Różnorodne systemy przeciwwirusowe dla drożdży zapobiegają śmiertelnej patogenezie powodowanej przez mykowirus LA

Niedawne badania pokazują, że systemy przeciwwirusowe są wyjątkowo konserwatywne, od bakterii po ssaki, co pokazuje, że unikalny wgląd w te systemy można uzyskać poprzez badanie organizmów drobnoustrojów. Jednak w przeciwieństwie do bakterii, gdzie infekcja fagowa może być śmiertelna, nie są znane żadne cytotoksyczne skutki wirusowe u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae, mimo że są one przewlekle zakażone dwuniciowym mykowirusem RNA zwanym LA. Dzieje się tak pomimo wcześniejszej identyfikacji konserwatywnych systemów przeciwwirusowych, które ograniczają replikację LA. Tutaj pokazujemy, że systemy te współpracują, aby zapobiec szalejącej replikacji LA, która powoduje śmiertelność w komórkach hodowanych w wysokich temperaturach. Wykorzystując to odkrycie, stosujemy badanie przesiewowe nadekspresji w celu zidentyfikowania funkcji przeciwwirusowych homologów drożdży białka wiążącego poliA (PABPC1) i białka Larp1 zawierającego domenę La, które są zaangażowane we wrodzoną odporność wirusa u ludzi. Stosując podejście polegające na komplementarnej utracie funkcji, identyfikujemy nowe funkcje przeciwwirusowe dla konserwatywnych egzonukleaz RNA REX2 i MYG1; kompleksy regulacyjne chromatyny SAGA i PAF1; i HSF1, główny regulator transkrypcji odpowiedzi na stres proteostatyczny. Poprzez badanie tych systemów przeciwwirusowych wykazujemy, że patogeneza LA jest związana z aktywowaną reakcją na stres proteostatyczny i akumulacją agregatów białek cytotoksycznych. Odkrycia te identyfikują stres proteotoksyczny jako podstawową przyczynę patogenezy LA i przyczyniają się do dalszego rozwoju drożdży jako potężnego systemu modelowego do odkrywania i charakteryzowania konserwatywnych systemów przeciwwirusowych.

Wszystkie szczepy laboratoryjne i większość izolatów środowiskowych pączkujących drożdży S. cerevisiae są zakażone wirusem dwuniciowego RNA (dsRNA) zwanym LA (1, 2). LA należy do szeroko rozproszonej rodziny endogennych wirusów dsRNA Totiviridae. Podobnie jak wszystkie wirusy z tej rodziny, genom dsRNA LA jest upakowany w wirionie, który chroni go przed trawieniem za pośrednictwem gospodarza. Dziury w wirionie umożliwiają wytłaczanie transkryptów RNA do cytozolu kodującego białko kapsydu Gag, które stanowi większość cząstki. Transkrypt LA koduje również białko fuzyjne Gag-pol, wytwarzane w znacznie niższych poziomach niż białko Gag, które posiada zależną od RNA aktywność polimerazy RNA. Każdy wirion zawiera białko Gag-pol, które odpowiada za replikację i transkrypcję LA w cząsteczce. Kapsydowanie transkryptów wirusa w powstających cząstkach i synteza ujemnej nici RNA przez Gag-pol w celu utworzenia genomu dsRNA kończy cykl replikacji LA (2). Do produkcji tych białek LA wykorzystuje cechy typowe dla wirusów RNA występujących u ludzi, w tym mechanizm „wyrywania czapeczki”, który dostarcza transkryptom LA z 5′-metylową czapeczką i mechanizmem rybosomalnego przesuwania ramki odczytu w celu wytworzenia białek fuzyjnych Gag i Gag-pol z pojedynczy transkrypt (3, 4).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Niedawne badania bakteryjnych systemów przeciwwirusowych wykazały, że wykazują one niezwykłą ewolucyjną ochronę w podobny sposób jak ludzie, ujawniając potencjał organizmów drobnoustrojowych w zakresie dostarczania nowych informacji na temat wrodzonej odporności wirusa (5–11). Rzeczywiście, wczesne badania z udziałem LA doprowadziły do ​​odkrycia dwóch systemów przeciwwirusowych, które, jak później wykazano, przyczyniają się do wrodzonej odporności przeciwko różnym wirusom RNA u ssaków (12.17). Pierwszy z tych systemów przeciwwirusowych obejmuje geny SKI2, 3 i 8, które kodują podjednostki konserwatywnego kompleksu związanego z rybosomami, który przeciwstawia się translacji transkryptów pozbawionych ogonów poli(A), takich jak te kodowane przez LA (18.23). Oddzielny szlak osłabienia LA zachodzi przez Xrn1 (znany również jako SKI1), egzorybonukleazę 5′-3′, która degraduje mRNA bez czapeczki (24–26).

Niedawno odkryliśmy, że mitochondrialna endonukleaza DNA/RNA Nuc1 hamuje akumulację LA w komórkach sporulujących, co stanowi nowy szlak przeciwwirusowy drożdży (27). Nuc1 jest homologiem endonukleazy G (EndoG) występującym u wszystkich eukariontów i wielu prokariotów i jest najbardziej znany ze swojej roli w promowaniu fragmentacji genomu podczas programowanej śmierci komórki ssaków, co jest znaczącym mechanizmem ostatniej szansy obrony wirusowej (28, 29). Co ciekawe, programowana śmierć komórki jest nieodłącznym elementem sporulacji drożdży, a Nuc1 fragmentuje DNA z umierających produktów mejotycznych podczas tego procesu, oprócz swojej roli w osłabianiu poziomu wirusa LA dziedziczonego przez przetrwałe zarodniki (27, 30, 31).

Pomimo wszechobecnej obecności LA w szczepach laboratoryjnych, nie przypisano mu żadnych konsekwencji w zakresie sprawności, dlatego LA jest w dużej mierze uważany za nieszkodliwego komensala. Tutaj pokazujemy, że infekcja LA jest w rzeczywistości śmiertelna dla drożdży i że musi być aktywnie osłabiana poprzez wrodzoną odporność wirusa, aby zachować żywotność. W szczególności w szczepach pozbawionych równoległych szlaków przeciwwirusowych NUC1 i SKI liczba kopii LA jest znacznie zwiększona, co prowadzi do śmiertelności w wysokich temperaturach.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Doszliśmy do wniosku, że dalsza charakterystyka LA i czynników utrzymujących jego replikację na niskim poziomie może ujawnić nowe systemy przeciwwirusowe. Identyfikacja warunków prowadzących do patogenezy LA umożliwiła nam zastosowanie metod bioinformatycznych i przyszłych badań genetycznych w celu odkrycia nowych genów przeciwwirusowych. Stosując badanie przesiewowe pod kątem genów ulegających nadekspresji, które tłumią warunkową śmiertelność nuc1∆ ski3∆, identyfikujemy funkcje przeciwwirusowe homologów drożdży białka wiążącego poli(A) (PABPC1) i białka Larp1 zawierającego domenę La, które są zaangażowane w wrodzone wirusowe odporność u ludzi (32, 33). Co więcej, badania genetyczne dotyczące utraty funkcji zidentyfikowały dwanaście nowych genów przeciwwirusowych. Należą do nich wysoce konserwatywny kompleks koaktywatora transkrypcji SAGA i kilka egzonukleaz RNA, w tym REX2 i MYG1, z których oba mają odrębne, ale słabo scharakteryzowane homologi ludzkie i bakteryjne (34–37).

