Charakterystyczne receptory Toll-podobne Ekspresja genów i odpowiedź glejowa w różnych obszarach mózgu naturalnej trzęsawki Część 1

Abstrakcyjny:

Choroby prionowe to przewlekłe i śmiertelne choroby neurodegeneracyjne charakteryzujące się akumulacją specyficznego dla choroby białka prionowego (PrPSc), zmianami gąbczastymi, utratą neuronów i glejozą.

Choroba prionowa, znana również jako choroba świątynna, choroba zjadania wosku itp., jest ostrą infekcją wirusową wywoływaną przez priony. Choroba przenoszona jest głównie poprzez spożywanie surowej żywności zawierającej priony. Po zakażeniu prionami może powodować zapalenie mózgu i uszkodzenie układu nerwowego, z objawami takimi jak ból głowy, wymioty i gorączka.

Jednak spotykając się z taką sytuacją nie możemy stracić zaufania do naszej pamięci ze względu na istnienie choroby prionowej. Większość zarażonych osób po leczeniu może odzyskać i przywrócić pamięć.

Oczywiście, profilaktycznie, możemy spróbować jeść więcej gotowanej żywności, aby uniknąć infekcji prionami. Jednocześnie, jeśli odczuwasz jakiekolwiek objawy, również powinieneś jak najszybciej udać się do lekarza, aby zapobiec pogorszeniu się choroby.

W życiu codziennym możemy spróbować prostych ćwiczeń pamięci, takich jak czytanie, tworzenie list, organizowanie wydarzeń i informacji itp., aby poprawić naszą pamięć. Treningi te nie wymagają dużo czasu i energii, ale są bardzo ważne dla utrzymania zdrowego mózgu i efektywnego funkcjonowania pamięci.

Krótko mówiąc, spotykając się z chorobami takimi jak choroba prionowa, należy pozytywnie na nią spojrzeć, zwrócić się o profesjonalną pomoc medyczną i środki zapobiegawcze oraz zwracać uwagę na codzienne ćwiczenia pamięci, aby zapewnić sobie zdrowie fizyczne i wydajną pracę. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche to tradycyjny chiński materiał leczniczy o wielu unikalnych efektach, z których jednym jest poprawa pamięci. Działanie Cistanche wynika z różnych zawartych w nim składników aktywnych, w tym kwasu garbnikowego, polisacharydów, glikozydów flawonoidowych itp. Składniki te mogą na różne sposoby promować zdrowie mózgu.

Kliknij i poznaj sposoby na poprawę funkcjonowania mózgu

Coraz więcej dowodów wskazuje, że odpowiedź neurozapalna jest kluczowym elementem chorób prionowych i przyczynia się do neurodegeneracji.

Zaproponowano, że receptory Toll-podobne (TLR) są ważnymi mediatorami wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wyzwalanych w ośrodkowym układzie nerwowym w innych chorobach neurodegeneracyjnych człowieka, w tym w chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona i stwardnieniu zanikowym bocznym.

Niewiele jednak wiadomo na temat roli receptorów TLR w chorobach prionowych i nie badano ich udziału w neuropatologii trzęsawki naturalnej. Oceniliśmy ekspresję genów owiec TLR w czterech anatomicznie odrębnych obszarach mózgu u owiec naturalnie zakażonych trzęsawką i oceniliśmy możliwe korelacje między ekspresją genów a patologicznymi cechami charakterystycznymi choroby prionowej.

Zaobserwowaliśmy znaczące zmiany w ekspresji TLR u owiec zakażonych trzęsawką, które korelują ze stopniem spongiozy, odkładaniem się PrPSc i gliozą w każdym z badanych regionów.

Co ciekawe, TLR4 był jedynym genem o zwiększonej ekspresji we wszystkich regionach, niezależnie od ciężkości neuropatologii. W hipokampie zaobserwowaliśmy łagodniejszą neuropatologię związaną z wyraźnym profilem ekspresji genu TLR i obecnością specyficznej morfologii mikrogleju, zwanej rodmikroglejem, opisanej tutaj po raz pierwszy w mózgu owcy zakażonej trzęsawką.

Zbieżność tych cech sugeruje częściową neuroprotekcję hipokampa. Na koniec porównanie wyników u naturalnie zakażonych owiec z modelem dużych myszy (myszy tg338) ujawniło wyraźne wzorce ekspresji genu TLR.

Słowa kluczowe: prion; trzęsawka; receptory płatkowe; zapalenie nerwów; mikroglej; astrocyty.

