Wpływ ekstraktów z Cistanche Tubulosa na funkcje rozrodcze samców u szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną i nikotynamidem-Ⅱ

3.2. Analiza in vivo

3.2.1. Wpływ CTE na masę ciała i spożycie kalorii

Po 6 tygodniach eksperymentów grupa chorych na cukrzycę (HFD-DM) wykazała większą masę ciała niż grupa kontrolna. Grupa HFD-DME4 wykazywała niższą masę ciała niż grupy HFD-DM i HFD-DMER (ryc. 7a). Spożycie kalorii w grupie kontrolnej było istotnie niższe niż w pozostałych grupach. Nie było znaczącej różnicy między spożyciem kalorii w pozostałych pięciu grupach (ryc. 7b).

3.2.2. Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) w celu określenia skutecznej indukcji cukrzycy

Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) jest obiecującym narzędziem do wykrywania cukrzycy. Podwyższony poziom glukozy we krwi wskazuje na stan cukrzycowy. Jak pokazano na Rycinie 8a, poziom glukozy w osoczu był niższy w grupach CTE niż w grupie DM po 0, 30, 90 i 120 minutach. Ponadto pole pod krzywą (AUC) stężenia glukozy w osoczu pokazało, że w grupach CTE i RSG szybkość wychwytu glukozy we krwi wzrosła (ryc. 8b).

3.2.3. Całkowita zawartość glukozy, cholesterolu i trójglicerydów w osoczu

Stężenie glukozy we krwi na czczo było wyższe w grupie DM i niższe w grupie DME2 (z wyjątkiem kontroli) niż w pozostałych grupach. Nie było istotnej różnicy w całkowitym cholesterolu pomiędzy grupami, z wyjątkiem grupy DME4. W grupie DME4 poziom cholesterolu był niższy niż w pozostałych. Poziom triglicerydów był wyższy w grupie DM i niższy w grupie DME4, a zawartość trójglicerydów malała wraz ze wzrostem stężenia CTE (tab. 2). Wyniki pokazują, że poziom glukozy, cholesterolu i trójglicerydów w osoczu był wyższy w grupie DM, a poziom znacznie się obniżył po leczeniu CTE.

3.2.4. Poziom insuliny w osoczu, poziom leptyny w osoczu i ocena modelu homeostazy – wartości insulinooporności (HOMA-IR)

Poziomy insuliny, leptyny i HOMA-IR w osoczu przedstawiono w Tabeli 3. Grupa DM miała wyższe poziomy insuliny i leptyny w osoczu niż grupa kontrolna. W grupie DM istotnie wyższy był także wskaźnik HOMA-IR. Wartości insuliny, leptyny i HOMA-IR w osoczu zmniejszały się wraz ze wzrostem stężenia CTE. Poziom leptyny w osoczu był znacząco obniżony w grupach CTE, ale w grupie otrzymującej lek RSG (DMR) nie wykazano żadnej znaczącej różnicy w porównaniu z grupą DM.

3.2.5. Wpływ CTE na poziom LH i testosteronu w osoczu u szczurów z cukrzycą

Jak pokazano w Tabeli 4, stężenia testosteronu u szczurów z cukrzycą (DM) były znacząco obniżone, podczas gdyznacząco wzrosło stężenie testosteronuprzy różnych dawkach CTE. Ponadto wyniki wykazały niewielki spadek poziomu LH w grupie DM w porównaniu z DMR, DME1, DME2 i DME4. Produkcja LH była wyższa w grupie DME4.

3.2.6. Wpływ CTE na parametry nasienia szczurów z cukrzycą

Wyniki eksperymentów wykazały, że w grupie DM zaobserwowano znaczny spadek liczby i ruchliwości plemników w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy w grupie DM znacząco wzrosła częstość występowania nieprawidłowości w plemnikach. Co ciekawe, liczba plemników, ruchliwość plemników i odsetek nieprawidłowości plemników w grupie DMR poprawiły się, ale ruchliwość plemników nie osiągnęła znaczącego poziomu w porównaniu z DME4. DME2 wykazało lepszą liczbę plemników niż wszystkie, a ruchliwość była znacząco zwiększona w grupie DME4. Nie było istotnej różnicy pomiędzy liczbą nieprawidłowych plemników pomiędzy grupami leczonymi RSG i CTE (Tabela 5).

