Odkrycie i identyfikacja potencjalnych przeciwmelanogennych aktywnych składników Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 i Hongjiang Chen1,2*

Abstrakcyjny

Tło:Bletilla striata jest głównym lekiem wielu klasycznych formuł wybielających skórę w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM) i jest ostatnio szeroko stosowana w przemyśle kosmetycznym. Jednak jego aktywne składniki są nadal niejasne, a włókniste korzenie nie są skutecznie wykorzystywane. Celem niniejszego badania jest odkrycie i identyfikacja jego potencjalnych przeciwmelanogennych składników aktywnych za pomocą modelu danio pręgowanego i dokowania molekularnego.

Metody:Theprzeciwutleniaczaktywność oceniano za pomocą 2,2-difenylu-1-pikrylohydrazylu (DPPH) wymiatania rodników, 2,2′-azyno-bis-(3-etylobentiazolino-6-kwas sulfonowy) (ABTS ) działanie wymiatające rodniki i redukujące żelazoprzeciwutleniacztest mocy (FRAP). Aktywność przeciwmelanogenną oceniono przeztyrozynazahamującydziałalnośćin vitro i hamowanie melaniny u danio pręgowanego. Profile chemiczne wykonano za pomocą ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej z kwadrupolową tandemową spektrometrią mas z czasem przelotu (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Tymczasem potencjalne składniki aktywne przeciw melanogennie zostały tymczasowo zidentyfikowane przez dokowanie molekularne.

Wyniki:95-procentowy ekstrakt etanolowy z korzeni włóknistych B. striata (EFB) wykazywał najsilniejsze działanie hamujące DPPH, ABTS, FRAP i tyrozynazę, z IC50 5.94 mg/L, 11.69 mg/L, 6.92 mmol FeSO4/g, i odpowiednio 58,92 mg/l. Dodatkowo, EFB i 95-procentowy etanolowy ekstrakt z bulw B. striata (ETB) znacznie zmniejszyły syntezę melaniny zarodków danio pręgowanego w sposób zależny od dawki. 39 składów chemicznych, w tym 24 stilbenoidy, wstępnie zidentyfikowano z EFB i ETB. Dokowanie molekularne wykazało, że 83 (w tym 60 stilbenoidów) i 85 (w tym 70 stilbenoidów) związków wykazywało silniejsze powinowactwo wiązania z tyrozynazą i cyklazą adenylanową.

Wniosek:Obecne odkrycia potwierdziły zasadność stosowania EFB i ETB jako naturalnych środków wybielających skórę w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym.

Słowa kluczowe: Bletilla striata, Przeciwutleniacz, Aktywność przeciwmelanogenna, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Danio pręgowany, Dokowanie molekularne

Kliknij, aby uzyskać efekty uboczne i korzyści dla przeciwutleniaczy

Tło

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. to wieloletnia roślina zielna szeroko rozpowszechniona w Azji, m.in. w Chinach, Korei i Japonii [1]. Suszona bulwa B. striata, znana również jako Baiji, po raz pierwszy odnotowana w „Classic of Materia Medica” Shennong, od tysięcy lat jest szeroko stosowana jako tradycyjna medycyna chińska (TCM) w Chinach. W chińskich farmakopeach podaje się, że ma on właściwości ściągające przy hemostazie i analgezie, dlatego był szeroko stosowany w leczeniu krwawych wymiotów, krwioplucia, krwawień pourazowych, owrzodzeń, obrzęku i popękanej skóry [2, 3]. Badania farmakologiczne wykazały, że B. striata posiada szerokie spektrum aktywności biologicznej, takie jak gojenie ran [4, 5], przeciwwrzodowe [6, 7], hemostatyczne [8],anty-zapalenie[9], przeciwutleniacz[10], przeciwbakteryjne [11], przeciwwirusowe [12], przeciwstarzeniowe [13]. Jednocześnie B. striata zawiera różne klasy składów chemicznych, w tympolisacharydy[14], bibenzyle, fenantreny, antrachinony,flawonoidyoraz 2-jabłczany izobutylu [3, 15] itd.

