowego (Cullen-McEwen i wsp., 2001, 2003). Kanoniczny kompleks receptorowy dla GDNF jest tworzony przez kinazę tyrozynową RET i jej koreceptor GFRa1, które są koeksprymowane wyłącznie w nabłonku UB (Costantini, 2012; Golden i wsp., 1999; Pachnis i wsp., 1993). . GDNF jest kluczowym czynnikiem niszowym dla komórek końcówek UB (Chi i wsp., 2009; Riccio i wsp., 2016; Shakya i wsp., 2005). Wcześniej wykazaliśmy, że nadmiar GDNF rozszerza gromadzącą pulę komórek progenitorowych kosztem wydłużenia tułowia moczowodu, co skutkuje rozszerzeniem fenotypu końcówki i krótkiego tułowia z powodu defektów ruchliwości komórek progenitorowych i skrócenia długości cyklu komórkowego (Li et al., 2019). Podczas stadiów embrionalnych połączony efekt nieprawidłowego

Ryc. 7. Analiza ekspresji kluczowych regulatorów rozwoju nerek. (A) Test hybrydyzacji in situ Gdnf w P4 nie jest w stanie wykryć żadnych transkryptów w nerce WT (nerki n=3). (B) Ekspresja Gdnf jest utrzymywana w P4 Gdnfhyper/nadnercza i lokalizuje się w korowej strefie różnicowania, w której utrzymywane są prekursory nefronu (czerwone strzałki) z powodu nadmiaru GDNF (n=3 nerek). (C) Analiza qRT-PCR transkryptów Gdnf w Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper i Gdnfhyper/hiper nerek w P7 (n=3nerki/genotyp). Ekspresja Gdnf w Gdnfhyper/hiper nerkach jest znacząco wyższa niż w WT (P=00,036) i Gdnfwt/ko (P=00,038) (średnia±sem, dwustronny test t w SPSS ). (D) Analiza ELISA poziomów białka GDNF w nerkach P7 (n=5nerki/genotyp) (średnia±sem). (E, F) kwantyfikacja oparta na qRT-PCR względnych poziomów ekspresji wybranych genów w E14 (E) i P5 (F) (n=3 nerki/genotyp na danym etapie). Wydzielone cele GDNF pochodzące z UB wymieniono powyżej linii przerywanej, podczas gdy inne znane regulatory nefrogenezy przedstawiono poniżej linii. Gdnfhyper/hipernerki wykazują znaczną regulację w górę Crlf1 (*P=00,019), Srgn (*P=00,021), Wnt11 (**P=0.001) i Wnt9b ( **P=0.01) w E14, podczas gdy w P5, znacznie zwiększona ekspresja genów obejmuje Crlf1 (**P{=0.009), Etv4 (**P=0.{{ 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P{=0.014) i Wnt4 (*P=00.026). W przeciwieństwie do tego transkrypcja Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) i Fgf20 (**P=0.001 ) jest znacznie obniżony w Gdnfhyper/hiper nerki w P5. Skala: 100 µm.

wysoki GDNF, zmiany biofizyczne wywołane anomalną morfologią końcówki UB i powiązane zmiany molekularne w docelowych GDNF i szlaku WNT wydają się wspólnie popychać komórki NP w kierunku zmniejszonej proliferacji. Pokazujemy tutaj, że poszerzona morfologia końcówki UB poprawia się z czasem, ale utrzymuje się w łagodnych formach do P4 w poporodowych nerkach hipernerwu/hiper (ryc. 5). Komórki końcówki UB są nadal molekularnie obecne w nerkach P5 Gdnfhyper/hiper, które wyrażają wysoki poziom regulowanych przez GDNF markerów końcówki Crlf1, Etv4, Etv5 i Lama1, kanoniczne cele WNT wyrażane przez NPC Cited1 i Uncx4.1, jak również agonistę WNT R -spondin1 (ryc. 7E, F; ryc. S7A, B) (Karner i in., 2011; Lu i in., 2009; Vidal i in., 2020). Takie zmiany molekularne w poporodowym UB prawdopodobnie zapewniają zatem sprzyjające środowisko dla trwałej samoodnowy NP poza P2/P3. Zidentyfikowaliśmy pochodzące z UB wydzielone CRLF1 i WNT11 jako cele GDNF, które wraz z rozszerzonym kanonicznym WNT