3.2.7. Wpływ CTE na morfologię kanalików nasiennych u szczurów z cukrzycą

Figura 9 przedstawia barwienie H&E przekroju jądra. Czarna strzałka oznacza komórkę Leydiga, a biała strzałka oznacza komórkę Sertoliego. Zarówno komórka Leydiga, jak i komórka Sertoliego w grupie DM wykazywały znaczną atrofię, a w świetle widoczna była jama. W grupach leczonych CTE i RSG przywrócono strukturę komórek Leydiga i Sertoliego. Grubość kanalików nasiennych była większa w grupach CTE i RSG niż w grupie DM.

3.2.8. Wpływ CTE na mRNA KiSS1, GPR54, SOCS-3 i SIRT1 w podwzgórzu szczurów z cukrzycą

Ekspresję KiSS1 (ryc. 10a), GPR54 (ryc. 10b), SOCS-3 (ryc. 10d) i SIRT1 (ryc. 10c) pokazano na ryc. 10. Ekspresję mRNA KiSS1 i receptora GPR54 u szczurów z cukrzycą znacznie niższe niż w grupie kontrolnej. Poziomy ekspresji mRNA KiSS1 i GPR 54 w DMR, DME1, DME2 i DME4 znacznie wzrosły. W szczególności ekspresja mRNA GPR54 była znacząco zwiększona w DME4 i była prawie podobna do grupy kontrolnej.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA OCHRONY PRODUKCJI TESTOSTERONU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

W tym eksperymencie dokładniej zbadano ilość mRNA SOCS-3 i SIRT1 w podwzgórzu szczurów. Ekspresja mRNA SOCS-3 u szczurów z cukrzycą znacznie wzrosła, co wskazuje, że impedancja leptyny była poważniejsza. Grupy DMR, DME1, DME2 i DME4 wykazały znaczną poprawę w porównaniu z grupą chorych na cukrzycę. Ekspresja mRNA SIRT1 w grupie DM znacznie spadła i znacznie wzrosła w grupach DME1 i DME4.

3.2.9. Wpływ CTE na enzymy przeciwutleniające w osoczu i jądrach szczurów z cukrzycą

Tabela 6 pokazuje, że aktywność SOD w osoczu, aktywność GPx i aktywność katalazy u szczurów z cukrzycą znacznie spadła, a aktywność wzrosła w grupach leczonych CTE i RSG. Oprócz tego DME4 wykazał znaczną poprawę aktywności GPx w porównaniu z innymi. Wyniki wykazały, że aktywność SOD i katalazy u szczurów z cukrzycą znacznie spadła po sześciu tygodniach. Aktywność SOD i katalazy grupy DMR nie osiąga znaczącego poziomu. Grupy leczone CTE wykazały znaczną poprawę aktywności SOD i katalazy. Zwiększoną aktywność katalazy i SOD w grupach CTE zaobserwowano także w jądrach (Tabela 7). Największą aktywność SOD i katalazy zaobserwowano odpowiednio w grupie DME1 i DME2.

3.2.10. Wpływ CTE na stres oksydacyjny i stan zapalny w osoczu i jądrach szczurów z cukrzycą

Wytwarzanie tlenku azotu (NO) w osoczu (ryc. 11a) i jądrach (ryc. 11b) przedstawiono na ryc. 11. Produkcja NO w grupie DM była istotnie zwiększona zarówno w jądrach, jak i w osoczu w porównaniu z grupą kontrolną. Stopniowe zmniejszenie wytwarzania NO zaobserwowano w grupach DME1, DME2 i DME4 (w osoczu). Grupa DMR również wykazała znaczną redukcję produkcji NO. W przypadku jąder zaobserwowano nieznaczne zmniejszenie wytwarzania NO w grupach CTE, natomiast w grupie DMR nie zaobserwowano istotnego zmniejszenia wytwarzania NO.