1. Wprowadzenie

Pasażowalne encefalopatie gąbczaste (TSE), czyli choroby prionowe, to grupa nieuleczalnych chorób neurodegeneracyjnych, do których zalicza się choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD) u ludzi, trzęsawka u owiec i kóz, gąbczasta encefalopatia bydła (BSE) u bydła i przewlekła choroba wyniszczająca u jeleniowatych. CWD).

Te TSE charakteryzują się transformacją kodowanego przez gospodarza białka prionowego (PrPC) w zakaźną izoformę PrPSc, która preferencyjnie gromadzi się w układzie nerwowym i układzie limforetikularnym (LRS) oraz zapalną reakcją immunologiczną w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) [1 ,2]. Choroby prionowe, takie jak trzęsawka, mogą zostać w naturalny sposób nabyte w wyniku narażenia doustnego na PrPSc.

Po przekroczeniu bariery jelitowej i przejściu pierwotnej replikacji w tkankach limfoidalnych PrPSc dociera do OUN w procesie znanym jako neuroinwazja. Zakażenie rozprzestrzenia się z miejsc w przewodzie pokarmowym, poprzez nerw błędny i trzewny, odpowiednio do pnia mózgu i rdzenia kręgowego [3,4].

Po dotarciu do OUN PrPSc rozprzestrzenia się z ogonowych obszarów torostalnych, tj. przez dziobowy pień mózgu do móżdżku, międzymózgowia i kory czołowej [5]. Anatomicznie stereotypowe nagromadzenie PrPSc sugeruje, że w jego rozprzestrzenianiu się pośredniczy łączność neuronalna i/lub selektywna wrażliwość różnych obszarów mózgu.

Czynniki gospodarza, takie jak genotyp, rasa i wiek zakażenia PrPSc, wpływają na wielkość odkładania się PrPSc i rozmieszczenie zmian gąbczastych.

Jednakże molekularne podstawy interakcji gospodarz-prion, które determinują selektywne kierowanie PrPSc do określonych obszarów mózgu, pozostają nieznane i stanowią jeden z najbardziej intrygujących aspektów zjawiska szczepów prionowych.

Pierwotnie zakładano, że układ odpornościowy nie reaguje na PrPSc ze względu na naturalną tolerancję, ale badania przebiegu czasowego wykazały szybką aktywację i proliferację mikrogleju i astrocytów jeszcze przed wystąpieniem objawów klinicznych i zwyrodnienia neuronów [6–8].

Ta wczesna aktywacja i proliferacja mikrogleju i astrocytów wydaje się odgrywać kluczową rolę w patogenezie chorób prionowych, chociaż mechanizmy molekularne zaangażowane w ich aktywację oraz dokładna rola zarówno reaktywnych astrocytów, jak i mikrogleju w patogenezie choroby pozostają niejasne [9,10].

Co więcej, powszechnie przyjmuje się, że rozmieszczenie i fenotyp mikrogleju i astrogleju różnią się w zależności od obszarów mózgu i gatunków [11–14], przypisując każdemu regionowi wewnętrzne cechy, które wpływają na podatność na neurodegenerację [10,15,16].

Zjawisko to jest szczególnie widoczne na etapie przedklinicznym, podczas którego zarówno mikroglej, jak i astroglej reagują na infekcję prionami w sposób specyficzny dla regionu.

Jednakże w miarę postępu choroby zaczyna dominować częściej odpowiedź neurozapalna, osłabiając większość cech regionalnych [17,18]. W ciągu ostatnich kilku lat donoszono o roli receptorów Toll-podobnych (TLR) w reaktywności mikrogleju i astrogleju w kilku zaburzeniach neurodegeneracyjnych, podkreślając ich wpływ na postęp tych chorób [19–21].

Jednakże dane na temat roli chorób prionowych TLRsin są skąpe. Opisano częściowo ochronną rolę receptorów TLR w patologii prionów. W szczególności donoszono, że utrata TLR2 [22] i TLR4 [23] przyspiesza patogenezę prionów, podczas gdy stymulacja TLR9 spowalnia postęp choroby w modelach mysich [24,25].

Do chwili obecnej większość badań TLR w chorobach prionowych przeprowadzono in vitro lub na modelach mysich [8,22,26–29], a ich rola u naturalnie zakażonych zwierząt i ludzi pozostaje niepewna. Według naszej wiedzy jedno badanie przeprowadzono na noworodkach jagniąt zaszczepionych doustnie trzęsawką (tj. przy użyciu naturalnego, ale niezakażonego w sposób naturalny żywiciela) i stwierdzono nadekspresję TLR2 i TLR4 we krwi w klinicznych stadiach choroby [30].