sygnalizacja, dodatkowo wzmocniona przez zwiększoną ekspresję Wnt9b, pośredniczy w jego wpływie na regulację NP. Nasze dane wskazują również, że funkcja CRLF1 jest zbędna w stosunku do innych cytokin, ponieważ jej inaktywacja nie wpływa na różnicowanie nerek. Zarówno WNT9b, jak i WNT11 regulują wiele aspektów NPC i nefrogenezy (Carroll i wsp., 2005; Karner i wsp., 2011; Majumdar i wsp., 2003; Nagy i wsp., 2016; O'Brien i wsp., 2018). Regulacja w górę Wnt9b wyrażanego przez UB, o którym wiadomo, że reguluje wiele aspektów nefrogenezy, w Gdnfhyper/hiper nerkach może naśladować jego wymuszoną ekspresję w NP, co zaburza ich utrzymanie w stosunku do równowagi różnicowania (Kiefer et al., 2012), a tym samym przyczynia się mechanistycznie do niezrównoważonej samoodnowy NP w Gdnfhyper/hiper nefrogenezie. Potwierdza to ulepszona morfologia końcówki po kanonicznym hamowaniu WNT przez IWR1 w całych nerkach, w których występuje nadmiar GDNF.

Tabela 2. Wydzielane geny docelowe GDNF mogące wpływać na program nefrogenny

Nasze wyniki pokazują, że samo hamowanie IWR1 ma duży wpływ na NPC, które są rozproszone i luźno przylegają do końcówek UB. Kanoniczne hamowanie WNT w samych NPC prawdopodobnie przyczynia się do niepowodzenia wzmocnienia ich fenotypu w obecności nadmiaru GDNF. Potwierdzają to nasze eksperymenty genetyczne, w których obniżenie ekspresji Wnt11 wyrażanego przez UB w tle Gdnfhyper/hiper poprawiło utrzymanie i różnicowanie NP, ale nie udało się w pełni uratować hipoplazji nerek spowodowanej nadmiarem GDNF. Może to przynajmniej częściowo wynikać z niepowodzenia inaktywacji obu alleli Wnt11 na tle Gdnfhyper/hyper z powodu śmiertelności embrionalnej Wnt11-/- (Nagy i wsp., 2016). Tak więc, jeden pozostały allel Wnt11 może nawet zwiększyć kaskadę GDNF, jak sugerowano wcześniej (Majumdar i wsp., 2003), a zatem częściowo zabraniać pełnego ratowania nefrogenezy. Nasze obecne badanie nie może wykluczyć możliwości, że niektóre wpływy GDNF na NP wynikają z niekanonicznej sygnalizacji GDNF, ponieważ jego potencjalne alternatywne receptory sygnałowe są wyrażane przez NP (Brodbeck i wsp., 2004; Enomoto i wsp., 2004; Keefe Davis i wsp., 2013; Paratcha i wsp., 2003). Jednak zarówno delecja NCAM, jak i ekspresja Gfra1 tylko w UB (poprzez umieszczenie go pod kontrolą promotora Ret) utrzymują normalny fenotyp nerek (Cremer i wsp., 1994; Heuckeroth i wsp., 1999; Keefe Davis i wsp., 2013; Rossi i wsp., 1999; Sariola i Saarma, 2003). Sugeruje to, że, przynajmniej same w sobie, ani NCAM, ani GFRa1 nie są niezbędne dla programu nefrogennego. Podsumowując, nasze eksperymenty sugerują, że GDNF, który był i jest obecnie w badaniach klinicznych dotyczących choroby Parkinsona (Kirkeby i Barker, 2019), może potencjalnie służyć jako prospektywny sposób na poprawę wyposażenia nefronowego w przyszłości. Potrzebne są dodatkowe eksperymenty, aby zidentyfikować możliwe sposoby nadmiernej aktywacji sygnalizacji GDNF bez szkodliwego wpływu na wzrost nerek

MATERIAŁY I METODY

Zwierząt

Protokoły dotyczące opieki nad zwierzętami i badania zostały przeprowadzone zgodnie z Kodeksem Etycznego Postępowania w Eksperymentach na Zwierzętach oraz dyrektywami Unii Europejskiej (Dyrektywa 2010/UE/63) i zostały zatwierdzone przez Krajową Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach Finlandii. Myszy trzymano w indywidualnie wentylowanych klatkach z pożywieniem i wodą ad libitum. W certyfikowanym Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Helsińskiego stale zapewniano optymalne nawilżanie i ogrzewanie. Generowanie i genotypowanie mysich modeli Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) i Fgf9;20 (Barak et al., 2012) zostało opisane wcześniej. Gdnfhyper;Wnt11− szczenięta pochodzą z krzyżówek C57BL6 Wnt11−