Na koniec scharakteryzowaliśmy patogenezę LA przy użyciu metod biologii komórkowej i odkryliśmy, że wysokie miano wirusa powoduje stres proteostatyczny. Ponieważ dobrze wiadomo, że wysoka temperatura zaostrza stres proteostatyczny, obserwacje te sugerują, że katastrofalny stres proteostatyczny jest przyczyną śmiertelności wywołanej LA. Zgodnie z tą hipotezą pokazujemy, że mutanty nuc1∆ ski3∆ wykazują zależną od LA wrażliwość na kwas azetydyno-2-karboksylowy (AZC), analog proliny, o którym wiadomo, że powoduje stres ortostatyczny (38). Ponadto wykazujemy funkcję przeciwwirusową HSF1, konserwatywnego czynnika transkrypcyjnego, który wyczuwa i kieruje odpowiedzią na stres ortostatyczny. Co ciekawe, ludzki Hsf1 odgrywa również ważną rolę w replikacji i/lub patogeniczności różnych wirusów, w tym HIV, SARS-Cov-2 i wirusa dengi, chociaż mechanizmy są niejasne (39). Odkrycia te dostarczają nowych przykładów wrodzonej ochrony układu odpornościowego od drobnoustrojów po ludzi, a także drożdży o wysokiej zawartości światła, co może stanowić potężny system modelowy do odkrywania nowych systemów przeciwwirusowych.

Wyniki

Systemy przeciwwirusowe przeciwko drożdżom NUC1, SKI i XRN1 współpracują, aby zapobiegać patogenezie LA.

Nasze poprzednie badania NUC1 skupiały się na komórkach mejotycznych (27). Aby zbadać funkcję przeciwwirusową NUC1 u drożdży rosnących wegetatywnie, zbadaliśmy liczbę kopii LA w mitotycznych komórkach haploidalnych na tle referencyjnego szczepu BY4742. Zaobserwowaliśmy poziomy dsRNA LA stosując barwienie bromkiem etydyny elektroforetycznego RNA i odkryliśmy, że podwójny mutant nuc1∆ ski3∆ wykazywał duży wzrost dsRNA LA (ryc. 1A). Potwierdziliśmy te odkrycia za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej z przeciwciałem dsRNA stosowanym do wykrywania replikujących wirusów RNA (40, 41). Obrazy te pokazały, że dsRNA LA gromadził się w ogniskach przypominających miejsca replikacji wirusa „fabryki wirusów” obserwowane w komórkach ludzkich (ryc. 1B i załącznik SI, ryc. S1) (42). Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami dotyczącymi innych szczepów (24, 27, 43), Western blot wykazał, że poziomy białka Gag były podwyższone w mutantach nuc1∆ i ski3∆ (ryc. 1C). Ponadto pokazaliśmy, że podwójny mutant nuc1∆ ski3∆ akumulował znacznie podwyższone poziomy Gag (ryc. 1C). Dane te pokazują, że NUC1 i SKI3 uczestniczą w oddzielnych szlakach przeciwwirusowych i że utrata obu szlaków powoduje znacznie zwiększone miano wirusa LA.

Aby określić, czy wysokie miano wirusa LA wpływa na sprawność komórek, zbadaliśmy wzrost drożdży za pomocą testów wzrostu punktowego. Subtelne defekty wzrostu pojedynczych mutantów nuc1∆ i ski3∆ zaobserwowano w temperaturze 37 stopni, gdy komórki hodowano przy użyciu gliceryny, a nie glukozy jako źródła węgla, czyli stanu, w którym drożdże opierają się na oddychaniu mitochondrialnym (ryc. 1D). Co ciekawe, chociaż podwójne mutanty nuc1∆ ski3∆ rosły normalnie w temperaturze 30 stopnia, wykazywały warunkową śmiertelność w temperaturze 37 stopni, niezależnie od źródła węgla (ryc. 1D). Zgodnie z oczekiwaniami, podwójnemu mutantowi nuc1∆ ski3∆ żywotność w wysokiej temperaturze przywrócono za pomocą plazmidu eksprymującego NUC1-, co wywołało odpowiednie zmniejszenie poziomów Gag (ryc. 1 C i D). Aby potwierdzić, że defekt wzrostu podwójnego mutanta nuc1∆ ski3∆ był spowodowany przez LA, skonstruowaliśmy izogeniczny szczep wyleczony z LA (LA0 ) i zbadaliśmy jego wzrost w wysokich temperaturach. Odkryliśmy, że defekt wzrostu został całkowicie złagodzony, co sugeruje, że warunkowa śmiertelność była wynikiem nieograniczonej replikacji LA (ryc. 1D). Aby ocenić wpływ wysokiej liczby kopii LA na sprawność komórek w optymalnych warunkach wzrostu, zmierzyliśmy tempo proliferacji w hodowli płynnej. Badania te ujawniły zmniejszone tempo wzrostu podwójnych mutantów nuc1∆ ski3∆ w porównaniu z typem dzikim w 30 stopniach, które zostało odwrócone w szczepach L-A0, wykazując, że wysokie obciążenie LA jest szkodliwe dla sprawności nawet w komórkach niestresowanych (Załącznik SI, ryc. S2).

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Aby dokładniej scharakteryzować sposób, w jaki NUC1 oddziałuje ze znanymi szlakami przeciwwirusowymi, przetestowaliśmy jego związek z XRN1. Odkryliśmy, że podwójny mutant nuc1∆ xrn1∆ akumulował znacznie podwyższone poziomy Gag w porównaniu z którymkolwiek pojedynczym mutantem i wykazywał zależną od LA śmiertelność warunkową w wysokiej temperaturze (załącznik SI, ryc. S3 A ​​i B), co sugeruje, że NUC1 i XRN1 działają w równoległe ścieżki osłabiające LA. Odzwierciedlając ich kluczową, niezbędną rolę w regulacji masowego mRNA, podwójny mutant xrn1∆ ski3∆ jest niezniszczalny, nawet w szczepach pozbawionych LA (44). Aby ustalić, czy XRN1 reprezentuje system przeciwwirusowy niezależny zarówno od NUC1, jak i SKI3, użyliśmy plazmidu o dużej liczbie kopii do nadekspresji XRN1 w podwójnym mutancie nuc1∆ski3∆. Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy znaczny spadek poziomów Gag i tłumienie warunkowej śmiertelności nuc1∆ ski3∆ przy użyciu nadekspresji XRN1 sterowanej plazmidem (ryc. 1 C i D). Dochodzimy do wniosku, że Nuc1, Ski3 i Xrn1 zbieżnie przeciwstawiają się replikacji LA i że znacznie zwiększone miano wirusa LA w mutantach nuc1∆ ski3∆ lub nuc1∆ xrn1∆ spowodowało śmiertelną patogenezę w wysokich temperaturach (ryc. 1E).