B. striata jest głównym lekiem wielu klasycznych preparatów wybielających skórę w TCM [16] i jest ostatnio szeroko stosowana w przemyśle kosmetycznym [17]. Jednak jego aktywne składniki są nadal niejasne, a nawet niektóre wyniki badań były sprzeczne. Na przykład wyniki badań podane przez Chenet al. wykazali, że 95-procentowy ekstrakt etanolowy z B. striata wykazywał wyższą aktywność hamującą tyrozynazę niż ekstrakt z jej ekstraktu wodnego ze wskaźnikiem hamowania 68,36 procent in vitro[18], podczas gdy wynik Huang et al. wykazali, że aktywność hamująca wyciągu wodnego z B. striata na tyrozynazę była silniejsza niż 95% ekstraktu etanolowego przy wskaźniku in vitro 62% [19]. Wyniki badań Luetala.[20] i Linghuetala.[21] wykazały, że zarówno woda, jak i 95-procentowy ekstrakt etanolowy z B. striata, zwłaszcza frakcjonowanie chloroformem, mogą hamować wzrost komórek B16 i indukować ich apoptozę w sposób zależny od stężenia.

Ponieważ testy in vitro hamowania tyrozynazy i linii komórkowych czerniaka nie obejmowały złożonych warunków fizjologicznych in vivo oraz wchłaniania, metabolizmu, dystrybucji i wydalania próbki testowej, wiele próbek wykazało znaczące działanie hamujące przeciwko liniom komórkowym tyrozynazy i czerniaka w in vitro wykazywały jednak słabo skuteczne lub wręcz nieskuteczne in vivo [22, 23]. Glabrydyna wykazała znaczącą aktywność hamującą tyrozynazę z IC50 0.43 μmol/L, która była 176 razy silniejsza niż kwas kojowy. Niemniej jednak nie miał wpływu hamującego na pigmentację danio pręgowanego in vivo [24].

Tymczasem włókniste korzenie B. striata (FB) były produktami ubocznymi powstającymi podczas przetwarzania B. striatatuber (TB). Współczesne badania wskazują, że FB zawiera podobne związki z gruźlicą io wyższej zawartości fenoli [25]. Ponadto działanie przeciwbakteryjne [26], przeciwutleniające i antytyrozynazowe ekstraktu FB było silniejsze niż ekstraktu gruźlicy [25]. Jednak zasoby FB nie były efektywnie wykorzystywane i zostały porzucone na gruntach rolnych, co doprowadziło do marnotrawstwa FBresources i zanieczyszczenia środowiska [27].

Danio pręgowany (Danio rerio), mała tropikalna ryba słodkowodna, to nowy model zwierzęcy dla farmakologii

i badania toksykologiczne in vivo, z wieloma zaletami, w tym niskim kosztem, krótkim cyklem życia, wysoką przejrzystością, łatwością w utrzymaniu, wysoką płodnością i wymaganiem mniejszej liczby próbek [28, 29]. Ponadto danio pręgowany ma na powierzchni barwniki melaninowe, co pozwala na prostą obserwację procesu pigmentacji i był szeroko stosowany w badaniach antymelanogenicznych [28, 30].

W niniejszym badaniu porównaliśmy aktywność przeciwutleniającą i hamującą tyrozynazę surowego polisacharydu i 95-procentowego etanolowego ekstraktu gruźlicy i FB in vitro oraz aktywności przeciw melanogeniczne w modelu danio pręgowanego. W międzyczasie potencjalne przeciwmelanogenne składniki aktywne zostały tymczasowo zidentyfikowane przez dokowanie molekularne. Odkryliśmy, że 95-procentowy etanolowy ekstrakt z gruźlicy (ETB) i FB (EFB) ma znaczące działanie przeciwutleniające i antytyrozynazowe oraz może zmniejszać syntezę melaniny w zarodkach danio pręgowanego w sposób zależny od dawki. Tak więc ETB i EFB mogą być stosowane jako naturalne środki wybielające skórę w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym.

Metody

Chemikalia i odczynniki

Tyrozynazę, 3-(3,4-dihydroksyfenylo)-L-alaninę(L-DOPA) i arbutynę zakupiono od firmy odczynnikowej Aladdin (Szanghaj, Chiny).2,2-difenyl{{8 }}pikrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azyno-bis-(3-etylobentiazolina-6-kwas sulfonowy) (ABTS),6-hydroksy-2,5,7 ,8-Tetrametylochromano-2-kwas karboksylowy (Trolox) i 2,4,6-tris (2-pirydylo)-s-triazyna (TPTZ) zostały zakupione od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acetonitryl i metanol (klasa HPLC) zakupiono z Tedia (Fairfield, OH, USA). Woda dejonizowana została przygotowana przez system wodny Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, USA).

Procedura zbierania i ekstrakcji roślin

B. striata pobrano z Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Chiny). Próbki kuponów zostały zdeponowane w Herbarium Zhejiang Pharmaceutical College (nr dostępu 190615). Całą roślinę podzielono na bulwy i korzenie włókniste. Następnie pocięto je na małe kawałki i odpowiednio suszono przez liofilizację próżniową.