Tabela 3. Zestawienie genotypów potomstwa z krzyżówek Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /−

(Nagy et al., 2016) i linii Gdnfhyper i zostały genotypowane zgodnie z wcześniejszym opisem (Kumar et al., 2015; Nagy et al., 2016 ). Wszystkie linie myszy stosowane w badaniach utrzymywano na potrójnym mieszanym tle 129Ola/ICR/C57bl6. Pokolenie myszy z nokautem Crlf zostało opisane wcześniej (Alexander i wsp., 1999). Genotypowanie PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu starterów neo-specyficznych (5′-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′ i 5′-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3′) wraz z zestawami starterów specyficznych dla genu dla Crlf1 (5′-GCCTAATAGGTGCTGGGTGA{{ 18}}′ i 5′-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). Pobieranie tkanek Zarodki sklasyfikowano zgodnie z opisanymi wcześniej kryteriami Theilera (1989) (Kuure et al., 2005) i pobrano po zwichnięciu szyjki macicy ciężarnych samic w głębokim znieczuleniu CO2. Późne embrionalne i postnatalne młode uśmiercono przez dekapitację. Tkankę rozcięto w pożywce Dulbecco uzupełnionej 0,2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), a następnie utrwalono 4% paraformaldehydem (PFA) lub hodowlą narządów. Hodowla narządów Nerki wyizolowane z zarodków myszy E11.5 i E12.5 umieszczono na granicy powietrze-ciecz podtrzymywanej przez system membran poliestrowych Transwell® (Costar) i hodowano w temperaturze 37 stopni w wilgotnej atmosferze 5% CO2 z pożywką do hodowli nerek [F12 :DMEM (1:1) plus Glutamax (Gibco)] uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i penicyliną-streptomycyną (Ihermann-Hella i Kuure, 2019). W hodowli in vitro z 100 ng/ml egzogennego GDNF (ProSpec Ltd) (Sainio i wsp., 1997) mającej na celu ocenę ilościową NPC, każdy blok układu moczowo-płciowego zawierający metanerce, ostateczny zaczątek nerki, był dzielony wzdłuż linii środkowej brzusznej. Połowa każdej próbki była hodowana z egzogennym GDNF, podczas gdy druga połowa służyła jako kontrola. Eksperymenty z hamowaniem WNT były najpierw testowane z 50-100 ng/ml GDNF i 50-100 µM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich). W oparciu o te eksperymenty z zależnością od dawki, optymalne stężenia wynosiły 50 ng/ml GDNF i 75 µM IWR1. Histologia i barwienie immunologiczne W badaniach nad interesującym markerem na skrawkach parafinowych, nerki wycinano z zarodków lub młodych ze wskazanych stadiów, a następnie poddano obróbce tkanki i pocięto na skrawki, jak opisano wcześniej (Li et al., 2019). W każdej analizie wykorzystano co najmniej pięć skrawków z każdej nerki i trzy do pięciu różnych nerek na genotyp. Dokładne numery próbek znajdują się w legendach rysunków. Hematoksylina i eozyna (H&E) oraz immunohistochemia przeprowadzone na skrawkach parafinowych zostały ukończone zgodnie z wcześniejszym opisem (Li i wsp., 2019). W skrócie, wypreparowaną tkankę utrwalano przez noc 4% PFA (pH 7,4), a następnie odwadniano i parafinowano automatycznym procesorem tkanek (Leica ASP 200). Przygotowano skrawki o grubości 5 µm i odparafinowano w ksylenie, a następnie ponownie uwodniono przed barwieniem Harris H&E lub indukowanym ciepłem odzyskiwaniem antygenu w buforze do odzyskiwania antygenu (10 mM cytrynian; pH 6,0). Do barwienia immunologicznego zastosowano 3% BSA do blokowania (1 godz. w temperaturze pokojowej), a następnie 30 min 0,5% nadtlenkiem wodoru do barwienia chromogenicznego. Skrawki następnie inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze plus 4°C, po czym inkubowano przeciwciała drugorzędowe specyficzne dla gatunku przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Wykrywanie chromogeniczne zostało wdrożone za pomocą zestawu EnVision Detection System-HRP (DAB) (Dako).