Bioinformatyczny ekran genetyczny identyfikuje nowe czynniki przeciwwirusowe.

Zależna od LA warunkowa śmiertelność podwójnych mutantów nuc1∆ ski3∆ zwiększyła możliwość identyfikacji innych czynników przeciwwirusowych poprzez kombinatoryczne badania mutantów. Aby zidentyfikować nowe potencjalne czynniki przeciwwirusowe, przeszukaliśmy wybraną bazę danych interakcji genetycznych pod kątem delecji genów, które powodowały syntetyczny defekt wzrostu w połączeniu z nuc1∆ w co najmniej dwóch wysokowydajnych badaniach przesiewowych (45). Oprócz oczekiwanej obecności delecji XRN1 i SKI w tym zestawie danych, znaleźliśmy szesnaście dodatkowych genów. Wykorzystaliśmy krzyżowanie genetyczne, aby stworzyć potrójne mutanty łączące delecje każdego z tych szesnastu genów z nuc1∆ ski3∆ i potwierdziliśmy sześć, które powodowały poważne defekty wzrostu (Tabela 1). Ustaliliśmy, że syntetyczne fenotypy wzrostu powodowane przez każdy z tych genów zostały odwrócone w szczepach LA0, co sugeruje, że kodują one białka przeciwwirusowe (Tabela 1). Poniżej opisujemy potwierdzenie kilku z tych trafień ekranowych jako nowe czynniki przeciwwirusowe.

Jeden gen zidentyfikowany na naszym ekranie, REX2, koduje egzonukleazę 3′-5′ RNA konserwowaną u bakterii u ludzi (35). Zarówno Rex2, jak i jego ludzki homolog REXO2 lokalizują się w mitochondriach i zawierają domenę EXOIII powszechnie występującą w białkach prokariotycznych i eukariotycznych, w tym w białku przeciwwirusowym stymulowanym interferonem ISG20 (36, 37, 46–48). Odkryliśmy, że podwójnie zmutowany szczep rex2∆ nuc1∆ akumulował znacznie zwiększone poziomy Gag w porównaniu z dowolnym pojedynczym mutantem i wykazywał zależne od LA defekty wzrostu, w tym śmiertelność w wysokiej temperaturze (ryc. 2 A i B oraz dodatek SI, ryc. S2). Szczep z pojedynczym mutantem rex2∆ wykazywał niewielki wzrost poziomów Gag, chociaż efekt ten był marginalny (ryc. 2B). Aby rygorystycznie zbadać konsekwencje rex2∆ dla liczby kopii LA, określiliśmy ilościowo RNA LA za pomocą RT-qPCR. Pomiary te potwierdziły, że szczepy rex2∆ nuc1∆ akumulują znacznie zwiększone poziomy LA, chociaż ujawniły również, że pojedynczy mutant rex2∆ nie akumulował zwiększonego RNA LA (ryc. 2C). Odkrycia te sugerują, że przeciwwirusowa rola Rex2 jest widoczna tylko w przypadku braku funkcji NUC1. Co ciekawe, potrójne mutanty nuc1∆ ski3∆ rex2∆ i nuc1∆ xrn1∆ rex2∆ były niezniszczalne we wszystkich warunkach wzrostu, a defekty te zostały odwrócone w szczepach L-A0 (ryc. 2D). Odkrycia te wskazują na poważny patogenny potencjał mykowirusa LA i identyfikują nową przeciwwirusową rolę wysoce konserwatywnej egzonukleazy RNA zlokalizowanej w mitochondriach.

Ryc. 1. Atenuacja LA chroni drożdże przed śmiertelną patogenezą. (A) Pokazano wybarwiony bromkiem etydyny żel całkowitego RNA przygotowany ze wskazanych szczepów, z prążkiem dsRNA LA o długości 4,6 kb wskazanym strzałką. (B) Immunofluorescencję zastosowano do wizualizacji dsRNA LA (pomarańczowy) w komórkach wskazanych genotypów. Szczepy te wyleczono słabo występującym wirusem dsRNA L-BC, aby wyeliminować barwienie tła (szczegóły metody). Barwienie DNA metodą DAPI jest zaznaczone na niebiesko. (Odcinek skali, 1 μm.) (C) Pokazano Western blot poziomów białka LA Gag i 3-kinazy fosfoglicerynianowej (Pgk1) we wskazanych szczepach. Po prawej stronie wskazano znaczniki masy cząsteczkowej. (D) Pokazano testy punktowe wzrostu szczepów z 1C. Szczepy nanoszono na pożywkę -Leu zawierającą glukozę lub glicerol i hodowano we wskazanych temperaturach. (E) Białko mitochondrialne Nuc1 współpracuje z białkami cytozolowymi Xrn1 i SkiC w celu regulacji poziomu białka LA i zapewnienia sprawności komórek.

Innym genem zidentyfikowanym na naszym badaniu przesiewowym był MYG1, homolog drożdży ludzkiego genu 1 proliferacji MelanocYte, egzonukleaza 3′-5′ RNA, która ma homologi we wszystkich taksonach (34). Zmutowane szczepy łączące myg1∆ i nuc1∆ wykazywały duży wzrost białka Gag i RNA LA w porównaniu z pojedynczymi mutantami i wykazywały poważne defekty wzrostu zależne od LA w wysokiej temperaturze i w płynnej hodowli (ryc. 2C i dodatek SI, ryc. S2, S4 A i C). Podobnie jak w przypadku rex2∆, pojedynczy zmutowany szczep myg1∆ wykazywał niewielki wzrost poziomu Gag i brak zmian w RNA LA (ryc. 2C i dodatek SI, ryc. S4C). Udało nam się odzyskać potrójne mutanty nuc1∆ ski3∆ myg1∆, chociaż rosły one niezwykle wolno w temperaturze 30 stopnia i akumulowały jeszcze wyższe poziomy Gag (Załącznik SI, rys. S4 A i C). Te defekty wzrostu zostały również odwrócone w szczepach L-A0 (załącznik SI, ryc. S4A). MYG1 reprezentuje zatem nowy czynnik przeciwwirusowy, działający równolegle zarówno z NUC1, jak i kompleksem SKI.

Tabela 1. Identyfikacja nowych potencjalnych czynników przeciwwirusowych przy użyciu podejścia bioinformatycznego

Mutacje prowadzące do nadekspresji ludzkiego MYG1 są powiązane z chorobą autoimmunologiczną bielactwa nabytego, co sugeruje, że MYG1 może odgrywać pewną rolę we wrodzonej odporności człowieka (49, 50). Zbadaliśmy tę możliwość, stosując plazmid wyrażający ludzki MYG1 pod kontrolą konstytutywnego promotora drożdży (34) i odkryliśmy, że ludzki MYG1 uratował warunkowy defekt wzrostu mutanta nuc1∆ myg1∆ (Załącznik SI, ryc. S4D). Odkrycia te pokazują, że ludzki MYG1 może pełnić funkcję przeciwwirusową drożdży MYG1, co sugeruje potencjalną funkcję przeciwwirusową MYG1 u ludzi.