Wysuszone i sproszkowane próbki (TB i FB) trzykrotnie wyekstrahowano pod chłodnicą zwrotną 95 procentowym etanolem (każdorazowo po 1,5 godziny). Ekstrakt przefiltrowano za pomocą bibuły filtracyjnej What man (nr 1). Przesącz zatężono do sucha w wyparce obrotowej (Hei-VAP, Heidolph, Niemcy) w temperaturze 50 stopni i następnie wysuszono za pomocą liofilizatora próżniowego. Wydajność ekstrakcji etanolem TB (ETB) i FB (EFB) wyniosła odpowiednio 5,21 i 6,53 procent. Osady wykorzystano do ekstrakcji surowego polisacharydu przez zdyspergowanie w wodzie o temperaturze 80 stopni przez 4 godziny i wytrącenie etanolem [31]. Wydajności polisacharydów TB (PTB) i FB (PFB) wynosiły odpowiednio 14,75 i 6,45 procent.

ekstrakt z cistanche

Analiza chemiczna

Analizę chemiczną przeprowadzono na ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej z kwadrupolową tandemową spektrometrią mas z czasem przelotu (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na urządzeniu Waters Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, US) z kolumną WatersBEH Shield RP C18 (100×2,1 mm, 1,7 μm) przy 3{ {43}} stopień . Faza ruchoma składała się z 0,1% mrówkokwasu w wodzie (A) i acetonitrylu (B), z liniowym gradientem: 0–3 min, 5–16% B; 3–8 min, 16–30 procent B; 8-10 min, 30-35% B; 10-15 min, 35-55% B; 15–18 min, 55–80% B;18–19 min, 80–5% B; 19-20 min, 5% B. Szybkość przepływu wynosiła 0,3 ml/min, a objętość iniekcji 2 µl.

Eksperymenty TOF-MS/MS przeprowadzono przy użyciu spektrometrii masowej AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) wyposażonej w jonizację elektrorozpylaniem (ESI). Detekcję MS przeprowadzono metodą jonizacji ujemnej. Parametry zostały ustawione w następujący sposób: temperatura źródła i desolwatacji wynosiły odpowiednio 100 stopni i 450 stopni; szybkość przepływu gazu desolwatacyjnego wynosiła 900 l/h; napięcie kapilarne wynosiło 2kV; napięcie stożka wynosiło 40 V; energia zderzenia wynosiła 22 eV; a pełne widmo skanu wynosiło od 100 do 2000 Da.

Testy antyoksydacyjne Aktywność wymiatania rodników DPPH

Aktywność zmiatania rodników DPPH określono zgodnie z Ali et al. z niewielkimi modyfikacjami [32]. Krótko, 50 µL roztworu próbki testowej zmieszano z 150 µLDPPH roztworem etanolu (0,2 mM) w płytkach z 96-studzienkami i trzymano w ciemności przez 30 min . Absorbancję mieszaniny przy 517 nm (A1) oceniano za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego (Thermo Fisher Scientific, Ameryka). Ślepy roztwór bez badanej próbki zmieszany z roztworem DPPHetanol został ustawiony jako grupa pozytywna (A0). Ślepy roztwór bez DPPH zmieszany z badanym roztworem próbki został ustawiony jako ślepa grupa (A2). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Współczynnik zmiatania rodników DPPH obliczono z następującego wzoru:

Współczynnik wychwytywania rodników DPPH (procent) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 procent .

Aktywność radykalnego wymiatania ABTS

Zdolność wymiatania rodników ABTS zmierzono metodą opisaną przez Ali et al. [32]. W skrócie, wodny roztwór 7mMABST zmieszano z 2,45mM nadsiarczanem potasu w stosunku 1:1 (obj./obj.) i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 16 godzin w celu uzyskania roztworu podstawowego ABST plus. Roztwór podstawowy rozcieńczono solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) w celu dostosowania absorbancji (0.72±0.2) przy 734 nm. Próbki o objętości 20 μl w różnych stężeniach zostały dokładnie wymieszane z 180 μl roztworu ABTS plus. Mieszaniny reaktywne trzymano w ciemności przez 5 minut, a następnie zmierzono absorbancję (B1) przy 734 nm. Absorbancję mieszanin bez badanej próbki i ABST plus ustalono odpowiednio jako B i B . Wszystkie eksperymenty wykonano w trzech powtórzeniach. Szybkość zmiatania rodników ABTS obliczono według następującego wzoru:

Wskaźnik wymiatania rodników ABTS (procent) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 procent.

