Wpływ ekstraktów z Cistanche Tubulosa na funkcje rozrodcze samców u szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną i nikotynamidem-Ⅰ

1. Wstęp

Cukrzyca (DM) to stan, w którym występuje zwiększone ryzykopoziom glukozywe krwi ze względu na niewydolność trzustki w wytwarzaniu wystarczającej ilości insuliny lub niezdolność organizmu do jej skutecznego wykorzystania. Według WHO liczba chorych na cukrzycę wzrosła ze 108 mln w 1980 r. do 422 mln w 2014 r. [1]. Istnieją cztery główne kategorie: stan przedcukrzycowy (stan przed cukrzycą), typ 1 (w którym trzustka nie wytwarza insuliny), typ 2 (organizm nie wykorzystuje insuliny) i cukrzyca ciążowa (która występuje w czasie ciąży). Stres oksydacyjny występuje na skutek braku równowagi pomiędzy produkcją reaktywnych form tlenu (ROS) i przeciwutleniaczy [2], co ostatecznie prowadzi do stanu cukrzycowego. Powikłania cukrzycy obejmują niewydolność nerek, uszkodzenie nerwów, ślepotę, udar, zawał serca, śmierć płodu i niepłodność. [1]. Badania pokazują, że jądra plemników, kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) i mitochondria u mężczyzn chorych na cukrzycę uległy znacznemu uszkodzeniu [3]. Stres oksydacyjny podczas transportu nasienia zmieni proces męskiego układu rozrodczego [4,5].

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Proces spermatogenezy jest kontrolowany przez oś podwzgórze – przysadka – gonady (HPG). Hormon uwalniający gonadotropinę (GnRH) wytwarzany przez podwzgórze stymuluje wytwarzanie hormonu luteinizującego (LH) i hormonu folikulotropowego (FSH). Komórki Leydiga znajdują się w sąsiedztwie kanalików nasiennychprodukować testosteronpod kontrolą LH. FSH powoduje wytwarzanie białka wiążącego antygen (ABP), które pomaga w przekazywaniu męskiego hormonu. Zatem niepłodność i inne problemy powstają głównie na skutek zaburzeń zachodzących w osi HPG. Podawanie kombinacji streptozotocyny i nikotynamidu wywołuje cukrzycę u szczurów doświadczalnych. Streptozotocyna jest związkiem chemicznym toksycznym dla komórek trzustki wytwarzających insulinę, a nikotynamid jest rozpuszczalną w wodzie witaminą, która chroni komórki przed całkowitym uszkodzeniem [6].

Cistanche tubulosa to gatunek rośliny pustynnej, znany również jako „Rou Cong-Rong” [7]. Jest to niechlorofilowa roślina pasożytnicza, która rośnie głównie na korzeniu drzewa Calotropis procera i jest szeroko rozpowszechniona w suchych krainach Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolii, Iranie i Indiach. Powszechna nazwa Cistanche tubulosa to „Pustynny Hiacynt”. Jest szeroko akceptowany w tradycyjnej medycynie chińskiej i nadano mu nazwę „Żeń-szeń Pustyni”. Jest szeroko stosowany w medycynie w leczeniu chorobliwego leucorrhei, obfitego krwotoku macicznego, przewlekłych chorób nerek, zaparć, impotencji i niepłodności. Składniki chemiczneCistanche tubulosa składa się z nielotnych glikozydów fenyloetanoidowych(PHG), irydoidy, lignany, olejki lotne, alditole, oligosacharydy i polisacharydy [8]. Badania to pokazująechinakozydz tego zioła chroni uszkodzone fibroblasty regulując poziom ROS [9]. Związek ten wykazuje działanie przeciwutleniające, rozluźniające naczynia i przeciwzapalne, a także neuroprotekcję i zapobieganie osteoporozie [10,11].

Celem tego badania było zbadanie wpływuEkstrakt z Cistanche tubulosazawierający ECH na zaburzenia reprodukcyjne u szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną i nikotynamidem.