Ryc. 8. Genetyczny spadek poziomu Wnt11 częściowo ratuje utratę progenitora nefronu w Gdnfhyper/hiper nerkach. (A) SZEŚĆ2-dodatnich progenitorów nefronu (NP, czerwony) występuje rzadko w nerkach E14.5 Gdnfhyper/hiper (średnio 29,8 NP/końcówkę w 552 końcówkach analizowanych w dziewięciu nerkach). (B) Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /− nerki wykazują wzrost ogólnej liczebności NP w niszy przy braku jednego allelu Wnt11 (średnio 40.7 NP/końcówkę w 107 końcówkach analizowanych w czterech nerkach ). (C,D) PAX2-dodatnie komórki w nerkach Gdnfhyper/hyper (C) i Gdnfhyper/hiper;Wnt11 plus /− (D) wykazują podobne wzorce i ilość w E14.5. (EH) W P0 barwienie SIX2 wykazuje poprawę liczby NP poprzez usunięcie jednego allelu Wnt11 (średnio 20,3 NP/końcówkę w 610 Gdnfhyper/hiper końcówkach w porównaniu ze średnią 30,9 NP/końcówkę w Gdnfhyper/hiper; Wnt11 plus /− końcówki analizowane w sześciu nerkach/genotypie), co potwierdza barwienie PAX2. Pokazano dystrybucję SZEŚCIU2-dodatnich NP (A′,B′,E′,F′) i PAX2- dodatnich (C′,D′,G′,H′) bez kalbindyny ( zielony) sygnał, który przedstawia nabłonek UB we wszystkich nerkach. Pręty skali: 200 µm.

Nerki E11.5 i E12.5 poddane barwieniu immunofluorescencyjnemu metodą pełnowartościową utrwalono i permeabilizowano 100 procentowym lodowatym metanolem przez 10 minut przed całonocną inkubacją z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Inkubację z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi specyficznymi gatunkowo przeprowadzono drugiego dnia po energicznym przemyciu PBST (0,1% Tween 20 w PBS). Szczegóły dotyczące pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał stosowanych w niniejszym badaniu są wymienione w Tabeli S1. Hybrydyzacja in situ Hybrydyzacja in situ została przeprowadzona jak opisano wcześniej (Ihermann Hella et al., 2014). W skrócie, sonda antysensownego RNA przeciwko eksonom Gdnf została przepisana i zhybrydyzowana na grubych skrawkach pochodzących z nerek P4 (10-15 skrawki/nerka, n=3 nerek/genotyp) osadzonych w 4% niskotopliwej agarozie (NuSieve GTG, Lonza). Do reakcji kolorymetrycznej użyto BM Purple

ELISA Poziomy białka GDNF w nerkach P7.5 mierzono za pomocą testu ELISA, jak opisano wcześniej (Kumar i wsp., 2015). Test immunologiczny GDNF Emax® (Promega) zastosowano z traktowaniem kwasem podczas przeprowadzania testu ELISA. Szczegółowo, dla każdego genotypu trzy nerki poddano lizie natychmiast po wycięciu. Po zmierzeniu stężenia białka za pomocą testu białka DC (Bio-Rad), do studzienki na płytce ELISA wprowadzono 25 µg całkowitego białka. Każdą próbkę analizowano w dwóch powtórzeniach.

Obrazowanie Immunobarwienie i hybrydyzacja in situ na przekrojach obrazowano za pomocą aparatu Zeiss AxioImager wyposażonego w źródło światła fluorescencyjnego HXP 120V, kamerę Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT B&W oraz kamerę kolorową Zeiss AxioCam 105 , lub z Leica DM5000B wyposażonym w metalohalogenkowe źródło światła Leica EL 6000 i kamerę Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS. Barwienie immunofluorescencyjne na całej powierzchni obrazowano przy użyciu aparatu Zeiss AxioImager z aplikacją Zeiss ApoTome. Obrazowanie całego mocowania dla pomiarów wielkości nienaruszonej nerki przeprowadzono przy użyciu aparatu Leica MZFLIII wyposażonego w kamerę Leica DFC7000T. Analizy ilościowe oparte na barwieniu immunologicznym i obrazowaniu Ilościową ocenę gęstości kłębuszków obliczono z kolejnych przekrojów nerek E18.5 i P7. Nerki pocięto na skrawki i skrawki do oceny ilościowej kłębuszków pobierano co 125 µm, aby uniknąć liczby powtórzeń kłębuszków. Liczbę kłębuszków w każdym skrawku zliczono ręcznie, a obszar każdej nerki zmierzono za pomocą oprogramowania Fiji ImageJ (V1.51) poprzez ręczne nakreślenie konturu. Aby obliczyć gęstość kłębuszków, całkowita liczba kłębuszków