Test siły antyoksydacyjnej redukującej żelazo (FRAP)

Aktywność redukującą żelazo oznaczono zgodnie z procedurami Kosakowskiej i in. [33]. 300mM bufor octanowy, 10mM TPTZ (2,4,6-tris (2-pirydylo)-s-triazyna) i 20mM FeCl3 zmieszano w (v/v/v) stosunek 10:1:1 do przygotowania odczynnika roboczego. 100 μl każdej próbki testowej roztwór zmieszano ze 100 μl odczynnika roboczego TPTZ, inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 20 min i oznaczono absorbancję przy 593 nm. Tymczasem do sporządzenia krzywej kalibracyjnej wykorzystano szereg roztworów wzorcowych FeSO4 w zakresie stężeń 0–1000ug/mL. Zdolność redukującą żelaza obliczono dla tworzenia intensywnego kompleksu Fe2 plus -TPTZ blue. Wyniki wyrażono jako Fe2 plus pojemność antyoksydacyjna (mmol FeSO4/g ekstraktu).

Aktywność hamująca tyrozynazę

Aktywność hamującą tyrozynazę określono metodą spektrofotometryczną z użyciem L-DOPA jako substratu [34]. Krótko, 50 μl roztworów próbek w różnych stężeniach zmieszano z 50 μl tyrozynazy (200 jednostek/ml, rozpuszczony w buforze fosforanowym o pH 6,8) w 96-studzience płytki i inkubować przez 15 min w 25 stopniach . Reakcję następnie rozpoczęto przez dodanie L-DOPA (50 µl). Po inkubacji przez 30 min w 25°, absorbancję przy 490 nm (Aa) określano przy użyciu spektrofotometru multiskan sky microplate (ThermoFisher Scientific, America). Podobnie, w tym samym czasie wykryto absorbancję dołków z próbką bez tyrozynazy (Ab) i dołków kontrolnych z enzymem, ale bez próbki (Ab). Aktywność hamującą tyrozynazę obliczono z równania jak poniżej:

Wskaźnik hamowania tyrozynazy ( procent )=[1- (Aa-Ab)/Ac] × 100 procent.

IC50 obliczono stosując równanie GraphPad Prism jak poniżej:

Y=min plus (max − min)/1 plus 10(x−logIC50)×nachylenie wzgórza

X oznaczał stężenie inhibitora; Y reprezentował dane dotyczące hamowania (w procentach) wraz z ich wartościami minimalną (min.) i maksymalną (maks.); Nachylenie wzgórza to współczynnik nachylenia.

Cistanche hamuje aktywność tyrozynazy.

Inhibitor melaniny u danio pręgowanego

Danio pręgowany typu dzikiego z linii AB (dostarczony przez Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, prowincja Zhejiang) był trzymany w wodzie dla ryb (0,2% rozpuszczalnej soli morskiej w wodzie dejonizowanej, pH 6,9–7,2, przewodność 48{ {18}}–510 mS/cm i twardość 53,7–71,6 mg/L CaCO3) w fotoperiodzie 14/10 h światło/ciemność w stałej temperaturze 28±0,5 stopnia i karmione żywą solanką dwa razy dziennie. Zarodki danio pręgowanego uzyskano z naturalnego tarła i zebrano w ciągu 30 minut. Test danio pręgowanego uzyskał akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) w Hunter Biotechnology, Inc., a numer zatwierdzenia IACUC to 001458.

Zarodki na etapie 6 godzin po zapłodnieniu (hpf) traktowano każdy ekstrakt w sześciu stężeniach (10, 30, 62,5,125, 250 i 500 mg/l) przez 72 godziny w celu oceny maksymalnego stężenia nieśmiercionośnego (MNLC ). W rezultacie MNLC całego ekstraktu wynosiły ponad 62,50 mg/L.10 zarodków umieszczono w 6-dołku i poddano ekspozycji na badane próbki w stężeniach 10 i 30 mg/L od 6 hpf do 54 hpf (48 godzin ekspozycji ). DMSO (0,05%, obj./obj.) i arbutyna (10 i 30 mg/l) zastosowano odpowiednio jako kontrolę normalną i pozytywną.

Zsynchronizowane zarodki zebrano i obserwowano pod mikroskopem stereoskopowym (SZX7, Olympus, Japonia) wyposażonym w aparat cyfrowy (VertA1, Chiny). Akumulację melaniny, bezpośrednio skorelowaną z obszarami pigmentacji danio pręgowanego, obliczono przy użyciu programu GNUImage Manipulation Program (GIMP wersja 2.10.2) i wyrażono jako procent w odniesieniu do kontroli negatywnej (nagromadzenie melaniny 100%) [28, 30].