Jak pokazano na Rycinach 12 i 13, poziomy TNF- i IL-6 były znacząco podwyższone u szczurów z cukrzycą (zarówno w osoczu, jak i w jądrach), co wskazuje, że zapalenie jest poważniejsze. W osoczu poziom TNF- jest podobny w grupach leczonych CTE i RSG (ryc. 12a). Grupy CTE znacząco (zwłaszcza DME2) obniżyły poziom TNF- w jądrach (ryc. 12b). Poziom IL-6 był znacząco obniżony w osoczu w grupach CTE i RSG (ryc. 13a). W jądrach występowała tendencja do obniżania poziomu IL-6, ale nie osiągnęła ona poziomu znaczącego (ryc. 13b).

3.2.1.1. Wpływ CTE na stres oksydacyjny i stan zapalny w plemnikach szczurów z cukrzycą wywołany dietą wysokotłuszczową

Figura 14 przedstawia zawartość anionu ponadtlenkowego w nasieniu szczura. Wyniki wykazały, że produkcja anionu ponadtlenkowego w nasieniu szczurów z cukrzycą znacznie wzrosła, natomiast w grupie DMR nie zaobserwowano istotnej poprawy. Grupy DME1 i DME4 wykazały znacząco zmniejszoną produkcję anionu ponadtlenkowego.

3.2.12. Wpływ CTE na peroksydację lipidów w plemnikach szczurów z cukrzycą wywołaną dietą wysokotłuszczową

Badania wykazały, że peroksydacja lipidów była zwiększona zarówno u chorych na cukrzycę typu 1, jak i typu 2 [19]. Poziom dialdehydu malonowego (MDA) w osoczu, nasieniu i jądrach przedstawiono w Tabeli 8. Poziom MDA w osoczu, jądrach i plemnikach w grupie DM był istotnie wyższy, a leczenie CTE i RSG zmniejszało wytwarzanie MDA. Znaczące zmniejszenie zaobserwowano w grupach DME4 i DMEI w osoczu. Badanie to wykazało, że szczury z cukrzycą nie tylko zwiększyły stopień peroksydacji lipidów w osoczu, ale także zwiększyły stopień peroksydacji lipidów w osoczu, ale także zwiększyły się w jądrach i plemnikach. Znaczącą poprawę zaobserwowano przy różnych dawkach CTE.