W dwóch badaniach opisano zmienioną ekspresję genu TLR u ludzi ze sporadyczną CJD(sCJD) [31,32]. Rozregulowanie genów zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną obejmowało nadekspresję mRNA TLR4 i TLR7 w móżdżku i korze czołowej pacjentów z sCJD MM1 oraz TLR7 w móżdżku pacjentów sCJD VV2.

Ponadto Areskeviciuteet al. [32] włączyli TLR4 do 40 najważniejszych regulatorów wyższego szczebla, które według przewidywań wykazują różną ekspresję w próbkach mózgu sCJD w porównaniu z próbkami kontrolnymi mózgu. Zbadaliśmy, w jaki sposób naturalna infekcja trzęsawki wpływa na poziomy transkrypcji owczych TLR i niektórych cytokin w czterech obszarach mózgu o różnym stopniu podatności na priony, w oparciu o poprzednie wyniki [18].

Ilościowa analiza PCR (qPCR) ujawniła zmiany w ekspresji genów w grupie zakażonej trzęsawką w porównaniu z grupą kontrolną oraz odpowiedź zależną od regionu mózgu.

Co ciekawe, hipokamp wykazywał najbardziej charakterystyczny profil uszkodzeń, ze specyficzną morfologią reaktywnego mikrogleju i wzorcem transkrypcji TLR. Biorąc pod uwagę brak danych eksperymentalnych na temat ekspresji genu TLR u myszy z nadekspresją PrP owcy, przeprowadziliśmy również eksperymenty z użyciem myszy tg338 zaszczepionych śródmózgowo trzęsawką.

Nasze wyniki ujawniają pewne podobieństwa z poprzednimi badaniami na myszach typu dzikiego, ale istotne różnice dotyczą wyników w przypadku trzęsawki naturalnej.

2. Wyniki

2.1. Neuropatologia trzęsawki naturalnie zakażonych owiec

Najpierw potwierdziliśmy neuropatologię trzęsawki u naturalnie zakażonych owiec objętych tym badaniem, jak opisano wcześniej [33–36]. Gąbniozę, odkładanie się PrPSc i glej reaktywny badano w czterech obszarach mózgów zakażonych i kontrolnych owiec: rdzeniu przedłużonym (Mo), wzgórzu (Th), hipokampie (Hc) i korze czołowej (Fc).

Wszystkie zwierzęta zakażone naturalnie znajdowały się w stadium klinicznym choroby. Jednakże stan kliniczny, w zależności od częstości i nasilenia objawów klinicznych, różnił się u owiec i obejmował stadia kliniczne od początkowego do zaawansowanego (Tabela 1).

Figura 1 przedstawia reprezentatywne mikrofotografie do oceny wakuolizacji i barwienia immunologicznego dla PrPSc, GFAP i Iba1, wykonane w każdym z wybranych regionów u zwierząt zakażonych i kontrolnych.

Zgodnie z oczekiwaniami, w skrawkach tkanek owiec kontrolnych nie wykryto żadnych dowodów wakuolizacji ani odkładania się PrPSc. I odwrotnie, u owiec zakażonych trzęsawką wszystkie obszary neuroanatomiczne wykazywały spongiozę, odkładanie się PrPSc i reaktywny glej (p < 0,05).

Intensywność wakuolizacji, odkładania się PrPSc i gliozy zmniejszyła się od rdzenia przedłużonego do kory czołowej. Co ciekawe, pomimo bliskości wzgórza i hipokampa, zaobserwowano istotne różnice w wynikach dla wszystkich markerów patologicznych.

Największy stopień spongiozy zaobserwowano w rdzeniu przedłużonym i wzgórzu, w przeciwieństwie do bardzo rozproszonej wakuolizacji stwierdzanej w hipokampie i korze czołowej.

Wakuolizacja wewnątrzneuronalna była obfita w jądrach rdzenia przedłużonego, co wykazano w jądrze ruchowym grzbietowym nerwu błędnego, podczas gdy gąbczasta neuropil dominowała we wzgórzu i korze czołowej (ryc. 1A). W neuropilu hipokampa znaleziono bardzo niewiele wakuoli.

Rycina 1. Reprezentatywna neuropatologia i ocena immunohistochemiczna spongiozy, odkładania się PrPSc, mikroglejozy i astrogliozy w OUN u owiec kontrolnych i owiec zakażonych trzęsawką w rdzeniu przedłużonym (Mo), wzgórzu (Th), hipokampie (Hc) i korze czołowej (Fc) .