Badanie dokowania molekularnego

158 związków wyizolowanych z B. striata w literaturze [2], w tym 19 glikozydów, 28 bibenzylów, 19 fenantrenów, 18 bifenantrenów, 23 dihydrofenantrenów, 5 antocyjanów, 11 steroidów, 8 triterpenoidów, 12 kwasów fenolowych, 5 chinonów, i 10 innych związków zastosowano jako ligandy. Struktury 3D zostały narysowane przez ChemBio3D i zoptymalizowane przy użyciu MM2 i Autodock Tools. Strukturę krystaliczną 3D tyrozynazy (PDBID:5M8N) i cyklazy adenylanowej (PDB ID:5IV3) uzyskano z RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Wszystkie cząsteczki wody i heteroatomy zostały usunięte ze struktur krystalicznych przy użyciu narzędzi Chimera i MGL Tools. Wreszcie, Autodock

Vina została wykorzystana do dokowania białka receptora z ligandami o małej cząsteczce. Parametry miejsca dokowania białka receptora ustalono odpowiednio na -36,700, 7,034, -19,104 i -17,467, -22,807, 2,786, zgodnie z oryginalnym ligandem mimozyną i LRE1 [35]. W celu uzyskania większej dokładności obliczeniowej wygenerowano 20 parametrów wyczerpujących dla każdego receptora, a konformację o największym powinowactwie wybrano jako konformację końcową dokowania i zwizualizowano w Pymol2.3. Tymczasem jako kontrolę pozytywną przyjęto oryginalne ligandy mimozynę i LRE1 [36].

Przewidywanie in silico ADMET

Trzy najlepsze trafienia z B. striata wykazywały lepsze powinowactwo wiązania z tyrozynazą i cyklazą adenylanową, poddano analizie ADMET. QikProp w Schrodingersuite został wykorzystany do obliczenia ich właściwości fizycznych i cech związanych z lekiem, w tym masy cząsteczkowej (MW), przewidywanego współczynnika podziału oktanol/woda (QPlogPo/w), przewidywanej rozpuszczalności w wodzie (QPlogS), przewidywanej pozornej komórki Caco-2 przepuszczalność bariery krew-jelit (QPPCaco), przewidywany współczynnik podziału mózg/krew (QPlogBB), przewidywana przepuszczalność skóry (QPlogKp), przewidywane IC50 blokowania kanałów HERGK plus (QPlog HERG) i przewidywane wchłanianie doustne przez człowieka. Właściwości oceniano w oparciu o regułę piątki Lipińskiego oraz literaturę [37, 38].

Symulacja dynamiki molekularnej

W celu zbadania stabilności i dynamicznych fluktuacji kompleksu ligand-białko w symulowanym środowisku biologicznym oraz dalszej walidacji wyników dokowania, jako ligand do badań symulacyjnych dynamiki molekularnej (MD) wybrano związki blestrynę D (75). wynik dokowania molekularnego. Kompleks blestryny D z tyrozynazą i cyklazą adenylanową przeprowadzono symulacje MD i działał przez 100 ns, stosując tryb wody TIP3P. W celu zbadania stabilności białka w okresie symulacji obliczono wartości średniego kwadratu odchylenia (RMSD) atomów szkieletu białka w stosunku do początkowej struktury [39].

Wyniki

Skład chemiczny

Typowe chromatogramy chromatogramów z pikami podstawowymi ETB i EFB pokazano na Rys. 1. Do identyfikacji składników zastosowano oprogramowanie PeakView. Wzór cząsteczkowy został dokładnie przypisany z błędem masowym wynoszącym 10 ppm. Dokładną masę cząsteczkową i fragmentację wykorzystano do identyfikacji składników zgodnie z literaturą i bezpłatną bazą danych struktury chemicznej, taką jak ChemSpider i Massbank. W rezultacie wstępnie zidentyfikowano 39 kompozycji chemicznych, w tym 24 stilbenoidy (bibenzyle, fenantreny i ich pochodne), 6 glikozydów, 4 kwasy fenolowe, 3 chinony, 1 steroid i 1 inny związek. Jednocześnie przeprowadzono ich względną półkwantyfikację, mierząc powierzchnie pików każdego związku w trybie MS przy użyciu chromatogramów wyekstrahowanych jonów [40]. stężenie) podsumowano w Tabeli 1.