4. Dyskusja

Cukrzyca jest chorobą przewlekłą związaną z wysokim poziomem cukru we krwi. Brak równowagi pomiędzy poziomem przeciwutleniaczy i ROS doprowadzi do stanu zwanego stresem oksydacyjnym. Nadtlenek, rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru, tlenek azotu i tlen singletowy to tylko niektóre przykłady RFT, które poprzez stres oksydacyjny przyczyniają się do rozwoju cukrzycy [20].Cistanche tubulosato roślina pustynna zawierająca aktywne składniki takie jakpolisacharydy, oligosacharydy, glikozydy fenyloetanoidowe (echinakozyd, werbaskozyd), kwas palmitynowy, kwas linolowy, irydoidy, alditole i lignany. Roślina ta ma zdolność wywoływania działania przeciwzapalnego, neuroprotekcyjnego, przeciwbakteryjnego, przeciwwirusowego, przeciwutleniającego, przeciwnowotworowego i immunomodulującego [21]. Badania literaturowe wskazują, że glikozydy fenyloetanoidowe z Cistanche tubulosa są główną przyczyną działania przeciwutleniającego [22]. Resweratrol (RES) i rozyglitazon (RSG) przyjęto jako kontrolę pozytywną odpowiednio w badaniach in vitro i in vivo. RSG jest silnym środkiem uwrażliwiającym na insulinę i ma powinowactwo do izoformy receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARc). Kontroluje hiperglikemię u chorych na cukrzycę [23]. RES ma naturalną aktywność przeciwutleniającą i działa jako środek rozszerzający naczynia krwionośne, regulujący metabolizm lipoprotein, hamujący agregację płytek krwi i zapobiegający nowotworom [24,25]. Nasze badanie wykazało, że ECH wykazuje lepszą aktywność wychwytywania rodników niż CTE i RES (rysunek 1). Rozumie się również, że ECH nie powoduje żadnej znaczącej toksyczności wobec komórek LC-540 i TM3 Leydiga (Figura 2).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA MĘSKICH FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE wykorzystano do wywołania warunków stresowych w komórkach Leydiga. Produkcja AGE, stany zapalne, stres oksydacyjny i cukrzyca są ze sobą powiązane. Hiperglikemiczny stan cukrzycy sprzyja uszkodzeniom komórek poprzez produkcję AGE i stres oksydacyjny. AGE indukują toksyczność komórkową, co dodatkowo sprzyja rekrutacji komórek odpornościowych i śmierci komórek. Podwyższony poziom AGE sprzyja ekspresji dwóch typów receptorów zwanych RAGE i AGER1 [26]. Kapanie, a następnie przeniesienie elektronu z mitochondrialnego łańcucha oddechowego do tlenu cząsteczkowego podczas stresu oksydacyjnego powoduje utworzenie anionu ponadtlenkowego. Nasze wyniki pokazują, że produkcja anionu ponadtlenkowego indukowana przez AGE wzrosła w grupie kontrolnej, a dalszą poprawę zaobserwowano zarówno w przypadku leczenia ECH, jak i RES. Z naszego badania wynika, że ​​produkcja ponadtlenku (ryc. 3) i H2O2 (ryc. 4) indukowana przez AGE zmniejsza się w obecności ECH i RES.

NF-κB jest znany jako ważny mediator stanu zapalnego związanego z cukrzycą [27]. Ekspresja NF-κB prowadzi do dysfunkcji komórek i śmierci komórek. Aktywacja NF-κB przez stres oksydacyjny stymuluje odpowiedź prozapalną, regulację w górę endoteliny i apoptozę [28]. Ekspresja RAGE i NF-κB wzrosła w grupach stymulowanych AGE, a późniejsze zmniejszenie zaobserwowano w komórkach traktowanych ECH i RES (Figura 5).

Testosteronjest sterydem anabolicznym i podstawowymmęski hormon płciowysyntetyzowany z cholesterolu. Proces rozpoczyna się od oksydacyjnego rozszczepienia łańcucha bocznego cholesterolu przez gen rozszczepiający łańcuch boczny cholesterolu (CYP11A). Gen ten zlokalizowany jest w błonie mitochondrialnej i przekształca cholesterol w pregnenolon. Następnie gen CYP17A1 z siateczki śródplazmatycznej usuwa dwa dodatkowe atomy węgla i wytwarza wiele steroidów C19. Oprócz tego pregnenolon jest utleniany do androstendionu/progesteronu przez dehydrogenazę hydroksysteroidową (3- -HSD). Wreszcie testosteron jest wytwarzany przez redukcję grupy ketonowej w 17. pozycji węgla androstendionu przez 17-dehydrogenazę beta-hydroksysteroidową (17- -HSD). Komórki Leydiga biorą udział w głównej produkcji testosteronu. Przeniesienie cholesterolu do wewnętrznej błony mitochondrialnej wymaga działania steroidogennego ostrego białka regulatorowego (StAR). Obecne badania pokazują, że ekspresja StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 zmniejszyła się w komórkach traktowanych AGE (kontrola), a w komórkach traktowanych ECH i RES zaobserwowano ogromny wzrost (ryc. 6). . Zatem wyniki pokazują, że produkcjapoziom testosteronu wzrósł w grupach leczonych ECH i RES. 