Ryc. 2. Identyfikacja nowych czynników przeciwwirusowych poprzez wykorzystanie patogenezy LA. (A) Pokazano analizę punktową szczepów wadliwych w NUC1 i REX2. Szczepy nanoszono na pożywkę SC zawierającą glukozę lub glicerol i hodowano we wskazanej temperaturze. (B) Western blot poziomów białek LA Gag i Pgk1 szczepów na ryc. 2A. Po prawej stronie wskazano znaczniki masy cząsteczkowej. (C) RNA LA oznaczono ilościowo za pomocą qPCR i znormalizowano do endogennego RNA ACT1. Pokazano średni poziom RNA i SD. n.=5. *P < {{1{12}}}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 (test t-Studenta dla niesparowanych). (D) Pokazano analizę punktową szczepów wadliwych w trzech równoległych szlakach przeciwwirusowych zawierających plazmid wyrażający NUC1. Szczepy nanosi się na pożywkę -URA lub pożywkę syntetyczną kompletną (SC) uzupełnioną 0,1% 5-kwasem fluoroorotowym (5-FOA).

Kolejną kategorią genów zidentyfikowaną za pomocą naszego ekranu bioinformatycznego była ekspresja genów. CDC73 i SPT3 kodują podjednostki odpowiednio konserwatywnych kompleksów związanych z chromatyną, PAF1 i SAGA. Zarówno cdc73∆, jak i spt3∆ powodowały śmiertelność zależną od LA w połączeniu z nuc1∆ ski3∆ (Tabela 1). Ponieważ wykazano, że SAGA (SptAda-Gcn5-Acetylotransferaza) zwiększa ekspresję genów przeciwwirusowych w grzybie zarazy kasztanowca Cryphonectria parasitica, zbadaliśmy ten kompleks dalej (51). Podwójnie zmutowany szczep spt3∆ nuc1∆ akumulował zwiększone poziomy Gag i wykazywał zależną od LA śmiertelność w wysokich temperaturach (Załącznik SI, ryc. S4 B i C). SAGA jest dużym kompleksem białkowym i potwierdziliśmy, że delecje w kilku innych genach kodujących podjednostki SAGA miały takie same konsekwencje fenotypowe jak spt3∆ (załącznik SI, tabela S1 i S4C). W połączeniu z odkryciami dotyczącymi C. parasitica wyniki te sugerują, że kompleks SAGA kontroluje ekspresję genów przeciwwirusowych u różnych gatunków grzybów.

Badanie przesiewowe polegające na tłumieniu dużej liczby kopii identyfikuje czynniki przeciwwirusowe drożdży, które są również przeciwwirusowe u ludzi.

Ponieważ nadekspresja XRN1 tłumiła defekty wzrostu szczepu nuc1∆ski3∆, postawiliśmy hipotezę, że nadekspresja innych czynników przeciwwirusowych wywoła podobny efekt, który można wykorzystać jako ekran do identyfikacji nowych systemów przeciwwirusowych. Zastosowaliśmy ekran supresji plazmidów o dużej liczbie kopii, aby wykryć geny, których nadekspresja złagodziła warunkową śmiertelność szczepu nuc1Δ ski3Δ (szczegóły metody). Korzystając z tego ekranu, zidentyfikowaliśmy SRO9, SLF1 i PAB1 jako supresory o dużej liczbie kopii nuc1∆ ski3∆, z których wszystkie kodują białka wiążące RNA związane z rybosomami (ryc. 3A) (52, 53). Sro9 i Slf1 to paralogiczne białka zawierające domenę autoantygenu tocznia (La), powszechnie występujące u eukariontów. Warto zauważyć, że ich ludzki homolog, Larp1, został niedawno zidentyfikowany w badaniach przesiewowych pod kątem białek związanych z SARS-Cov-2 plus nić ssRNA lub nukleokapsyd (32, 54). W jednym z tych badań skupiono się głównie na Larp1, który wykazano, że osłabia replikację SARS-Cov-2 w komórkach ludzkich, choć mechanizm jego działania nie jest znany (32). PAB1 koduje wysoce konserwatywne białko wiążące PolyA, które jest częstym celem hamowania wirusa u ludzi poprzez różne mechanizmy (33). Odkryliśmy, że nadekspresja PAB1 lub SRO9 znacznie obniżyła poziomy Gag u mutanta nuc1∆ ski3∆, wyjaśniając ich fenotyp ratunkowy (ryc. 3B). Co ciekawe, mimo że nadekspresja SLF1 uratowała defekt wzrostu nuc1∆ ski3∆ tak samo dobrze jak SRO9, nie doprowadziło to do żadnego zmniejszenia poziomów Gag (ryc. 3 A i B). Odkrycia te sugerują, że PAB1 i SRO9 ratują komórki poprzez hamowanie replikacji LA i że SLF1 chroni komórki przed patogennymi konsekwencjami zwiększonej replikacji wirusa.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Wysoka liczba kopii LA prowadzi do cytotoksycznego stresu proteostatycznego.

Aby uzyskać wgląd w rozbieżne mechanizmy działania przeciwwirusowego Sro9 i Slf1, rozważyliśmy, jakie mogą być fizjologiczne konsekwencje patogenezy LA i jak SRO9/SLF1 może na nie wpływać w różny sposób. Odnotowaliśmy poprzednie badanie, w którym delecje genów NUC1 lub kompleksu SKI prowadziły do ​​słabej indukcji genu reporterowego GFP kontrolowanego przez Hsf1 (55), konserwatywny czynnik transkrypcyjny, który wyczuwa stres proteostatyczny i aktywuje odpowiedź ekspresji genu (56–58 ). Stosując cytometrię przepływową z tym reporterem (HSE-GFP), potwierdziliśmy te wyniki i ustaliliśmy, że podwójny mutant nuc1∆ ski3∆ powoduje synergistyczną i zależną od LA aktywację HSE-GFP (ryc. 3C i dodatek SI, ryc. S5). Postawiliśmy hipotezę, że masowa produkcja Gag obserwowana w mutantach nuc1∆ ski3∆ wyjaśnia tę reakcję na stres proteostatyczny. Potwierdza to, aktywacja HSE-GFP podwójnego mutanta nuc1∆ ski3∆ została odwrócona przez nadekspresję PAB1 lub SRO9, co odzwierciedla konsekwencje tych genów dla akumulacji Gag (ryc. 3 B i C). Warto zauważyć, że nadekspresja paralogu SRO9 SLF1 nie zapobiegła aktywacji HSE-GFP. Ewolucyjna rozbieżność paralogicznych genów SRO9 i SLF1 spowodowała zatem różne mechanizmy przeciwwirusowe, przy czym SRO9 hamuje akumulację białek wirusowych i powiązany stres proteostatyczny, a SLF1 pozornie chroni komórki przed toksycznymi konsekwencjami stresu proteostatycznego wywołanego wirusem.