Zdolność antyoksydacyjna

Powszechnie wiadomo, że promieniowanie ultrafioletowe A (UVA) może indukować wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) i pośredniczyć w nadmiernej melanogenezie w komórkach skóry. Naturalny polifenol był inhibitorem wytwarzania ROS i mógł być odpowiedzialny za przeciwmelanogenne działanie ekstraktów roślinnych [41]. , 42]. Tak więc, w niniejszym badaniu, zdolność antyoksydacyjną oceniano za pomocą DPPH, aktywności wymiatania rodników ABTS i testu FRA. Wyniki (Tabela 2 i Ryc. 2) wykazały, że EFB (IC50=5.94mg/L) ma najsilniejszą aktywność zmiatania rodników DPPH in vitro w porównaniu z PTB(IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L) i ETB(IC50=65.25mg/L). Podobny trend zaobserwowano w teście ABTS i FRAP. 95-procentowe etanolowe ekstrakty TB i PB miały silniejszą aktywność przeciwutleniającą in vitro niż ich surowe polisacharydy. Ponadto EFB wykazują silniejszą aktywność antyoksydacyjną niż ETB, co jest zgodne z wynikami wcześniejszych badań [25].

Aktywność hamująca tyrozynazę

Tyrozynaza była kluczowym enzymem ograniczającym szybkość w szlaku biosyntezy melaniny i była szeroko stosowana do identyfikacji potencjału produktów naturalnych o działaniu antymelanogenezy [43]. Wyniki (ryc. 3) wykazały, że ETB i EPB wykazują silniejszą aktywność hamującą tyrozynazę niż PTB i PPB in vitro, co jest zgodne z wynikami wcześniejszych badań [25]. EFB wykazywał silniejsze działanie hamujące tyrozynazę w sposób zależny od dawki (pomiędzy 20 a 200 mg/l) z IC50=58.92 mg/l niż ETB(IC50=75.44 mg/l) i dodatni związek arbutyny (IC{ {11}}0,02 mg/l).

Inhibitor melaniny u danio pręgowanego

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), co wskazuje, że 0,05% DMSO w nośniku nie wpływało na produkcję melaniny w zarodkach danio pręgowanego. Jednak po ekspozycji na badane próbki i arbutynę przez 48 godzin, zarodki danio pręgowanego wykazywały różne stopnie odkładania melaniny (ryc. 3B, 4), z wyjątkiem grupy PFB 10 mg/L. Można zauważyć, że względna zawartość melaniny w grupach ETB 10mg/L (78,38 procent) i 30 mg/L (64,72 procent) była znacząco niższa niż w grupach PTB 10 mg/L (93,06 procent) i 30 mg/L (82,02 procent) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Dokowanie molekularne

Tyrozynaza jest enzymem ograniczającym szybkość biosyntezy melaniny: hydroksylacja tyrozyny do 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) i utlenianie todopachinonu DOPA. Dlatego tyrozynaza została uznana za krytyczny cel dla rozwoju inhibitorów melanogenezy [44]. Dodatkowo adenylatecyklaza jest kluczowym enzymem melanogenezy indukowanej cAMP. Wiązanie polipeptydu alfa melanotropiny (-MSH) z receptorami MC1R indukowało aktywację cyklazy adenylanowej, wzrost poziomu cAMP, zwiększenie ekspresji genu tyrozynazy, a następnie zwiększenie syntezy melaniny [45]. Dlatego przeprowadziliśmy badanie dokowania molekularnego 158 związków wyizolowanych wcześniej z B. striata [2], z tyrozynazą i cyklazą adenylanową. Energie wiązania badanych ligandów z tyrozynazą i adenylocyklazą zestawiono w tabeli S1. 83 (w tym 60 stylbenoidy) i 85 (w tym 70 stylbenoidów) wykazują silniejsze powinowactwo wiązania z tyrozynazą i cyklazą adenylanową w porównaniu do pierwotnych ligandów mimozyny (- 6,4 kcal/mol) i LRE1 (- 8,5 kcal). /mol). 1,8-bis(p-hydroksybenzylo)-4-metoksyfenantren-2,7-diol (56), blestryna D (75) i 2,7-dihydroksy -1,6-bis(p-hydroksybenzylo)-4-metoksy-9,10-dihydrofenantren (93) były trzema najlepszymi ligandami w stosunku do tyrozynazy, z energią wiązania odpowiednio -10,2,10,0 i 9,7 kcal/mol. Podczas gdy blestryna D (75), blestryna B (73) i 3,3′-dihydroksy-5-metoksy-2,5′,6-tris(p-hydroksybenzylo)bibenzyl (42) były trzema górnymi ligandami wobec cyklazy adenylanowej, o energii wiązania odpowiednio 12,1, 11,9 i 11,6 kcal/mol. Ich teoretyczne powinowactwa wiązania i oddziaływania ligand-aminokwas podsumowano w tabeli 3.