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY SIŁY SEKSUALNEJ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

W chorobie cukrzycowej transport glukozy do narządów jest ograniczony, w efekcie czego wzrasta jej stężenie [29]. Dlatego stan hiperglikemii jest jednym z ważnych markerów wykrywania cukrzycy. Nasze badania pokazują, że w grupach chorych na cukrzycę poziom glukozy w osoczu był podwyższony, a AUC w grupie DM było istotnie wyższe niż w pozostałych grupach (ryc. 8). Wraz z glukozą w osoczu, w grupie DM istotnie wzrosła zawartość cholesterolu całkowitego i trójglicerydów (tab. 2). Miażdżycy sprzyja podwyższony poziom cholesterolu i trójglicerydów [30]. Jednakże poziom cholesterolu i trójglicerydów był obniżony w grupach leczonych CTE i RSG. Zawartość trójglicerydów w grupie DME4 osiągnęła wartości prawie podobne do grupy kontrolnej.

Insulina to hormon wytwarzany przez komórki trzustki i funkcjonalny w celu kontrolowania poziomu cukru we krwi w organizmie, natomiast leptyna to hormon wytwarzany przez adipocyty, które są zdolne do regulowania przyjmowania pokarmu i wykorzystania energii. Badania wykazały, że leptyna bierze udział w patofizjologii otyłości i istnieje pozytywna interakcja pomiędzy leptyną i insuliną [31]. Z naszych badań wynika, że ​​w grupie chorych na DM stężenie inuliny i leptyny w osoczu było wyższe, natomiast poziom insuliny spadał wraz ze wzrostem stężenia CTE. Grupa RSG nie wykazuje żadnej istotnej różnicy w porównaniu z grupą DM. Insulinooporność i czynność komórek oceniano metodą HOMA-IR. Wartość HOMA-IR wzrosła w grupie DM i różniła się istotnie od pozostałych grup (tab. 3).

Cukrzyca wpływa na funkcje rozrodcze poprzez zmiany hormonalne w osi HPG, a badania wykazały, że cukrzyca wpływa również na ekspresję insuliny w jądrach. Charakteryzuje się wakuolizacją komórek Sertoliego, zwiększoną fragmentacją DNA, upośledzoną spermatogenezą i zwiększoną utratą komórek rozrodczych. Stres oksydacyjny przyczynia się również do zaburzeń funkcji rozrodczych [32]. Proces powstawania plemników w męskim narządzie rozrodczym (jądrach) nazywa się spermatogenezą. Jądro składa się z ciasno zwiniętych kanalików zwanych kanalikami nasiennymi. Komórki Sertolego są widoczne w ścianach kanalików nasiennych i zapewniają pożywienie niedojrzałym plemnikom. Badania parametrów plemników wykazały zmniejszenie liczby i ruchliwości plemników oraz zwiększenie liczby nieprawidłowości w grupie DM (tab. 5). Odwrotny efekt zaobserwowano w grupach leczonych CTE i RSG. Zarówno komórki Leydiga, jak i komórki Sertoliego w grupie DM wykazywały znaczną atrofię, a ubytek był widoczny w świetle. Grubość kanalików nasiennych również zmniejszyła się w grupie DM. Lepszy wynik zaobserwowano w grupach leczonych CTE i RSG (ryc. 9). Oprócz tego poziom LH i testosteronu obniżył się w grupie DM, a poziom wzrósł w grupach leczonych CTE (Tabela 4). U mężczyzn niski poziom testosteronu w surowicy i niższa częstotliwość tętna LH często wiązały się z otyłością i cukrzycą typu 2 [33].