2. Materiały i metody

2.1. Materiały

ECH i CTE zakupiono od Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Tajwan). Końcowe produkty zaawansowanej glikacji (AGE) zakupiono od Biovision (San Francisco, Kalifornia, USA). Linie komórkowe LC-540 i TM3 zakupiono w Instytucie Badań i Rozwoju Przemysłu Spożywczego (Hsinchu, Tajwan). Pięciotygodniowe samce szczurów Sprague-Dawley (SD) zakupiono w National Laboratory Animal Center (Tajpej, Tajwan). Feed Lab Diet® zakupiono od PMI Nutrition International, Inc. (Tajpej, Tajwan). 2,2-difenylo-1-pikrylhydrazyl (DPPH) otrzymano z firmy Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanol i kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) również zakupiono od firmy Sigma. Pożywkę Eagle/F12 zmodyfikowaną przez Dulbecco i trypsynę-EDTA otrzymano od GIBCO (Nowy Jork, Nowy Jork, USA). 3-(4, 5-dimetylotiazol-2-yl)-2, 5-bromek difenylotetrazoliowy (MTT), dioctan dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA), sulfotlenek dimetylu (DMSO) i nitroniebieski tetrazol (NBT) zakupiono od firmy Sigma. Zestawy enzymatyczne glukozy otrzymano z Kyokutoseiyaku, Tokio, Japonia. Zestawy do testu insuliny ELISA zakupiono od Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Szwecja). Odczynnik do ekstrakcji białek tkankowych T-PER zakupiono od Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Przeciwciała poliklonalne przeciw ludzkiemu/mysiemu/szczurzemu czynnikowi jądrowemu-kappa B NF-κB zakupiono od Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA. Przeciwciała poliklonalne przeciwko receptorowi myszy/szczura dla końcowych produktów zaawansowanej glikacji (RAGE), przeciwciała poliklonalne przeciwko ludzkiemu/mysiemu/szczurzemu StAR i przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu/mysiemu/szczurzemu cytochromowi P450 17A1 zakupiono od Gene Tex (Irvine, Kalifornia, USA). Przeciwciała poliklonalne przeciwko ludzkiemu/mysiemu/szczurzemu CYP11A1 otrzymano z Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Odczynnik Easy-Blue zakupiono od Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, Kalifornia, USA). Agarozę i marker DNA o długości 100 bp otrzymano z Promega, Corporation (Madison, WI, USA). Zestaw RNeasy Lipid Tissue Mini Kit zakupiono w firmie QIAGEN, Hilden, Niemcy.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metody

2.2.1. Analiza in vitro

Hodowla komórkowa LC{0}} i TM3: Linie komórkowe LC-540 hodowano w temperaturze 37°C w pożywce Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) uzupełnionej wodorowęglanem sodu (1,5 g/l), L-glutamina (2 mM), niezbędne aminokwasy (0,1 mM), pirogronian sodu (1,0 mM) i płodowa surowica bydlęca (FBS) (10%) w Inkubator 5% CO2 (inkubator CO2, Napco 5410, Tajwan). Linię komórkową TM3 hodowano w pożywce Eagle'a modyfikowanej Dulbecco (DMEM) uzupełnionej glukozą (4,5 g/l), pirogronieniem sodu (0,5 mM), L-glutaminą (2,5 mM), wodorowęglanem sodu (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hydroksyetylo)-1-kwas piperazynoetanosulfonowy (HEPES, 15 mM) i płodowa surowica cielęca (FCS, 10%) lub surowica końska (5%) w temperaturze 37 ◦C w 5% Inkubator CO2.

Określanie żywotności komórekEchinakozyd (ECH)Do oznaczenia żywotności komórek zastosowano odczynnik: 3-(4, 5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5- bromek difenylotetrazoliowy (MTT). Stężenie komórek doprowadzono do 2 × 105 komórek/ml w płytce 96-studzienkowej. Następnie dodano 20 µl ECH (rozcieńczonego w 2% pożywki) i inkubowano przez 24 godziny w 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Później dodano 100 µl odczynnika MTT i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C w ciemnych warunkach. Absorbancję mierzono przy 570 nm (czytnik ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Szwajcaria).

Względna żywotność komórek (%)=[(Próbka przy 570 nm – Próbka ślepa przy 570 nm)]/[(Akontrola przy 570 – Próbka ślepa przy 570)] × 100.