Wykresy przedstawiają półilościowe wartości oceny dla każdego analizowanego parametru. (A) Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało zmiany w gąbczastości w OUN u owiec zakażonych trzęsawką i brak owiec pod kontrolą gąbczastej choroby. (B) Wykrywanie PrPSc za pomocą przeciwciała L42 w obszarach mózgu owcy zakażonej trzęsawką.

W grupie kontrolnej nie wykryto oznakowania immunologicznego. (C) Barwienie immunologiczne zjonizowanej cząsteczki adaptorowej wiążącej wapń-1(Iba1) wykazało zwiększoną reaktywność mikrogleju u owiec zakażonych trzęsawką w porównaniu z owcami kontrolnymi.

(D) Barwienie immunologiczne kwaśnego białka włóknistego glejów (GFAP) wykazujące zwiększoną reaktywność owiec zakażonych trzęsawką astrogliozą w porównaniu z owcami kontrolnymi. (E) Porównania statystyczne spongiozy, odkładania się PrPSc, Iba1 i intensywności GFAP między obszarami mózgu.

Wyniki wahają się od 0 (negatywny) do 5 (maksymalna intensywność). Znaczące różnice w spongiozie, PrPSc, Iba1 i GFAP określono za pomocą testu t-Studenta lub testu U Manna-Whitneya, odpowiednio dla danych o rozkładzie normalnym i nienormalnym.

Różnice statystyczne między obszarami mózgu określono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) lub testu Kruskala-Wallisa, odpowiednio dla danych o rozkładzie normalnym i nienormalnym. * p < 0.05, ** p < 0,01. Pasek skali=200 µm.

Wszystkie owce zakażone trzęsawką wykazywały powszechną akumulację PrPSc w czterech analizowanych regionach OUN, z wyjątkiem trzech owiec, które wykazywały początkowe objawy kliniczne i były PrPSc-ujemne w badaniach immunohistochemicznych (IHC) i Western blot (WB) w korze czołowej (Tabela 1).

Intensywność barwienia immunologicznego PrPSc ujawniła zmniejszenie ogonowe do rostralnego, podobne do obserwowanego w przypadku spongiozy, z maksymalną intensywnością w rdzeniu przedłużonym i wzgórzu, dwóch obszarach o największym stopniu wakuolizacji i mniejszą intensywnością w hipokampie i korze czołowej (ryc. 1B).

W hipokampie barwienie immunologiczne PrPSc wykazało ogniskową i nierównomierną dystrybucję, w przeciwieństwie do jednorodnego, rozproszonego, punktowego wzoru obserwowanego w przednich skrawkach kory.

Zaobserwowaliśmy cztery główne wzorce morfologiczne odkładania się PrPSc, jak opisano wcześniej [36]: dwa wzorce wewnątrzkomórkowe, które obejmują odkładanie wewnątrzneuronalne i wewnątrzglejowe (w tym wewnątrzastrocytarne i wewnątrzmikroglejowe) oraz dwa wzorce błony komórkowej/pozakomórkowe, które obejmują odkładanie się związane z neuropilami i komórkami glejowymi powiązane osadzanie się (rysunek S1).

We wszystkich obszarach mózgu dominowały wzorce wewnątrzneuronalne i związane z neuropilem. Co ciekawe, wzory wklęsło-glejowe zostały drastycznie zmniejszone lub nawet nieobecne w korze czołowej i hipokampie w porównaniu z rdzeniem przedłużonym i wzgórzem. Równolegle z IHC analizowaliśmy obecność prionów opornych na proteazy (PrPres) przez WB.

Próbki mózgu owiec zakażonych trzęsawką wykazywały klasyczny trójpasmowy wzór PrPres powiązany z trzęsawką klasyczną, o masie cząsteczkowej nieglikozylowanego fragmentu wynoszącej około 19 kDa (ryc. 2).

Pomimo pewnego stopnia zmienności, sygnał PrPres wzrastał wraz z nasileniem objawów klinicznych we wszystkich obszarach mózgu i był bardziej obfity w ogonowych obszarach mózgu.

Wartość WB dla PrPres była dodatnia w rdzeniu przedłużonym i wzgórzu u wszystkich owiec zakażonych trzęsawką. Natomiast próbki hipokampa i kory czołowej nie dały wyniku dodatniego pod względem PrPres u wszystkich zakażonych zwierząt.

Chociaż IHC wykazało dodatni wynik PrPres w hipokampie wszystkich zakażonych owiec, 4/13 dało wynik negatywny w teście WB. W korze czołowej 3/13 owiec miało wynik PrPres-ujemny w badaniu IHC, a 4/13 owiec miało wynik PrPres-ujemny w badaniu WB.