Kisspeptyny kodowane przez gen KiSS1 są znane jako silny stymulator osi HPG, a każda mutacja w genie Kisspeptyny będzie prowadzić do niskiego poziomu steroidów płciowych i gonadotropin. Badania pokazują, że u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ poziom mRNA Kiss1 był obniżony [33]. Zapoczątkowanie i utrzymanie niepłodności u ssaków jest związane z receptorem 54 sprzężonym z białkiem G (GPR54). Mutacja w GPR 54 charakteryzuje się brakiem dojrzewania płciowego i niskim poziomem hormonów gonadotropowych (LH i FSH). Cytokiny prozapalne, takie jak IL-6 i TNF-, regulują w górę ekspresję supresora sygnalizacji cytokin 3 (SOCS3) związanego z insulinoopornością za pośrednictwem zapalenia w wątrobie i adipocytach [34]. SIRT 1 to gen powiązany z regulacją kilku chorób związanych ze starzeniem się. Gen ten ulega znacznej ekspresji w komórkach trzustki i reguluje wydzielanie insuliny oraz zapobiega apoptozie. Obecne badania wykazały, że ekspresja KiSS1, GPR54 i SIRT1 spadła w grupie DM, ale ekspresja wzrosła w grupach leczonych CTE (ryc. 10). Wzrost ekspresji SOCS-3 w grupie DM wskazuje na stan zapalny. Pierwszym powiązaniem molekularnym zidentyfikowanym pomiędzy otyłością a stanem zapalnym był TNF-. Dlatego podwyższony poziom TNF- jest wskaźnikiem stanu zapalnego. W grupach leczonych CTE zaobserwowano obniżony poziom cytokin prozapalnych, takich jak TNF i IL-6 (ryc. 12 i 13).

Brak równowagi pomiędzy ROS i przeciwutleniaczami prowadzi do stanu cukrzycowego. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT) i peroksydaza glutationowa (GPX) są znane jako główne przeciwutleniacze odpowiedzialne za utrzymanie optymalnego poziomu RFT [35]. Na podstawie wyników stwierdzono, że aktywność przeciwutleniaczy była istotnie niższa w grupie DM. Grupy leczone CT wykazały poprawę w produkcji przeciwutleniaczy. Grupa leczona RSG nie wykazała żadnej znaczącej poprawy aktywności przeciwutleniającej (Tabele 6 i 7).

Tlenek azotu (NO) jest znany jako ważny ROS, który przyczynia się do stanu zapalnego. Nasze badania wskazują, że w grupach leczonych CTE poziom NO był obniżony (ryc. 11). Wyniki wykazały, że zawartość anionu ponadtlenkowego w nasieniu szczurów z cukrzycą znacznie wzrosła i nie zaobserwowano istotnej poprawy po podaniu RSG. W grupach CTE wytwarzanie nadtlenku było zmniejszone.

Oznaczenie MDA jest bardzo przydatne do oceny peroksydacji lipidów. Peroksydacja lipidów to proces utleniania lipidów, który ostatecznie prowadzi do uszkodzenia komórek. MDA powstaje w wyniku peroksydacji lipidów wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Badania wykazują, że poziom MDA jest skorelowany z wiekiem i poziomem glukozy we krwi na czczo [36]. Obecne badanie wykazało, że CTE poprawia peroksydację lipidów w osoczu, jądrach i plemnikach (Tabela 8).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Wnioski

Stres oksydacyjny podczas cukrzycy zaburza męski układ rozrodczy poprzez uszkodzenie nasienia i dysfunkcję gonad. Cistanche tubulosa to roślina pustynna szeroko akceptowana w medycynie chińskiej ze względu na swoje działanie farmakologiczne.Echinakozyd (ECH)jest głównym składnikiem CTE odpowiedzialnym za jego działanie przeciwutleniające i przeciwzapalne. Nasze wyniki in vitro wykazały, że ECH przywróciła szlak syntezy testosteronu i obniżyła poziom ekspresji białka NF-κB i RAGE. ECH skutecznie hamowała wytwarzanie anionu ponadtlenkowego i H2O2 w komórkach Leydiga. Badania in vivo wykazały, że ECH obniża poziom cholesterolu, trójglicerydów, TNF- i IL-6. Oprócz tego ekspresja mRNA w podwzgórzu szczurów z cukrzycą uległa znacznej poprawie. Warto również zauważyć, że ECH zmniejszał peroksydację lipidów i poprawiał insulinooporność u samców szczurów z cukrzycą. Aktywność przeciwutleniająca wzrosła zarówno w osoczu, jak i w jądrach. Dlatego nasze badania sugerują, że ECH zapewnia skuteczną ochronę przed dysfunkcjami rozrodczymi u samców szczurów z cukrzycą wywołaną STZ.