Test redukcji nitrobu tetrazolu (NBT) i test 2,2-difenylu-1-pikrylhydrazylu (DPPH): Liczbę komórek doprowadzono do 1 × 1{{10}}6 komórek/ ml. Następnie dodano 50 mg/ml ECH, resweratrolu (RES) i produktów końcowych zaawansowanej glikacji (AGE) (kontrola) i wspólną hodowlę przez 18 godzin w temperaturze 37°C. Następnie dodano 0,3 ml roztworu NBT (0,1 mg/ml NBT, 5% FBS i 3% sulfotlenku dimetylu (DMSO) rozpuszczonego w 10 ml DMEM) i inkubowano w temperaturze 37°C w 5% CO2 przez 1 godzinę. Po odwirowaniu (przy 800 x g przez 3 minuty) supernatant usunięto, dodano 200 µl DMSO i wytrząsano przez 5 minut w oscylatorze ultradźwiękowym (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Tajwan). Absorbancję mierzono przy 630 nm. Do oznaczenia rodników DPPH jako standard przyjęto Trolox (w 95% alkoholu). Następnie 75 µl 0,5 mM roztworu DPPH zmieszano z 25 µl próbek i pozostawiono do przereagowania w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu na 30 minut. Mieszaninę wytrząsano i zmierzono absorbancję przy 517 nm.

Analiza zawartości reaktywnych form tlenu (ROS): Liczbę komórek doprowadzono do 2 × 105 komórek/ml w płytce 12-studzienkowej zawierającej 2% FBS. Następnie do płytki dodano 50 µl/ml ECH, RES i AGE i inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Po 24 godzinach dodano 2070 -dioctan dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po odwirowaniu (400 x g, 5 min) usunięto supernatant i komórki przemyto dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Następnie komórki zawieszono w 1 ml PBS i określono poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego (cytometr przepływowy, Becton Dickinson, Kalifornia, USA).

Identyfikacja i analiza ilościowa białka: Białka ekstrahowano przy użyciu odczynnika do ekstrakcji białek (T-PER). Gęstość komórek doprowadzono do 2 × 105 komórek/ml w płytce z 12-studzienkami i 50 µl/ml ECH, RES i receptora dla końcowego produktu zaawansowanej glikacji (RAGE), dodano i inkubowano AGE w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez 24 godziny. Następnie dodano 400 µl T-PER, zeskrobano komórki i wirowano przy 125,000× g przez 20 minut (4°C). Supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze -80°C (zamrażarka -80°C, Nuaire, Plymouth, MN, USA) do dalszej analizy. Do ilościowego oznaczenia białka zastosowano zestaw kwasu bicynchinowego (BCA). Następnie do płytek z dołkami 8-dodano 10 µl standardowego roztworu komórek i 200 µl odczynnika BCA i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez 30 minut. Absorbancję mierzono przy 562 nm. Analizę identyfikacyjną białek przeprowadzono metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE) z dodecylosiarczanem sodu (SDS)-żelem. Próbki przygotowano przez dodanie lizatu białka do buforu obciążającego białko i przeprowadzono analizę Western blot w celu wykrycia specyficznych białek.