Ryc. 3. Nadekspresja czynników kontroli translacji łagodzi patogenezę LA. (A) Pokazano testy punktowe wzrostu supresorów o wysokiej kopiowaniu SRO9, SLF1 i PAB1. Szczepy nanoszono na pożywkę –LEU zawierającą glukozę lub glicerol i hodowano we wskazanych temperaturach. (B) Western blot dla poziomów białek LA Gag, Pgk1, Sro9 i Slf1 w szczepach z 3A. Po prawej stronie wskazano znaczniki masy cząsteczkowej. (C) Do pomiaru ekspresji HSE GFP we wskazanych szczepach (n {{1{11}}}}) zastosowano cytometrię przepływową. Pierwszy i trzeci kwartyl zaznaczono szarymi prostokątami. Mediana intensywności GFP jest oznaczona czarnymi słupkami wewnątrz. *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (test t-Studenta dla niesparowanych). (D) Mikroskopia fluorescencyjna Hsp104-GFP we wskazanych szczepach. Komórki barwiono DAPI w celu uwidocznienia jąder. (Odcinek skali, 1 μm.) Po prawej stronie pokazano odsetek komórek z ogniskami 3+ GFP. n.=3. W każdym powtórzeniu zliczono od 75 do 140 komórek.

Stres proteostatyczny jest często związany z nagromadzeniem cytotoksycznych agregatów białkowych, które można uwidocznić za pomocą GFP połączonego z dezagregazą białkową Hsp104, bezpośrednim celem aktywacji transkrypcji Hsf1, o którym wiadomo, że kolokalizuje się z agregatami białkowymi (59, 60). Aby dokładniej zbadać defekty proteostatyczne związane z patogenezą LA, wykorzystaliśmy mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji ognisk Hsp104-GFP w różnych szczepach. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki typu dzikiego hodowane w temperaturze 30 stopni rzadko gromadziły obserwowalne ogniska Hsp104-GFP. Podczas gdy pojedyncze mutanty nuc1∆ i ski3∆ przypominały typ dziki, co uderzające, podwójny mutant nuc1∆ ski3∆ wykazywał ponad 25% komórek z trzema lub większą liczbą ognisk Hsp104-GFP (ryc. 3D). Podobnie jak w przypadku wszystkich innych fenotypów, które zaobserwowaliśmy dla nuc1∆ ski3∆, akumulacja ognisk Hsp104-GFP była zależna od obecności LA (ryc. 3D). Odkrycia te pokazują, że wysokie miano wirusa spowodowane delecją NUC1 i SKI3 doprowadziło do akumulacji ognisk Hsp104-GFP wskazujących na agregację białek cytotoksycznych.

Ponieważ patogeneza LA była skorelowana z defektami proteostatycznymi, postawiliśmy hipotezę, że Hsf1 będzie działać jako czynnik przeciwwirusowy. Delecja HSF1 jest śmiertelna, dlatego wykorzystaliśmy wrażliwy na temperaturę allel hsf1-848 pochodzący z wcześniej opublikowanej kolekcji szczepów (61). Allel hsf1-848 wykazywał brak wzrostu w 39 stopniach, średni fenotyp wzrostu w 37 stopniach i brak widocznych defektów wzrostu w 35 stopniach (ryc. 4A). Testy punktowe wykazały, że fenotypy wzrostu hsf1-848 w 35 i 37 stopniach uległy znacznej poprawie w połączeniu z nuc1∆ lub ski3∆ i że te defekty wzrostu zostały odwrócone w szczepach pozbawionych wirusa LA (ryc. 4A) . Zgodnie z oczekiwaniami, niezniszczalność wszystkich zmutowanych szczepów hsf1-848 utrzymywała się w komórkach hodowanych w temperaturze 39 stopni niezależnie od obecności LA. Co więcej, stosując rozwarstwienie tetradowe, pokazaliśmy, że potrójne mutanty hsf1-848 nuc1∆ ski3∆ są nie do życia w dopuszczalnej temperaturze, jeśli są zakażone LA, ale są zdrowe, jeśli pochodzą ze szczepu LA0 (SI Dodatek, rys. S6). Stosując Western blot, odkryliśmy, że hsf1-848 nuc1∆ i hsf1-848 ski3∆ akumulowały zwiększone ilości LA Gag w porównaniu z pojedynczymi mutantami (ryc. 4B). W połączeniu z naszymi badaniami z zakresu biologii komórkowej odkrycia te sugerują, że regulowana przez Hsf1-reakcja na stres proteostatyczny działa u drożdży jako system przeciwwirusowy, przeciwstawiając się chorobotwórczym konsekwencjom szalejącej replikacji LA.

Ponieważ wiadomo, że defekty proteostatyczne ulegają zaostrzeniu i prowadzą do cytotoksyczności w wysokich temperaturach (59), prosty model przypisuje śmiertelne konsekwencje patogenezy LA w wysokich temperaturach katastrofalnemu stresowi proteostatycznemu. Aby dalej testować ten model, traktowaliśmy szczepy kwasem azetydyno-2-karboksylowym (AZC), analogiem proliny włączanym do białek, co prowadzi do stresu ortostatycznego (38). Eksperymenty te wykazały, że nuc1∆ ski3∆ wykazywał silną wrażliwość na AZC w sposób zależny od wirusa LA (ryc. 4C i dodatek SI, ryc. S6). Ponadto odkryliśmy, że nuc1∆ski3∆ wykazywał wrażliwość na 5% etanol, stan, który również powoduje defekty proteostatyczne, ale nie na 0,5 M NaCl, który powoduje stres osmotyczny (Załącznik SI, rys. S6). Odkrycia te sugerują, że śmiertelne konsekwencje patogenezy LA są w szczególności spowodowane przytłaczającym stresem proteostatycznym.

Ryc. 4. Odpowiedź na szok cieplny hamuje patogenezę LA. (A) Pokazano analizę punktową szczepów wadliwych w HSF1, NUC1 i SKI3 z lub bez LA. Szczepy nanoszono na pożywkę SC zawierającą glukozę i hodowano we wskazanej temperaturze. (B) Western blot dla poziomów białek LA Gag i Pgk1 wskazanych szczepów. Po prawej stronie wskazano znaczniki masy cząsteczkowej. (C) Pokazano analizę punktową szczepów traktowanych proteotoksycznym analogiem proliny, kwasem azetydyno-2-karboksylowym (AZC). Szczepy nanoszono na pożywkę SC zawierającą glukozę z dodatkiem lub bez 0,1 mg/ml AZC i hodowano w temperaturze 30°C.

Dyskusja

Pomimo jego wszechobecności w szczepach laboratoryjnych, badania nad wirusem dsRNA LA były ograniczone ze względu na jego pozornie łagodny charakter. Tutaj pokazujemy, że LA ma poważne konsekwencje dla drożdży, gdy ich replikacja jest niekontrolowana i że różnorodne wrodzone układy odpornościowe utrzymują replikację LA na tolerowanym poziomie. W szczególności pokazujemy, że w szczepach pozbawionych równolegle działających genów przeciwwirusowych NUC1 i SKI3 replikacja LA jest znacznie zwiększona, co prowadzi do stresu ortostatycznego i warunkowej śmiertelności w wysokich temperaturach. Wykorzystując to nowe odkrycie, wykorzystaliśmy badania bioinformatyczne i badania genetyczne w celu zidentyfikowania nowych genów drożdży, które ograniczają replikację LA lub chronią komórki przed patogennymi konsekwencjami nieograniczonej replikacji LA. Ponieważ te ekrany nie ulegały nasyceniu, genom drożdży prawdopodobnie koduje wiele innych czynników przeciwwirusowych. Przeprowadzono wiele wnikliwych badań na drożdżach, badając replikację egzogennie wprowadzonych wirusowych RNA z innych organizmów i interesujące będzie ustalenie, czy czynniki przeciwwirusowe LA działają podobnie na te wirusowe RNA (62, 63).