Oprócz wakuolizacji i odkładania się PrPSc, szeroko udokumentowano aktywację komórek glejowych jako wczesne zdarzenie w patogenezie chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek.

Aby scharakteryzować reaktywny glej, wszystkie obszary mózgu poddano IHC przy użyciu przeciwciał anty-GFAP w celu wykrycia astrocytów i przeciwciał anty-Iba1 w celu wykrycia mikrogleju.

Barwienie immunologiczne Iba1, które wykrywa zarówno spoczynkowy, jak i aktywowany mikroglej [37], było znacząco zwiększone we wszystkich obszarach mózgu u owiec zakażonych trzęsawką w porównaniu z owcami kontrolnymi i ujawniło wyraźne różnice w morfologii mikrogleju pomiędzy obszarami mózgu u zakażonych zwierząt (ryc. 1C).

Stan aktywacji komórek mikrogleju definiuje się na podstawie trzech głównych morfologii: rozgałęzionej, przerostowej i ameboidalnej [38,39]. Komórki mikrogleju w stanie „nadzorowanym” lub stosunkowo nieaktywnym mają rozgałęzioną morfologię, charakteryzującą się małym ciałem komórkowym z wieloma drobnymi wyrostkami, co zaobserwowano u naszych zwierząt kontrolnych.

Stan aktywny charakteryzuje się morfologią ameboidalną, która jest powszechnie kojarzona ze stanem fagocytarnym [38] i składa się z kulistych, nierozgałęzionych ciał komórkowych. Morfologia przerostowa charakteryzuje się mikroglejem z większym ciałem komórkowym i krótszymi, grubymi wyrostkami i jest związana z wytwarzaniem i uwalnianiem mediatorów stanu zapalnego [40,41].

Morfologia ameboidów była najliczniejsza w rdzeniu przedłużonym owiec zakażonych trzęsawką. We wzgórzu zaobserwowano morfologię ameboidu, ale nie dominowała: różnorodne duże i cienkie wyrostki przeplatane rzadkimi, grubymi wyrostkami wyrastającymi z wydłużonych ciał komórkowych, odpowiadających przerostowemu mikroglejowi.

Morfologia proliferacyjnego mikrogleju w korze czołowej i hipokampie różniła się znacznie od morfologii rdzenia przedłużonego i wzgórza. W obu regionach dominował przerośnięty mikroglej, a mikroglej ameboidalny był praktycznie nieobecny.

Co ciekawe, region hipokampa Cornu Ammonis 3 (CA3) wykazywał największe różnice w morfologii mikrogleju, wykazując wzór mikrogleju znany jako mikroglej pręcikowy, którego nie obserwowano w żadnym innym obszarze mózgu.

Te wyraźne różnice zaobserwowane w ocenie hipokampa skłoniły nas do przeprowadzenia szczegółowego badania podpól CA1, 3, 4 i warstwy lakunozowej (SLM).

Rycina 2. Wykrywanie PrPres metodą Western blot w OUN owcy kontrolnej i naturalnej owcy zakażonej trzęsawką. W celu odpowiedniego porównania załadowano równe ilości białka i przeprowadzono immunobloty przy użyciu przeciwciała monoklonalnego SHA31 do analizy próbek z (A) rdzenia przedłużonego, (B ) wzgórze, (C) hipokamp i (D) kora czołowa owiec zakażonych trzęsawką z początkowymi objawami klinicznymi (próbki 1–5) i zaawansowanymi objawami klinicznymi (próbki 6–13). Linia 14 przedstawia kontrolę ujemną, a linia 15 próbkę niezainfekowanego homogenatu mózgu owcy, niepoddanego trawieniu pK.

Barwienie immunologiczne GFAP ujawniło wyraźną astrogliozę u owiec zakażonych trzęsawką w porównaniu z owcami kontrolnymi (Figura 1D). Morfologicznie astrocyty zakażonych owiec konsekwentnie wykazywały przerośnięte ciała komórkowe i procesy, potwierdzając obecność reaktywnej astrogliozy, podczas gdy owce kontrolne wykazywały typową morfologię gwiaździstą w stanie nieaktywowanym.

W rdzeniu przedłużonym i wzgórzu barwienie immunologiczne GFAP było bardziej intensywne, z pojawieniem się sieci astrocytów w wyniku nakładających się procesów. W hipokampie i korze czołowej astrocyty były równomiernie rozmieszczone, z obecnością izolowanych przerostowych ciał gwiaździstych.

For more information:1950477648nn@gmail.com