2.2.2. Analiza in vivo

Projekt modelu zwierzęcego: Sześćdziesięciotygodniowe samce szczurów Sprague-Dawley (SD) zakupiono w National Laboratory Animal Center (Tajpej, Tajwan). Każdego szczura trzymano indywidualnie w klatkach ze stali nierdzewnej ze środkiem dezynfekującym w kontrolowanej temperaturze (23 ± 1°C) i wilgotności (40–60%), z cyklem 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Jedzenie i wodę zapewniano ad libitum. Każdego szczura udomowiono w pierwszym tygodniu i jako główną dietę podano laboratoryjną dietę gryzoni 5001. Wszystkie procedury były zgodne ze standardami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt (zatwierdzenie IACUC nr 101026) Narodowego Tajwańskiego Uniwersytetu Oceanicznego na Tajwanie. Po udomowieniu szczury podzielono na dwie grupy: grupę kontrolną (Con), która była karmiona dietą laboratoryjną 5001 i grupę chorych na cukrzycę, która przez cały eksperyment była karmiona dietą wysokotłuszczową (HFD, 40%). Po karmieniu HFD przez 4 tygodnie szczurom z grupy chorych na cukrzycę wstrzyknięto streptozotocynę (65 mg/kg) (STZ) w celu wywołania cukrzycy (DM). W ciągu 15 minut od wstrzyknięcia STZ wstrzyknięto nikotynamid (230 mg/kg masy ciała). Tydzień po wstrzyknięciu przeprowadzono doustny test tolerancji glukozy (OGTT), aby określić skuteczność wywołania cukrzycy (DM). Następnie zwierzęta podzielono na sześć grup: kontrolna (karmiona dietą laboratoryjną 5001); grupa DM (DM + 45% HFD); grupa DMR (DM + rozyglitazon: 0,571 mg/kg masy ciała) + 45% HFD; grupa DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg masy ciała) + 45% HFD; grupa DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg masy ciała) + 45% HFD; i grupa DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg masy ciała) + 45% HFD. Jako kontrolę pozytywną przyjęto rozyglitazon (RSG). Zastosowano trzy dawki CTE (80, 160 i 320 mg/kg) zgodnie z zaleceniami Tajwańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (TFDA) dotyczących oceny funkcjonalnej zdrowej żywności. Leczenie prowadzono do końca eksperymentu. Wszystkie szczury doświadczalne uśmiercono po 6 tygodniach. Krew pobraną od szczurów wirowano przy 3000 obr/min przez 15 minut w temperaturze 4°C. Supernatant zbadano w celu przeprowadzenia następującej analizy:

Oznaczanie całkowitego poziomu glukozy, trójglicerydów i cholesterolu: Oznaczenie glukozy przeprowadzono za pomocą zestawów enzymatycznych do pomiaru glukozy. Następnie do odczynników dodano 20 µl próbek osocza krwi i trzymano w temperaturze 37°C przez 5 min. Oznaczono stężenie trójglicerydów całkowitych i cholesterolu całkowitego za pomocą zestawów enzymatycznych do oznaczania triglicerydów i cholesterolu. Następnie do odczynników dodano 10 µl osocza krwi i przeprowadzono doświadczenie zgodnie z instrukcją producenta. Absorbancję mierzono przy 510 nm.

Całkowita glukoza/trójglicerydy/cholesterol w osoczu (mg/dL)=(Próbka – ABpusta)/(Astandard – ABpusta) × 200.

Przykład: Absorbancja próbek krwi, ABpusta: Wartość absorbancji zestawów bez próbki, Astandard: Wartość absorbancji odczynnika wzorcowego, 200: odczynniki wzorcowe w stężeniu 200 mg/dL.

Ocena modelu insuliny, leptyny i homeostazy – oznaczanie insulinooporności (HOMA-IR):Poziom insuliny oznaczano za pomocą zestawów insulinowych ELISA. Tutaj, 25µDodano l osocza krwiodczynników i absorbancję mierzono przy 450 nm. Całkowitą zawartość leptyny oznaczono za pomocą azestaw do immunometrycznego testu leptyny.Następnie 100µAnalizowano l osocza i absorbancjęmierzono przy 450 nm przy użyciu czytnika ELISA. Całość eksperymentu przeprowadzono wginstrukcje producenta. Wartość HOMA-IR określono na podstawie modelu homeostazyrównanie oceny=Stężenie insuliny w osoczu na czczo (mg/ml)× glukozy w osoczu na czczostężenia (mmol/l)/22,5.

Peroksydacja lipidów w osoczu: Tutaj {{0}},5 ml osocza krwi zmieszano z 1 ml odczynnika (15% wag./obj. kwasu trichlorooctowego w 0,25 N kwasie solnym (HCl ) i 0,375%, w/v kwasu tiobarbiturowego w 0,25 N HCl) i umieszczono w łaźni wodnej (Water Bath, BUCHI 461, Zurych, Szwajcaria) w temperaturze 100°C na 15 minut. Po ochłodzeniu dodano 1 ml n-butanolu, energicznie wytrząsano i wirowano przy 1500 x g przez 10 minut. Zebrano supernatant i zmierzono absorbancję przy 532 nm [12].