Biorąc pod uwagę wyraźne ryzyko infekcji LA, zastanawiające jest, w jaki sposób utrzymuje się ona w obliczu wszechobecnego działania przeciwwirusowego. Wyjaśnieniem tego paradoksu może być to, że LA zapewnia korzyść równoważącą. Jedną z możliwych korzyści LA jest to, że umożliwia niektórym szczepom utrzymanie wirusów satelitarnych kodujących wydzielane toksyny, które zabijają sąsiednie niezainfekowane komórki. Jednakże LA jest obecny w wielu szczepach pozbawionych satelitów „zabójczych”, więc to wyjaśnienie jest niewystarczające, aby wyjaśnić trwałość infekcji LA. W związku z tym spekulujemy, że LA może mieć jakąś tajemniczą korzyść, która równoważy jego szkodliwy potencjał.

Nasze odkrycie Rex2 jako czynnika osłabiającego wirusa rozszerza arsenał znanych mitochondrialnych czynników przeciwwirusowych poza Nuc1 i sugeruje, że mitochondria są kluczowym ośrodkiem przeciwwirusowym u drożdży. Rzeczywiście, mitochondria pełnią główną rolę w obronie wirusowej jako regulator zaprogramowanej śmierci komórki i platforma sygnalizacji przeciwwirusowej u ludzi. W jaki sposób nukleazy mitochondrialne osłabiają wirusa znajdującego się w cytozolu drożdży? Jedną z możliwości jest to, że enzymy te, chociaż są ukierunkowane na mitochondria, mogą mimo wszystko gromadzić się w cytozolu do niskiego, ale wystarczającego poziomu, aby bezpośrednio osiągnąć tłumienie LA. Zgodnie z tą hipotezą pokazaliśmy wcześniej, że Nuc1 gromadzi się w cytozolu komórek mejotycznych, chociaż naszymi metodami nie udało się wykryć tego w cytozolu komórek mitotycznych (27). Inna hipoteza głosi, że pewien aspekt cyklu replikacji LA zachodzi w ścisłym powiązaniu z mitochondriami. Na przykład transkrypty LA mogą łączyć się z mitochondriami i prawdopodobnie przez nie przechodzić, wystawiając je na działanie Nuc1 i/lub Rex2. Nasze wyniki podkreślają potencjalne ogólne znaczenie mitochondriów dla wrodzonej odporności wirusa u eukariontów i pozycjonują układ drożdże-LA jako potężny model do dalszych badań na ten temat.

Przeciwwirusowy kompleks SKI związany z translacją rybosomów i nasza identyfikacja Pab1, Sro9 i Slf1 jako supresorów o wysokiej liczbie kopii patogenezy LA dodatkowo ujawniają translujący rybosom jako kluczowy ośrodek aktywności przeciwwirusowej drożdży. Odkrycie, że PAB1 (białko wiążące poliA) tłumi LA, jest zaskakujące, biorąc pod uwagę brak ogonów poliA w transkryptach LA, co sugeruje, że Pab1 nie działa bezpośrednio na LA. Poprzednie odkrycia wykazały, że transkrypty LA konkurują z mRNA drożdży poliA+ o wychwytywanie podjednostek rybosomu 60S w celu utworzenia translacyjnych kompleksów 80S (64). Jednym z modeli wyjaśniających nasze odkrycia jest to, że Pab1 wzmacnia translację mRNA zawierających ogon poliA, co następnie wyczerpuje dostępność podjednostek 60S dla transkryptów LA do translacji. Role Sro9 i Slf1 w tłumaczeniu są mniej poznane, ale ich funkcje mogą w podobny sposób odnosić się do konkurencji transkryptów LA o podjednostki 60S. Co ważne, homologi Pab1 i Sro9/Slf1 biorą udział w ludzkiej obronie wirusowej, a dalsze badania tych genów u drożdży rzucą światło na mechanizmy przeciwwirusowe zachowane u drożdży u ludzi.

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

Zidentyfikowaliśmy przeciwwirusową rolę konserwatywnego czynnika transkrypcyjnego HSF1 wraz z indukowaną przez LA odpowiedzią na stres proteostatyczny obejmującą akumulację ognisk Hsp104-GFP, aktywowanego przez HSF1-markera agregatów białek cytotoksycznych. Wyniki te potwierdzają model, w którym patogeneza LA jest spowodowana stresem proteotoksycznym. Odkryliśmy także działanie przeciwwirusowe kompleksu SAGA, który, jak wykazano, działa jako koaktywator indukcji docelowego genu Hsf1 po szoku cieplnym (65, 66). Obserwacje te sugerują, że wysoki poziom LA prowadzi do zależnej od SAGA aktywacji docelowych genów Hsf1, które następnie pełnią funkcję przeciwwirusową, rzucając światło na potencjalny program ekspresji genów przeciwwirusowych w pączkujących drożdżach. Model ten umożliwia wiele testowalnych przewidywań, które mogą być istotne dla patogenezy wirusa w innych organizmach. Rzeczywiście, ludzki HSF1 kontroluje również ekspresję proteolitycznych czynników regulacyjnych. Chociaż opisano przeciwwirusowe funkcje ludzkiego HSF1, nie jest jasne, jaką rolę odgrywa w tym reakcja na stres ortostatyczny (39). Nasze odkrycia rzucają światło na potężny system pozwalający rozpoznać funkcję przeciwwirusową Hsf1 w odniesieniu do jego roli w aktywacji odpowiedzi na stres proteostatyczny.

Bibliografia

1. T. Nakayashiki, CP Kurtzman, HK Edskes, RB Wickner, Priony drożdżowe [URE3] i [PSI+] to choroby. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 102, 10575–10580 (2005).

2. RB Wickner, T. Fujimura, R. Esteban, Wirusy i priony Saccharomyces cerevisiae. Adw. Rozdzielczość wirusa 86, 1–36 (2013).

3. T. Fujimura, R. Esteban, Mechanizm wyrywania czapeczek w wirusie dwuniciowego RNA drożdży LA. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 108, 17667–17671 (2011).

4. JD Dinman, T. Icho, RB Wickner, A -1 rybosomalne przesunięcie ramki odczytu w dwuniciowym wirusie RNA drożdży tworzy białko fuzyjne gag-pol. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 88, 174–178 (1991).

5. A. Bernheim i wsp., Żmije prokariotyczne wytwarzają różnorodne cząsteczki przeciwwirusowe. Natura 589, 120–124 (2021).

6. A. Bernheim, R. Sorek, Ogólnoimmunologiczny układ bakterii: obrona przeciwwirusowa jako zasób społeczności. Nat. Ks. Mikrobiol. 18, 113–119 (2020).

7. AG Johnson i wsp., Twórcy bakterii odkrywają starożytny mechanizm śmierci komórki. Nauka 375, 221–225 (2022).

8. BR Morehouse i wsp., STING cykliczne wykrywanie dinukleotydów powstało w bakteriach. Natura 586, 429–433 (2020).

9. G. Ofir i in., Aktywność przeciwwirusowa bakteryjnych domen TIR poprzez cząsteczki sygnalizacji immunologicznej. Natura 600, 116–120 (2021).

10. KM Slavik i wsp., Receptory podobne do cGAS wyczuwają RNA i kontrolują sygnalizację 3'2'-cGAMP u Drosophila. Natura 597, 109–113 (2021).

11. AT Whiteley i wsp., Bakteryjne enzymy podobne do cGAS syntetyzują różnorodne sygnały nukleotydowe. Natura 567, 194–199 (2019).

12. HM Burgess, I. Mohr, Cellular 5'-3' egzonukleaza mRNA Xrn1 kontroluje akumulację dwuniciowego RNA i odpowiedzi przeciwwirusowe. Mikrob gospodarz komórkowy. 17, 332–344 (2015).

13. SC Eckard i wsp., Egzosom SKIV2L RNA ogranicza aktywację receptorów podobnych do RIG-I. Nat. Immunol. 15, 839–845 (2014).

14. M. Miyashita, H. Oshiumi, M. Matsumoto, T. Seya, DDX60, helikaza DEXD/H-box, to nowy czynnik przeciwwirusowy promujący sygnalizację za pośrednictwem receptora podobnego do RIG-I. Mol. Biol Komórkowy. 31, 3802–3819 (2011).

15. CS Ng, DM Kasumba, T. Fujita, H. Luo, Charakterystyka przestrzenno-czasowa aktywności przeciwwirusowej agregacji XRN1-DCP1/2 przeciwko cytoplazmatycznym wirusom RNA w celu zapobiegania śmierci komórek. Śmierć komórkowa różni się 27, 2363–2382 (2020).

16. RE Rigby, J. Rehwinkel, Degradacja RNA w odporności przeciwwirusowej i autoimmunizacji. Trendy Immunol. 36, 179–188 (2015).

17. F. Shiromoto i wsp., Indukcja ekspresji Ski2 za pośrednictwem IL-1beta/ATF3- nasila degradację mRNA wirusa zapalenia wątroby typu B. Biochemia. Biofizyka. Rozdzielczość komuna. 503, 1854–1860 (2018).

18. JT Brown, X. Bai, AW Johnson, Drożdżowe białka przeciwwirusowe Ski2p, Ski3p i Ski8p istnieją jako kompleks in vivo. RNA 6, 449–457 (2000).

19. DC Masison i in., Decoying the cap-mRNA degradation system by a doublestrand RNA wirus and poli(A)-mRNA monitoring by a drożdżowy system przeciwwirusowy. Mol. Biol Komórkowy. 15, 2763–2771 (1995).

20. C. Schmidt i wsp., The Cryo-EM Structure of a rybosom-Ski2-Ski3-Ski8 kompleksu helikazy. Nauka 354, 1431–1433 (2016).

21. AM Searfoss, RB Wickner, 3' poli(A) jest zbędne do tłumaczenia. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 97, 9133–9137 (2000).

22. EA Toh, P. Guerry, RB Wickner, Chromosomalne mutanty superkillera Saccharomyces cerevisiae. J. Bakteriol. 136, 1002–1007 (1978).

23. A. Zinoviev, RK Ayupov, IS Abaeva, CUT Hellen, TV Pestova, Ekstrakcja mRNA z zatrzymanych rybosomów przez kompleks narciarski. Mol. Komórka 77, 1340–1349 e1346 (2020).

24. SG Ball, C. Tirtiaux, RB Wickner, Genetyczna kontrola liczby kopii La i L-(Bc) Dsrna w systemach zabójczych SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Genetyka 107, 199–217 (1984).

25. R. Esteban, L. Vega, T. Fujimura, Narnawirus 20S RNA przeciwstawia się działaniu przeciwwirusowemu SKI1/XRN1 w Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 283, 25812–25820 (2008).

26. PA Rowley, B. Ho, S. Bushong, A. Johnson, SL Sawyer, XRN1 jest specyficznym gatunkowo wirusowym czynnikiem ograniczającym u drożdży. PLoS Pathog. 12, e1005890 (2016).

27. J. Gao i in., Mejotyczne atenuowanie wirusa poprzez przodkowy szlak apoptotyczny. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 116, 16454–16462 (2019).

28. LY Li, X. Luo, X. Wang, Endonukleaza G jest apoptotyczną DNazą po uwolnieniu z mitochondriów. Natura 412, 95–99 (2001).

29. BJ Thomson, Wirusy i apoptoza. Wewnętrzne J. Exp. Patol. 82, 65–76 (2001).

30. MD Eastwood, SW Cheung, KY Lee, J. Moffat, MD Meneghini, Programowane rozwojowo zniszczenie jądrowe podczas gametogenezy drożdży. Rozw. Komórka 23, 35–44 (2012).

31. MD Eastwood, MD Meneghini, Rozwojowa koordynacja różnicowania gamet z programowaną śmiercią komórek w drożdżach sporulujących. Komórka Eukariota 14, 858–867 (2015).

32. N. Schmidt i wsp., Interakcja RNA-białko SARS-CoV-2 w zakażonych ludzkich komórkach. Nat. Mikrobiol. 6, 339–353 (2021).

33. RW Smith, NK Gray, Białko wiążące poli(A) (PABP): Wspólny cel wirusowy. Biochemia. J. 426, 1–12 (2010).

34. R. Grover i wsp., Egzonukleaza Myg1 łączy programy translacyjne jądrowe i mitochondrialne poprzez przetwarzanie RNA. Kwasy nukleinowe Res. 47, 5852–5866 (2019).

35. EV Koonin, Konserwatywna starożytna domena dołącza do rosnącej nadrodziny egzonukleaz 3'-5. Aktualny Biol. 7, R604–606 (1997).

36. M. Szewczyk i wsp., Human REXO2 kontroluje krótkie mitochondrialne RNA generowane przez mechanizmy przetwarzania i rozpadu mtRNA, aby zapobiec gromadzeniu się dwuniciowego RNA. Kwasy nukleinowe Res. 48, 5572–5590 (2020).

37. Y. Zuo, MP Deutscher, Nadrodziny egzorybonukleaz: analiza strukturalna i dystrybucja filogenetyczna. Kwasy nukleinowe Res. 29, 1017–1026 (2001).

38. EW Trotter, L. Berenfeld, SA Krause, GA Petsko, JV Gray, Nieprawidłowe fałdowanie białek i wzrost temperatury powodują zatrzymanie G1 poprzez wspólny mechanizm zależny od współczynnika szoku cieplnego u Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 98, 7313–7318 (2001).

39. A. Reyes, AJ Navarro, B. Diethelm-Varela, AM Kalergis, PA Gonzalez, Czy HSF1 odgrywa rolę w infekcjach wirusowych? FEBS Open Bio 12, 1112–1124 (2022).

40. F. Weber, V. Wagner, SB Rasmussen, R. Hartmann, SR Paludan, Dwuniciowy RNA jest wytwarzany przez wirusy RNA o dodatniej nici i wirusy DNA, ale nie w wykrywalnych ilościach przez wirusy RNA o ujemnej nici. J. Wirol. 80, 5059–5064 (2006).

41. S. Welsch i in., Skład i trójwymiarowa architektura miejsc replikacji i montażu wirusa dengi. Mikrob gospodarz komórkowy. 5, 365–375 (2009).

42. I. Fernandez de Castro, R. Tenorio, C. Risco, Fabryki montażu wirusów w świecie lipidów. Aktualny Opinia. Wirol. 18, 20–26 (2016).

43. YX Liu, CL Dieckmann, Nadprodukcja cząstek wirusopodobnych drożdży przez szczepy z niedoborem nukleazy mitochondrialnej. Mol. Biol Komórkowy. 9, 3323–3331 (1989).

44. AW Johnson, RD Kolodner, Syntetyczna śmiertelność mutantów sep1 (xrn1) ski2 i sep1 (xrn1) ski3 Saccharomyces cerevisiae jest niezależna od wirusa zabójczego i sugeruje ogólną rolę tych genów w kontroli translacji. Mol. Biol Komórkowy. 15, 2719–2727 (1995).

45. C. Stark i in., BioGRID: Ogólne repozytorium zbiorów danych dotyczących interakcji. Kwasy nukleinowe Res. 34, D535–539 (2006).

46. ​​L. Espert i wsp., ISG20, nowa indukowana interferonem RNaza specyficzna dla jednoniciowego RNA, definiuje alternatywny szlak przeciwwirusowy przeciwko wirusom genomowym RNA. J. Biol. Chem. 278, 16151–16158 (2003).

47. T. Hanekamp, ​​PE Thorsness, YNT20, supresor obejściowy yme1 yme2, koduje przypuszczalną egzonukleazę 3'-5' zlokalizowaną w mitochondriach Saccharomyces cerevisiae. Aktualny Genet 34, 438–448 (1999).

48. A. van Hoof, P. Lennertz, R. Parker, Trzej konserwatywni członkowie rodziny RNaz D mają unikalne i nakładające się funkcje w przetwarzaniu RNA 5S, 5.8S, U4, U5, RNazy MRP i RNazy P w drożdżach . EMBO J. 19, 1357–1365 (2000).

49. M. Dwivedi, NC Laddha, R. Begum, Korelacja zwiększonej ekspresji MYG1 i jego polimorfizmu promotora z postępem choroby i wyższą podatnością u pacjentów z bielactwem nabytym. J. Dermatol. Nauka. 71, 195–202 (2013).

50. K. Kingo i wsp., MYG1, nowy gen powiązany z melanocytami, wykazuje podwyższoną ekspresję w bielactwie nabytym. J. Dermatol. Nauka. 44, 119–122 (2006).

51. IB Andika, A. Jamal, H. Kondo, N. Suzuki, kompleks SAGA pośredniczy w regulacji transkrypcji w górę wyciszania przeciwwirusowego RNA. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 114, E3499 – E3506 (2017).

52. SG Sobel, SL Wolin, Dwa białka zawierające motyw La drożdży to białka wiążące RNA, które łączą się z polirybosomami. Mol. Biol. Komórka 10, 3849–3862 (1999).

53. A. Proweller, JS Butler, Rybosomalne powiązanie białka wiążącego poli(A) w Saccharomyces cerevisiae z niedoborem poli(A). J. Biol. Chem. 271, 10859–10865 (1996).

54. DE Gordon i wsp., Mapa interakcji białek SARS-CoV-2 ujawnia cele w zakresie zmiany przeznaczenia leku. Natura 583, 459–468 (2020).

55. O. Brandman i in., Kompleks kontroli jakości związany z rybosomami wyzwala degradację powstających peptydów i sygnalizuje stres translacyjny. Komórka 151, 1042–1054 (2012).

56. J. Anckar, L. Sistonen, Regulacja funkcji HSF1 w odpowiedzi na stres cieplny: Implikacje w starzeniu się i chorobach. Annu. Ks. Biochem. 80, 1089–1115 (2011).

57. J. Li, J. Labbadia, RI Morimoto, Nowe podejście do HSF1 w stresie, rozwoju i zdrowiu organizmu. Trendy Cell Biol. 27, 895–905 (2017).

58. PK Sorger, HR Pelham, Oczyszczanie i charakterystyka białka wiążącego element szoku cieplnego z drożdży. EMBO J. 6, 3035–3041 (1987).

59. EJ Solis i wsp., Definiowanie podstawowej funkcji drożdży Hsf1 ujawnia zwarty program transkrypcyjny umożliwiający utrzymanie proteostazy eukariotycznej. Mol. Komórka 63, 60–71 (2016).

60. JR Glover, S. Lindquist, Hsp104, Hsp70 i Hsp40: Nowatorski system opiekuńczy, który ratuje wcześniej zagregowane białka. Komórka 94, 73–82 (1998).

61. Z. Li i in., Systematyczne badanie podstawowych funkcji genów drożdży za pomocą mutantów wrażliwych na temperaturę. Nat. Biotechnologia. 29, 361–367 (2011).

62. RY Zhao, Drożdże do badań nad wirusami. Mikrob. Komórka 4, 311–330 (2017).

63. T. Panavas, E. Serviene, J. Brasher, PD Nagy, Przesiew całego genomu drożdży ujawnia odmienne zestawy genów gospodarza wpływających na replikację wirusów RNA. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 102, 7326–7331 (2005).

64. Y. Ohtake, RB Wickner, Rozmnażanie się wirusa drożdży zależy krytycznie od stężenia wolnych podjednostek rybosomu 60S. Mol. Biol Komórkowy. 15, 2772–2781 (1995).

65. Kompleksy modyfikujące chromatynę SB Kremer, DS Gross, SAGA i Rpd3 dynamicznie regulują strukturę i ekspresję genów szoku cieplnego. J. Biol. Chem. 284, 32914–32931 (2009).

66. MD Leach i wsp., Hsf1 i Hsp90 organizują zależną od temperatury globalną przebudowę transkrypcji i architekturę chromatyny u Candida albicans. Nat. komuna. 7, 11704 (2016).

67. CS Sitron, JH Park, JM Giafaglione, O. Brandman, Agregacja ogonów CAT blokuje ich degradację i powoduje proteotoksyczność u S. cerevisiae. PLoS One 15, e0227841 (2020).

68. L. Magtanong i wsp., Sieci interakcji genetycznych z supresją dawki wzmacniają schematy okablowania funkcjonalnego komórki. Nat. Biotechnologia. 29, 505–511 (2011).

69. V. Bilanchone i wsp., Retrotranspozon Ty3 przejmuje łączenie ciał przetwarzających RNA drożdży w celu zainfekowania nowych genomów. PLoS Genet. 11, e1005528 (2015).

70. L. Ruan i in., Proteostaza cytozolowa poprzez import nieprawidłowo sfałdowanych białek do mitochondriów. Natura 543, 443–446 (2017).