Warto zauważyć, że blestryna D (75), związek bifenantrenowy, weszła do kieszeni wiążącej tyrozynazy i cyklazy adenylanowej (ryc. 5) i wykazywała znaczące powinowactwo wiązania zarówno do tyrozynazy, jak i cyklazy adenylanowej. Oddziaływania Van der Walls przyczyniają się do ogólnej wartości oddziaływania energetycznego, podczas gdy grupa hydroksylowa wytwarza wiązania wodorowe odpowiednio z resztami aminokwasowymi Glu 451, Arg114 tyrozynazy i Val 167 cyklazy adenylanowej (Tabela 3 i Ryc. S1). Związek 93 również wykazywał znaczące powinowactwo wiązania w kierunku tyrozynazy poprzez tworzenie 6 wiązań wodorowych z resztami aminokwasowymi Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 i Gln236.

Przewidywanie in silico ADMET

Przewidywane wartości kilku ważnych parametrów wraz z ich dopuszczalnym zakresem zostały podsumowane w Tabeli 4. Oprócz QPlogS 3,3′,5-trimetoksybibenzylu, blestryny B i blestryny D oraz QPlogBB 3,3′,{{6} } trimetoksybibenzyl, wszystkie inne obliczone właściwości ADMET trzech najlepszych trafień mieściły się w oczekiwanych zakresach, tymczasem QPlog HERG wszystkich trzech najlepszych trafień było mniejsze niż -5, co wskazuje na potencjał do stosowania u ludzi. QPlog Kp wszystkich trzech najlepszych trafień zarówno dla tyrozynazy, jak i adenylocyklazy, z wyjątkiem 3,3′,5-trimetoksybibenzylu, znajdowały się w korzystnym zakresie, co wskazuje, że związki te mogą łatwo przenikać do skóry.

Symulacja dynamiki molekularnej

Wykres RMSD wykazał, że wartości RMSD kompleksu białko-ligand nie zmieniały się znacząco przez cały okres symulacji. Wartości RMSD (ryc. 6A) blestryny D z kompleksem tyrozynazy i cyklazy adenylanowej określono odpowiednio w zakresie od 1,5 do 2,8 Ł i od 2, 0 do 3,6 Ł. Wartość RMSF odzwierciedlająca elastyczność każdej pozostałości podczas symulacji. Reszty o wyższych wartościach RMSF wykazały, że były bardziej elastyczne (ryc. 6B). Stwierdzono, że wartości RMSF reszt aminokwasowych w regionach pętli wykazują duże wahania. Podczas gdy aktywne reszty miejsca utrzymywały małą wartość RMSF (mniej niż 1.0Å), taką jak tyrozynaza Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 i Arg230in oraz Val167, Leu102, Phe45, Lys95 i Leu166 w cyklazie adenylanowej, wskazując, że kieszenie na wiązania były utrzymywane w stanie stabilnym. Oddziaływania molekularne blestryny D z tyrozynazą i cyklazą adenylanową pokazano na ryc. 7.

Swobodne energie wiązania obliczono metodą MM-GBSA (mechanika molekularna-uogólnione pole powierzchni) [39]. Przewidywana swobodna energia wiązania blestryny D z tyrozynazą i adenylocyklazą wynosiła odpowiednio -96,94 kcal/mol i -139,69 kcal/mol, co sugeruje, że interakcje wiązania były spontaniczne (Tabela 5). Ponadto wkładami sprzyjającymi wiązaniu ligandów były niepolarne oddziaływania solwatacyjne, oddziaływania van der Waalsa i oddziaływania elektrostatyczne.

Warto zauważyć, że rodzaje i zawartość składników chemicznych w EFB były większe niż w ETB. Obszary pików wszystkich zidentyfikowanych związków w EFB były w przybliżeniu dwukrotnie większe niż w ETB. Mili-tarine była najliczniej występującym związkiem zarówno w EFB, jak i ETB, wykazując znaczące działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i neuroprotekcyjne, i została wybrana jako markery chemiczne do kontroli jakości B. striata w wydaniu Chińskiej Farmakopei 2020 [46]. Względna powierzchnia piku militaryny w EFB (38,39×106) była nieco wyższa niż w ETB (30,48×106). Gastrodin jest dobrze znanym związkiem w wielu chińskich lekach ziołowych, takich jak Gastrodia elata, który wykazuje znaczące działanie hamujące tyrozynazę i wymiatające rodniki [30]. Względna powierzchnia piku gastrodyny w EFB (1,43 x 106) była nieco mniejsza niż w inETB (2,17 x 106).