Fig. 9. Schemat wpływu nadmiaru GDNF na rozwijające się nerki myszy. (A) W nerkach embrionów przechodzących aktywny wzrost, komórki progenitorowe nefronu (NPC, czerwone) otrzymują wydzielone sygnały naprowadzające (np. Wnt11 i Wnt9b) z końcówek pączków moczowodowych (UBT, ciemnoniebieski), aby kontrolować równowagę proliferacji NP i samoodnowy i ich różnicowanie w agregaty okołokanalikowe (PA, różowe skupisko komórek). (B) W nerkach poporodowych, tożsamość końcówki UB (UB, jasnoniebieski) jest tracona, czego dowodem molekularnym jest spadek ekspresji np. Wnt9b, Wnt11, Crlf1 i Etv4/5, wskazany cienkimi czerwonymi literami. Stopniowa utrata wydzielanych czynników pochodzących z UB (Wnt9b, Wnt11 i Crlf1) przyczynia się do zaniku proliferacji NP i samoodnowy. Jednocześnie spadają poziomy GDNF i FGF, co zbiega się z przyspieszonym różnicowaniem NP. Te razem szybko wyczerpują pulę NP, powodując ustanie nefrogenezy. (C) Nadmiar GDNF w nerkach embrionów indukuje nieprawidłową morfologię UBT i zwiększa ekspresję pochodzących z pąków wydzielanych cząsteczek regulatorowych (Crlf1, Sign, Wnt11 i Wnt9b). Nadmierna ekspresja wydzielanych cząsteczek pochodzących z pąków ma hamujący wpływ na cykl komórkowy NP, powodując zmniejszoną proliferację i samoodnowę. Spadek ogólnej liczby NP spowalnia różnicowanie PA, co wykryto przez zmniejszoną ekspresję Wnt4. (D) W nerkach pourodzeniowych morfologia UBT, a tym samym nisza, którą zapewnia NPS, normalizuje się pomimo wyższej niż WT ekspresji wydzielanych celów pochodzących z pączków (Crlf1, Etv4/5 i Lama1). Wraz ze znormalizowanymi Wnt9b i Wnt11 (nie pokazano), te zmiany molekularne subsydiują normalną proliferację NP, samoodnowę i różnicowanie, o czym świadczy utrzymywanie dużej populacji NP, wyższa ekspresja Wnt4 i podobna ilość prekursorów nefronów (różowe skupiska komórek) jak w nerkach embrionalnych WT. Dzięki takim mechanizmom konstytutywny nadmiar GDNF pod własnym promotorem umożliwia kontynuację programu nefrogennego aż do P7. Ciemnoszary tekst, niezmienione wyrażenie; czerwony tekst, zmniejszona ekspresja; zielony tekst, zwiększona ekspresja.

a liczbę kłębuszków w korze policzono oddzielnie. Następnie dla każdej próbki obliczono średnią całkowitą powierzchnię nerek oraz całkowitą liczbę kłębków nerkowych i korowych. Średnią gęstość kłębuszków obliczono dzieląc średnią liczbę kłębuszków przez średni zmierzony obszar. Średnią liczbę kłębuszków korowych w całym przeciętnym obszarze obliczono dzieląc średnią liczbę kłębuszków korowych przez średni zmierzony całkowity obszar. Zarejestrowano tylko kłębuszki o nienaruszonych kształtach. Kwantyfikacja całkowitej liczby SZEŚĆ2-dodatnich NPS przy E11.5 (n=4 dla WT, n=5 dla Gdnfhyper/hiper) i E12.5 (n=10 nerek/ leczenia, trzy niezależne eksperymenty) oparto na barwieniu immunofluorescencyjnym na całej powierzchni. Obrazy zostały zrobione za pomocą aplikacji Zeiss ApoTome, a następnie przetworzone za pomocą oprogramowania Imaris (Bitplane) przy użyciu śledzenia punktowego. Wszystkie obrazy zostały przetworzone według identycznych protokołów analizy. W celu normalizacji zmienności między miotami, średnią ilość SZEŚĆ2-dodatnich NP w nerkach WT w każdym miocie ustalono na 100 procent, a ilość SZEŚĆ2-dodatnich NP w Gdnfhyper /hiper nerki porównano ze średnią ilością w nerkach WT w miocie. Indeks mitotyczny SIX2-dodatnich NPS w nerkach E12.5 (n=10nerki/leczenie, trzy niezależne eksperymenty) hodowanych z egzogennym GDNF obliczono w podobny sposób, aby znormalizować zmienność między miotami.

Średni odsetek proliferujących SIX{{0}}dodatnich NP w nerkach WT i nerkach hodowanych bez egzogennego GNDF w każdym miocie ustalono na 100 procent, a odsetek proliferujących SIX{{2 }}dodatnie NP w obecności nadmiaru GDNF (Gdnfhyper/hiper nerki i aplikacja egzogenna) z tego samego miotu wykreślono na rycinie po porównaniu z osobnikami z miotu WT. Indeks mitotyczny SIX2-dodatnich NPS w nerkach E11.5 hodowanych z egzogennym GDNF wykreślono jako oryginalne dane/wartość. Obliczenie średniej SIX2-dodatnich NPS na niszę nefrogenną (E14.5 i P0) oraz nisze nefrogenne z progenitorami (P3-P6) przeprowadzono metodą barwienia immunofluorescencyjnego w skrawkach parafinowych. Liczbę SZEŚĆ2-dodatnich NPS zliczono za pomocą oprogramowania Fiji ImageJ (V1.51) na każdym skrawku wybranym do analizy przy użyciu analizy cząstek, a liczbę końcówek zliczono ręcznie na odpowiednich skrawkach. Liczba analizowanych próbek w E14.5 to trzy nerki dla WT i Gdnfhyper/hiper i dwie nerki dla Gdnfhyper/hiper; Wnt11 plus /−. Liczba końcówek przeanalizowanych w E14.5 wyniosła 207 w WT, 431 w Gdnfhyper/hyper i 107 dla Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plus /− nerki. Liczba analizowanych próbek w P0 wynosiła trzy nerki na genotyp, a liczba analizowanych końcówek, która jest przedstawiona na odpowiednich rysunkach, waha się od 10 do 315, przy czym najniższa jest w nerkach WT P6, w których końcówki są rzadko obecne. Pomiary końcówki UB przeprowadzono przy użyciu programu LAS X systemu operacyjnego mikroskopu Leica po 48 h hodowli w obecności określonych związków chemicznych i wizualizacji końcówek z przeciwciałem przeciwko E-kadherynie (Tabela S1). Końcówki mierzono z sześciu nerek w każdych warunkach w dwóch niezależnych zestawach doświadczeń, w których liczba zmierzonych końcówek wynosiła: 101 dla GDNF, 131 dla IWR1 i 115 dla 75 µM IWR1 plus 50 ng/ml GDNF. Pomiary wielkości nerki w eksperymentach oceniających wpływ delecji Wnt11 na Gdnfhyper/hiper tło przeprowadzono za pomocą oprogramowania Fiji ImageJ (V1.51) na całych obrazach poprzez ręczne śledzenie konturu nerki. Analiza statystyczna Wszystkie wartości są przedstawione jako średnia±sem z wyjątkiem analizy głównych efektów Gdnf i Wnt11 na wielkość nerek, która jest przedstawiona jako średnia±sd Istotność statystyczną ustalono na P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Podziękowania Dziękujemy pracownikom Zakładu Obrazowania i Mikroskopii Światła Biomedicum w Helsińskim Instytucie Nauk Przyrodniczych (HiLIFE) za cenną pomoc w analizie obrazów i technikach związanych z kwantyfikacją. Myszy Wnt11 zostały dostarczone przez profesora Seppo Vainio (Uniwersytet Oulu, Finlandia) i wysłane do Laboratoryjnego Centrum Zwierząt HiLIFE na Uniwersytecie w Helsinkach