Stężenie dialdehydu malonowego (MDA) (nM/ml)=[(próbka przy 532 nm – próba ślepa przy 532 nm)/ (wzorzec przy 532 nm – próba ślepa przy 532 nm)] × 5.

standard przy 532 nm - Pusta przy 532 nm)] × 5. Oznaczanie poziomu testosteronu i hormonu luteinizującego (LH) w osoczu: Do pomiaru poziomu testosteronu w osoczu krwi stosowano zestaw testosteronu ELISA. Do oznaczenia stężenia LH wykorzystano zestaw RIA. Następnie dodano 50 µl osocza i obliczenia przeprowadzono na podstawie stężenia hormonu LH-RP-3 (standard). Dalsze kroki przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta.

Oznaczanie czynnika martwicy nowotworu (TNF) i interleukiny-6 (IL-6). Stężenie: Wychwycone przeciwciało rozcieńczono 250 razy w buforze do powlekania, dodano do 96- płytkę dołkową (100 µl/dołek) i trzymano w temperaturze 4°C przez noc. Supernatant odessano i przemyto pięć razy buforem do przemywania (1 raz PBS, 0,05% Tween 20). Po inkubacji (1 godz.) z 200 µg rozcieńczalnika do testu, komórki przemyto 5 razy buforem do przemywania i do każdej studzienki dodano 100 µl roztworu wzorcowego TNF lub próbek testowych i inkubowano przez 2 godziny. Po przemyciu dodano 100 µl przeciwciał wykrytych IL-6- i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Supernatant odessano i przemyto 5 razy. Następnie dodano 480 µl enzymu awidyna-peroksydaza chrzanowa (HRP) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant odessano i przemyto pięć razy buforem do przemywania. Następnie dodano 100 µl roztworu substratu i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Później do każdej studzienki dodano 50 µl roztworu zatrzymującego (1M kwas fosforowy) i zmierzono absorbancję przy 450 nm.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DO NAPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza parametrów plemników i jąder

Pobieranie próbki nasienia: Pobieranie próbki nasienia przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną wcześniej w [13]. Z supernatantu pobrano plemniki i wykorzystano je do dalszej analizy.

Liczba plemników, ruchliwość plemników i nieprawidłowe plemniki: Liczbę plemników obliczono za pomocą hemocytometru i roztworu błękitu trypanu. Następnie 100 µl płynu nasiennego zmieszano z roztworem błękitu trypanu i za pomocą hemocytometru i mikroskopu obliczono liczbę plemników, ruchliwość i nieprawidłowe plemniki [14].

Redukcja NBT z błękitem nitro i tetrazolem oraz peroksydacja lipidów w plemnikach i jądrach: Peroksydację lipidów i redukcję NBT analizowano zgodnie z tą samą procedurą, co w analizie osocza.

Oznaczanie dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i aktywności katalazy: Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) analizowano przy użyciu zestawu RANSEL. Tutaj {0}}.05 ml homogenatów jąder dodano do 1,7 ml roztworu reakcyjnego (0,05 mM ksantyny, 0,025 mM 2-({ {9}}jodofenylo)- 3-(4-nitrofenol)-5-chlorek fenylotetrazoliowy (INT)). Po wymieszaniu dodano 0,25 ml oksydazy ksantynowej (80 U/l) i reakcję przeprowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Absorbancję mierzono przy 505 nm. Stężenie białka w homogenacie jąder określono za pomocą zestawu do oznaczania białek Bio-Rad DC i obliczono jego aktywność właściwą (U/mg białka). Aktywność katalazy (CAT) oznaczano według wcześniej opisanej metody [15].

Barwienie H&E (hematoksylina i eozyna).

Jądro moczono w 10% formalinie przez 24 godziny i przechowywano w temperaturze 4°C. Tkanki były w rozmiarze mikro i przymocowane do szkiełka. Po utrwaleniu (95% metanol + 5% kwas octowy) szkiełka zanurzano w hematoksylinie na 3 minuty, przemywano pod bieżącą wodą przez 5 minut, a następnie moczono przez 50%, 70% i 90% alkohol jedna minuta. Następnie szkiełka barwiono eozyną przez 10 sekund i moczono w 100% alkoholu przez jedną minutę, aż do wyblaknięcia. Na koniec szkiełko moczono w ksylenie przez jedną minutę. Później szkiełko wysuszono na powietrzu i uszczelniono. Zabarwioną probówkę umieszczono w mikroskopie z odwróconym kontrastem fazowym (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japonia) w celu obserwacji morfologii.

Analiza podwzgórza

Z bazy danych genów NCBI (National Center for Biotechnology Information) zidentyfikowano mysie sekwencje genów KISS1, receptora sprzężonego z białkiem G (GPR) 54, supresora sygnalizacji cytokin 3 (SOCS-3) i sirtuiny 1 (SIRT1). i zaprojektowano specyficzny podkład przy użyciu Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, Kalifornia, USA.). Startery użyte w doświadczeniu wymieniono w tabeli 1.

Ekstrakcja kwasu rybonukleinowego (RNA) z podwzgórza. Ekstrakcję RNA z podwzgórza mózgu przeprowadzono przy użyciu zestawu RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Otrzymane mRNA mierzono ilościowo metodą odwrotnej transkrypcji (RT) i reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Komplement DNA uzyskany z analizy RT przechowywano w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Wyekstrahowany DNA poddano analizie metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu polimerazy Taq. Następnie pobrano 5~10 µl produktu PCR i analizowano metodą elektroforezy na 1,5% koloidie agarowym. Zdjęcie wykonano w systemie obrazowania UVP BioDoc-It. Pobrano komplementarny kwas deoksyrybonukleinowy (cDNA) z odwrotną transkrypcją i przeprowadzono PCR przy użyciu zestawu IQ SYBR Green Supermix Kit. Później analizowano go za pomocą oprogramowania iQTM 5 Optical System Software. Białka ekstrahowano przy użyciu odczynnika do ekstrakcji białek (T-PER). Następnie 20 mg homogenatu jąder dodano do 400 µl T-PER i odwirowano (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Niemcy) w temperaturze 4°C (125,000× g ) przez 20 minut. Następująca metoda była podobna do „analizy identyfikacyjnej i ilościowej białka” w analizie in vitro.

2.3. Analiza statystyczna

Wyniki eksperymentalne wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (średnia ± SD), a dane analizowano przy użyciu oprogramowania Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, Nowy Jork, NY, USA. Różnice między grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Wielokrotne porównania różnych grup analizowano testem Duncana przy wartości p < 0,05 jako poziomie istotnym.

3. Wyniki

3.1. Analiza in vitro

3.1.1. Porównanie aktywności przeciwutleniającej ECH, CTE i RES

Długoterminowe godzGłównymi przyczynami cukrzycy są wysoki stres oksydacyjny i przewlekłe stany zapalnepowikłania [16] CTE zawierają różneglikozydy fenyloetanoidowe, takie jak echinakozyd(ECH) i akteozydo potencjale działania przeciwutleniającego [17] Zmiatanie rodników DPPHprzeprowadzono test w celu oceny aktywności przeciwutleniającej ECH. Trolox i resweratrol(3,5,4'-trihydroksystilben, RES) przyjęto odpowiednio jako kontrolę standardową i pozytywną. Jak pokazanona rysunku1, ECH wykazała lepszą aktywność wychwytywania rodników, a aktywność była znacznie wyższaniż w przypadku kontroli dodatniej (RES).

3.1.2. Żywotność komórek ECH na komórkach LC-540 i TM3 Leydiga

Przeprowadzono test MTT w celu oceny żywotności komórek przy różnych stężeniach ECH. Komórki LC-540 Leydiga i TM3 Leydiga wykazały ponad 80% żywotności po potraktowaniu ECH (Rysunek 2). W porównaniu z innymi stężeniami, stężenie 100-µM (rozcieńczenia 100 µM w 2% FBS) ECH wykazało lepszą żywotność komórek w komórkach TM3 Leydiga. Wynik wskazał, że zwiększone stężenie ECH nie powoduje żadnej znaczącej toksyczności dla komórek.

3.1.3. Wpływ ECH na indukowaną AGE produkcję ponadtlenku w teście NBT w komórkach Leydiga LC-540 i TM3

AGE powodują uszkodzenia oksydacyjne w organizmie w wyniku utleniania glukozy i tworzenia wolnych rodników, takich jak O2-, rodniki hydroksylowe i grupy karbonylowe [18]. Po stymulacji 50 µg/ml AGE komórki LC-540 (Rysunek 3a) i TM3 (Rysunek 3b) potraktowano ECH i RES (5 µM i 10 µM każdy). Wyniki wykazały, że produkcja anionu ponadtlenkowego wzrosła w grupie kontrolnej (stymulowane AGE), ale produkcja anionu ponadtlenkowego spadła po grupie kontrolnej (stymulowane AGE), ale produkcja anionu ponadtlenkowego spadła po produkcji anionu ponadtlenkowego i chroniona komórki przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. W przypadku komórek LC-540 10 µM ECH wykazywało prawie podobną aktywność jak grupa normalna. Produkcja nadtlenku w obu ogniwach zmniejszała się wraz ze wzrostem stężenia zarówno ECH, jak i RES.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Wpływ ECH na produkcję H2O2 w komórkach Leydiga LC-540 stymulowanych AGE

Przeprowadzono test DCFH-DA w celu wykrycia obecności związków utleniających. Po przedostaniu się do komórek barwnik fluorescencyjny DCFH-DA ulega utlenieniu pod wpływem wewnątrzkomórkowego H2O2 i tworzy dichlorofluoresceinę (DCF). Jak pokazano na Figurze 4, nastąpił znaczny wzrost wewnątrzkomórkowego wytwarzania H2O2 w grupie stymulowanej AGE (kontrola), podczas gdy dodatek 10 µM ECH i RES znacząco zmniejszył wytwarzanie H2O2 w komórkach. Podanie 10 µM ECH spowodowało jedynie około 47,1% wytworzenia H2O2, znacznie mniej niż w grupie kontrolnej.

3.1.5. Wpływ ECH na poziomy ekspresji białek RAGE i NF-κB w komórkach Leydiga stymulowanych AGE LC-540

Przeprowadzono analizę Western blot w celu potwierdzenia obecności RAGE w komórkach LC-540 Leydiga. Wpływ ECH na poziomy ekspresji białek RAGE (ryc. 5a) i NF-κB (ryc. 5b) w komórkach Leydiga stymulowanych AGE pokazano na ryc. 5. Wyniki pokazały, że stężenie AGE 50 µg/ml indukowało wyższe RAGE i NF- Ekspresja κB w komórkach LC-540 Leydiga i 10 µM stężenie ECH i RES znacząco zmniejszały ekspresję RAGE i NF-κB. Ekspresja NF-κB była znacząco niższa w RES i ECH niż w antagonistach RAGE. Wyniki potwierdziły zatem, że ECH zmniejsza poziom stanu zapalnego poprzez zmniejszenie poziomu RAGE i NF-κB.

3.1.6. Wpływ ECH na szlak syntezy testosteronu w komórkach Leydiga stymulowanych AGE LC-540.

Proces spermatogenezy i niepłodność męska zależy od obecności testosteronu. Jak pokazano na ryc. 6, ekspresja białek StAR (ryc. 6a), CYP11A1 (ryc. 6b), CYP17A1 (ryc. 6c) i HSD17 3 (ryc. 6d) była znacząco zmniejszona w LC stymulowanym AGE{{11 }} Komórki Leydiga (grupa kontrolna). Ekspresja białek StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 znacznie wzrosła po dodaniu antagonisty RAGE, RES i ECH. Zwiększoną ekspresję białek StAR i CYP11A1 zaobserwowano zarówno w grupach leczonych ECH, jak i RES. Poziom ekspresji CYP17A1 był prawie podobny w grupach RES i ECH. Ekspresja białka HSD17 3 w komórkach Leydiga traktowanych ECH była znacznie wyższa niż w komórkach traktowanych antagonistami RES i RAGE. Zwiększona ekspresja białek StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 wskazuje na prawidłową produkcję testosteronu.