95-procentowe etanolowe ekstrakty TB i PB miały silniejszą aktywność przeciwutleniającą in vitro niż ich surowe polisacharydy. Ponadto EFB wykazują silniejszą aktywność antyoksydacyjną niż ETB, co było zgodne z wynikami wcześniejszych badań [25]. Zjawisko to można przypisać temu, że EFB zawiera wyższy poziom związków antyoksydacyjnych, takich jak militarystyka i stilbenoidy (naturalne polifenole roślinne). Na przykład względna powierzchnia piku 4,8,4′,8′-tetrametoksy-[1,1′-bifenantren]-2,7,2′,7′-tetrol, bifenantren z czterema fenolowymi grupami hydroksylowymi, wyniósł 9,15×106 w FB, a 0,01×106 w TB.

W niniejszym badaniu PPB i PTB wykazywały nieznaczną aktywność inhibicji tyrozynazy w sposób zależny od dawki. Wykazano jednak, że nie wykryto aktywności w wodnym ekstrakcie PB (zawiera PPB) [25]. Zjawisko to może być spowodowane różnym przygotowaniem próbki. Wodny ekstrakt PB zastosowano do oceny aktywności hamującej tyrozynazę w eksperymencie Jianga [25], podczas gdy w niniejszym badaniu wodny ekstrakt strącano etanolem w celu uzyskania surowego polisacharydu.

Ostatnio model danio pręgowanego szeroko stosowany w ocenie działania przeciw melanogenezie in vivo [47, 48]. Jako kontrolę dodatnią ustawiono arbutynę, związek hydrochinonoglukozydowy występujący w różnych roślinach, który jest komercyjnie stosowany w przemyśle kosmetycznym. Aktywności przeciw melanogenezie ETB i EFB były silniejsze niż arbutyny, co wskazuje, że ETB i EFB mogą być stosowane jako środki rozjaśniające skórę w przemyśle kosmetycznym.

Względna powierzchnia piku blestryny D w EFB (1,91 × 106) jest w przybliżeniu czterokrotnie większa niż w ETB(0.46 × 10). Względna powierzchnia piku związku 56 (8,73 × 106) i 93 (0,64 × 106) w EFB jest również znacząco wyższa niż w ETB (mniej niż 0,01 × 106 i 0,10 × 106). Może to być jeden z powodów, dla których EFB wykazuje silniejsze działanie antymelanogenne niż ETB. Warto zauważyć, że wszystkie trzy główne ligandy wobec tyrozynazy i cyklazy adenylanowej należą do stylbenoidów (bibenzyle, fenantreny i ich pochodne). Stilbenoidy są naturalnymi polifenolami roślinnymi. które wzbudziły duże zainteresowanie w ostatnich latach ze względu na ich niezwykłą bioaktywność, taką jak działanie przeciwzapalne, przeciwbakteryjne i przeciwutleniające [49]. Resweratrol jest najczęstszym stilbenoidem. Wcześniejsze badania wykazały, że resweratrol i jego pochodne mogą znacząco hamować aktywność katalityczną, ekspresję genów i potranslacyjne modyfikacje tyrozynazy. Tym samym okazały się potencjalnie przydatne jako środki rozjaśniające skórę i przeciwstarzeniowe w kosmetyce [41, 50].

Cistanche okazał się potencjalnie przydatny jako środek rozjaśniający skórę i przeciwstarzeniowy w kosmetyce.

Aby uzyskać więcej informacji, kliknij zdjęcie.

Wnioski

W tym badaniu systematycznie badano działanie przeciwutleniające i przeciwmelanogeniczne surowego polisacharydu z B. striatatuber (PTB) i korzeni włóknistych (FPB) oraz 95-procentowego ekstraktu etanolowego z bulw B. striata (ETB) i korzeni włóknistych (EFB). . Wyniki pokazały, że EFB posiada najsilniejszą aktywność DPPH, wymiatania rodników ABTS i aktywność redukującą żelazo. Ponadto ETB i EFB mogą znacznie zmniejszyć aktywność tyrozynazy in vitro i syntezę melaniny zarodków danio pręgowanego w sposób zależny od dawki. Dokowanie molekularne wykazało, że istnieje duża liczba związków, w większości należących do stilbenoidów, wykazujących silniejsze powinowactwo wiązania z tyrozynazą i cyklazą adenylanową w porównaniu z powinowactwem pierwotnego liganda. Obecne odkrycia potwierdziły uzasadnienie stosowania ETB i EFB jako naturalnych środków wybielających skórę w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym.