Wpływ szczepienia kurcząt na rozwój i trwałość odporności Część 1

Abstrakcyjny:

Choroba układu oddechowego ptaków powoduje znaczne straty ekonomiczne u drobiu komercyjnego. Ze względu na konieczność ochrony długowiecznego drobiu przed patogenami układu oddechowego od najmłodszych lat, programy szczepień kurcząt zazwyczaj obejmują seryjne podawanie różnych szczepionek, w tym przeciwko wirusowi zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV), wirusowi rzekomego pomoru drobiu (NDV) i zakaźnym wirus zapalenia krtani i tchawicy (ILTV). Często przerwa między szczepieniami to tylko kwestia tygodni, ale nie wiadomo, czy u tych ptaków dochodzi do rozwoju odporności i ochrony przed prowokacją, gdy szczepionki są podawane w krótkich odstępach czasu, co jest znane jako interferencja wirusowa. Naszym celem było ustalenie, czy podawane seryjnie żywe atenuowane szczepionki przeciwko IBV, NDV i ILTV wpływają na rozwój i długowieczność odporności oraz ochronę przed prowokacjami u długowiecznych ptaków.

W oparciu o typowy program szczepień kur, wolne od specyficznych patogenów białe leghorny podawano wiele żywych atenuowanych szczepionek przeciwko IBV, NDV i ILTV do 16 tygodnia życia (WOA), po czym niektóre grupy poddano prowokacji IBV, NDV lub ILTV w 20, 24, 28, 32 i 36 WOA. Pięć dni po prowokacji oceniano miano wirusa, objawy kliniczne, kriostazę, histopatologię tchawicy i miana przeciwciał w surowicy i łzach. Wykazaliśmy, że kurczęta, którym seryjnie podawano żywe atenuowane szczepionki przeciwko IBV, NDV i ILTV, były chronione przed homologiczną prowokacją IBV, NDV lub ILTV przez co najmniej 36 tygodni i dochodzimy do wniosku, że przerwa między szczepieniami zastosowana w tym badaniu (co najmniej 2 tygodnie ) nie ingerował w ochronę. Ta informacja jest ważna, ponieważ pokazuje, że typowy program szczepień kurcząt składający się z seryjnie podawanych żywych atenuowanych szczepionek przeciwko wielu patogenom układu oddechowego może skutkować rozwojem odporności ochronnej przeciwko każdemu czynnikowi chorobotwórczemu.

Mówiąc o odporności, organizm ludzki ma również wiele rzeczy, które mogą poprawić odporność, takich jak Cistanche, który jest również bogaty w substancje biologicznie czynne, takie jak peptydy, terpeny, kwasy fenolowe itp., które mogą stymulować aktywację komórek odpornościowych i poprawić komórki odpornościowe. działają i wzmacniają odporność organizmu. Te biologicznie czynne substancje mogą również regulować i aktywować funkcje autoimmunologiczne organizmu, dodatkowo poprawiając odporność człowieka.

Kliknij, kiedy wziąć cistanche

Słowa kluczowe:

wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli; wirus choroby Newcastle; wirus zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy; program szczepień; odporność; choroba układu oddechowego; kriostaza; odpowiedź przeciwciał.

1. Wstęp

Szczepienie przeciwko wirusowym chorobom układu oddechowego jest standardową praktyką w komercyjnych hodowlach drobiu. Zarówno żywe, jak i zabite szczepionki są podawane drobiowi, a żywe szczepionki są powszechnie stosowane przeciwko różnym patogenom, ponieważ są skuteczne, gdy są stosowane masowo i są stosunkowo ekonomiczne [1]. Ogólnie rzecz biorąc, żywe szczepionki indukują odporność miejscową i komórkową oraz zapewniają szerszą odpowiedź ochronną niż szczepionki zabite, podczas gdy szczepionki zabite przede wszystkim indukują odporność humoralną i mają tendencję do swoistości względem antygenu. Czas trwania odporności uzyskanej po podaniu żywej szczepionki zależy od wieku i gatunku ptaka, poziomu odporności matki, choroby będącej celem szczepionki, immunogenności szczepionki, sposobu podania szczepionki, liczby dawek przypominających i odstępów między dawkami przypominającymi, wirulencji i podobieństwa wirusa prowokacji terenowej, przerwy między szczepieniem a prowokacją oraz immunokompetencji gospodarza [1–3].

Wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli ptaków (IBV) jest wirusowym patogenem górnych dróg oddechowych drobiu i prowadzi do zmniejszenia przyrostów masy ciała i wykorzystania paszy, spadków produkcji i jakości jaj, zahamowania wzrostu oraz wtórnej infekcji bakteryjnej skutkującej zapaleniem worków powietrznych [4]. Wirus początkowo replikuje się w górnych drogach oddechowych, następnie replikuje się ogólnoustrojowo w układzie rozrodczym, a niektóre szczepy mogą powodować zmiany w nerkach [4]. Zainfekowane ptaki mogą wykazywać wydzielinę z nosa, kaszel, kichanie i rzężenia w tchawicy [4]. Chorobie zapobiega szczepienie, a żywe szczepionki są powszechnie stosowane w celu wywołania miejscowej odporności i ochrony. Żywe szczepionki są zwykle podawane młodym ptakom w celu uzyskania wczesnej ochrony, a nioski i stada rozpłodowe otrzymują również szczepionki przypominające żywe lub inaktywowane, które różnią się w zależności od podobieństwa do wirusów krążących w terenie [2].

Choroba Newcastle (ND) jest wywoływana przez zjadliwe szczepy ptasiego paramyksowirusa typu 1, który niedawno został przeklasyfikowany jako ptasi awulawirus 1 (AAvV{2}}) [5]. W zależności od szczepu wirusa objawy kliniczne zakażenia ND mogą być nieobecne lub mogą obejmować depresję, brak apetytu, objawy ze strony układu oddechowego (wydzielina z nosa, kichanie, kaszel), zmniejszoną produkcję i jakość jaj oraz objawy neurologiczne (kręcz szyi, krążenie, porażenie) ) [3]. Szczepy wirusa choroby Newcastle (NDV) są charakteryzowane jako lentogeniczne, mezogeniczne i velogeniczne, zgodnie ze średnim czasem śmierci w zarodkach [6]. Szczepy lentogenne mają niską zjadliwość, powodując łagodne infekcje dróg oddechowych lub jelit, następnie szczepy mezogeniczne, podczas gdy izolaty welogeniczne są wysoce patogenne, często powodując objawy neurologiczne i śmiertelność [3]. Reżimy szczepień przeciwko NDV są różne i mogą wykorzystywać kombinację szczepionek żywych, inaktywowanych i zawierających wirusy [7]. W Stanach Zjednoczonych do najpowszechniej stosowanych tradycyjnych szczepów szczepionkowych należą lentogeniczne szczepy B1 (lub klony wirusa szczepu B1) oraz szczepy LaSota [3].

Zakaźne zapalenie krtani i tchawicy (ILT) jest chorobą układu oddechowego drobiu wywołaną przez galled alfa-herpeswirusa I i ma znaczenie gospodarcze na całym świecie [8]. Objawy kliniczne ILT obejmują zwiększoną śmiertelność, zmniejszoną produkcję jaj, zmniejszony przyrost masy ciała, zapalenie spojówek, zapalenie tchawicy z odkrztuszaniem krwawego śluzu w ciężkich przypadkach, depresję, ciężką duszność i podatność na inne patogeny układu oddechowego. Żywe szczepionki przeciwko wirusowi ILT (ILTV) mogą pochodzić z zarodków kurzych (CEO) lub z hodowli tkankowej (TCO), w których są wielokrotnie pasażowane, odpowiednio, w jajach lub hodowli tkankowej. Chociaż szczepionki rekombinowane przeciwko ILT są dostępne na rynku, szczepionka CEO jest najczęściej stosowaną szczepionką przeciwko ILTV na świecie.

Ze względu na potrzebę ochrony kurczaków przed różnymi patogenami wirusowymi od najmłodszych lat, programy szczepień zazwyczaj obejmują wielokrotne szczepionki przeciwko różnym patogenom. Przykładowe schematy szczepień w różnych sektorach drobiu omówiono w Podręczniku weterynaryjnym firmy Merck, w którym odstęp między szczepieniami to często tylko kwestia tygodni.

Jednak niewiele jest informacji wskazujących, że odstępy między szczepieniami są wystarczające, aby ptaki rozwinęły odpowiednią ochronę immunologiczną przed wyzwaniami związanymi z każdym wirusem. Z piśmiennictwa wynika, że ​​sekwencyjne infekcje wirusowe mogą skutkować interferencją wirusową, w której jeden wirus blokuje późniejszą infekcję i/lub replikację innego wirusa u gospodarza [9,10], ale do tej pory nie wiadomo, czy zjawisko to skutkuje zmniejszoną ochroną seryjnie podawanych kurczętom żywych atenuowanych szczepionek. Co ciekawe, doniesiono, że jednoczesne podawanie wirusów kurczętom lub indykom nie powoduje interferencji wirusowej [11]. W tym badaniu badamy, w jaki sposób typowy komercyjny schemat szczepień składający się z kombinacji seryjnie podawanych żywych atenuowanych wirusowych szczepionek przeciwko chorobom układu oddechowego wpływa na rozwój i długowieczność odporności i ochronę przed prowokacjami homologicznymi.

2. Materiały i metody

2.1. Wirusy

W tym badaniu zastosowano komercyjną szczepionkę IBV MILDVAC-GA{1}}® (Merck Animal Health, Summit, NJ, USA). Szczepionkę rozcieńczono zgodnie z zaleceniami producenta. Zastosowanym wirusem do prowokacji był IBV GA98/CWL0474/98 i przygotowano go przy medianie dawki zakaźnej zarodka (EID50) wynoszącej 103,19. Miana wirusa obliczono metodą Reeda i Muencha [12]. Handlową szczepionkę NDV B1 (NEWHATCH-C2, Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) zastosowano zarówno do szczepienia, jak i prowokacji, i rekonstytuowano zgodnie z instrukcjami producenta.

Ponieważ mezogeniczne i velogeniczne szczepy NDV wymagają poziomu bezpieczeństwa biologicznego powyżej BSL2, który nie jest dostępny w naszym laboratorium, nasz eksperymentalny model ochrony przed NDV obejmuje znacznie obniżone miana wirusa lub sterylną odporność na drugą ekspozycję (prowokację) wirusem szczepionkowym. Do szczepienia i prowokacji zastosowano odpowiednio komercyjną szczepionkę ILTV CEO (Trachivax® Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) i patogenny szczep brojlerów ILTV Georgia 63140 [13]. Szczep 63140 namnażano w komórkach nerki kurczaka uzyskanych od 3- do 4- tygodniowych kurcząt wolnych od swoistych patogenów (SPF) [14]. Szczepionka CEO została przygotowana zgodnie z zaleceniami producenta. Po zaszczepieniu mediana dawki zakaźnej hodowli tkankowej (TCID50) została potwierdzona przez miareczkowanie obu wirusów w komórkach nerki kury, jak opisano wcześniej [14].

2.2. Eksperymentalny projekt

Jaja wolne od specyficznych patogenów uzyskano po 18 dniach inkubacji i wylęgły się w Centrum Diagnostyki i Badań Drobiu w Atenach, GA. Pisklęta umieszczano na świeżych wiórach sosnowych w domach kolonijnych i kojcach. Pisklęta szczepiono zalecaną przez producenta dawką w 100 µl drogą oczno-nosową zgodnie z następującym schematem; IBV w 1 DOA, NDV w 2 tygodniu życia (WOA), IBV w 4 WOA, ILTV w 8 WOA, NDV w 12 WOA i ILTV w 16 WOA.

Ponadto grupa kontrolna nie była szczepiona. Prowokacje homologiczne przeprowadzono w 20, 24, 28, 32 i 36 WOA, a sekcję zwłok przeprowadzono pięć dni po prowokacji (dpc). Podczas prowokacji ptaki otrzymywały jedno z czterech zabiegów: IBV GA98, NDV B1, ILTV 63140 lub brak prowokacji. Grupy leczone dla każdego wirusa prowokacyjnego na punkt czasowy były następujące: nieszczepione, nieprowokowane (n=9–10); szczepione, nie prowokowane (n=9–10); szczepione, prowokowane (n=17–19); nieszczepione, prowokowane (n=9–10). Wszystkie ptaki zarażone IBV otrzymały EID50 1 × 103,2 na ptaka w 100 µl donosowo. Wszystkie ptaki prowokowane NDV otrzymały szczepionkę NDV B1 w 100 µl donosowo, zrekonstytuowaną zgodnie z protokołem producenta. Wszystkie ptaki poddane prowokacji ILTV otrzymały patogenny szczep 63140 w dawce 1 × 103,5 TCID50 na ptaka w 100 µl podzielone równo pomiędzy krople do oczu i drogi donosowe. W przypadku prowokacji IBV i NDV ptaki obserwowano w 5 dpc pod kątem objawów ze strony układu oddechowego, jak opisano wcześniej [15]: 0=brak; 1=łagodny; 2=umiarkowany; 3=ciężki. W przypadku prowokacji ILTV ptaki obserwowano w 3 i 5 dniu na minutę pod kątem duszności, zapalenia spojówek, depresji i śmiertelności, jak opisano wcześniej [16].

Szczelinę nozdrzy tylnych (ptaki prowokowane IBV i NDV i kontrolne w 5 dpc) lub tchawicę (ptaki prowokowane ILTV i kontrolne w 3 i 5 dpc) pobrano wymazem w celu wykrycia wirusa, a wymazy przechowywano w PBS w -80°C. W 28, 32 i 36 WOA zebrano 50 µl łez przez dodanie do oka granulowanego NaCl. Krew zbierano przez nakłucie skrzydełka lub serca i dodawano do probówki do mikrowirówki w celu zebrania surowicy do wykrywania przeciwciał. Ptaki humanitarnie uśmiercono, a powieki, gruczoł Hardera (HG), grasicę, wątrobę, śledzionę, migdałki jelita ślepego i torebkę Fabrycjusza zebrano i przechowywano w temperaturze -80°C w celu wykrycia wirusa oraz w 10% obojętnej buforowanej formalinie. Tchawicę usunięto, jeden skrawek umieszczono w 10% obojętnej buforowanej formalinie, a pozostałą część tchawicy zanurzono w pożywce do hodowli tkankowej w celu przeprowadzenia testu ikonostasu opisanego poniżej. Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Instytucjonalnej Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu w Georgii (nr AUP: A2015 05-001-R2).

2.3. Test ciliostazy

Test ikonostasu przeprowadzono na pobranych tchawicach pobranych do pożywki do hodowli komórkowej (pożywka Dulbecco's Modified Eagle's Medium) w temperaturze 37°C. Dla każdej tchawicy wycięto pięć pierścieni tchawicy o grubości około 1 mm, reprezentujących proksymalną, środkową i dystalną część [17,18]. Aktywność rzęsek obserwowano przy użyciu odwróconego mikroskopu (Olympus, Center Valley, PA, USA). System punktacji śledzi 0=uderzenia wszystkich rzęsek; 1=75 procent bicia rzęsek; 2=50 procent bicia rzęsek; 3=25 procent bicia rzęsek; 4=brak bicia rzęsek, jak opisano wcześniej [17]. Maksymalny możliwy wynik dla każdej tchawicy wynosi 20. Każdy pierścień tchawicy został oceniony przez trzy osoby i obliczono średni całkowity wynik dla każdej tchawicy. Ocenę ochrony ikonostasu dla każdej z grup wyznaczono według następującego wzoru: 100 − [(suma ocen indywidualnych dla grupy)/(liczba osób w grupie × 20) × 100] oraz wynik Większy lub równy do 50 uznano za chronione.

2.4. Histopatologia tchawicy

Skrawek każdej tchawicy utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie, przetworzono i zatopiono w parafinie, a skrawki 5-}}µm wycięto w celu wybarwienia hematoksyliną i eozyną. W przypadku zmian IBV dla każdej tchawicy oceniano hiperplazję nabłonka, naciek limfocytów i decyliację nabłonka. Wyniki określono w następujący sposób: 1=normalny, 2=ogniskowy, 3=wieloogniskowy i 4=rozproszony, jak opisano wcześniej [19]. W przypadku zmian NDV przeprowadzono analizę opisową. W przypadku zmian ILTV zmiany mikroskopowe oceniano w skali od 0 do 5 (od normalnego do bardzo ciężkiego), jak opisano wcześniej [20].

2.5. Ekstrakcja RNA i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR)

W celu wykrycia IBV i NDV przeprowadzono ekstrakcję wirusowego RNA z 50 µl PBS z każdej wymazówki przy użyciu zestawu 5× MagMAX{2}} Viral Isolation Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) na aparacie MagMAX™ Express{{ 3}} Deep Well Magnetic Particle Processor (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) przeprowadzono za pomocą zestawu AgPath-IDTM One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), zgodnie z protokołem producenta. Każda 25-}µl mieszaniny reakcyjnej zawierała 12,5 µl 2x buforu RT-PCR, 10 µM każdego startera, 4 µM sondy, 1 µl mieszaniny enzymów 25x RT-PCR i 5 µl wirusowego RNA. Reakcje qRT-PCR przeprowadzono w systemie Applied Biosystems® 7500 Fast Realtime PCR (Life Technologies Ltd., Carlsbad, CA, USA) w następujących warunkach: jeden cykl 50 ◦C przez 30 min i 95 ◦C przez 15 min , a następnie 40 cykli 94 ◦C przez 1 s i 60 ◦C przez 60 s. Startery i sonda do IBV qRT-PCR zostały opublikowane wcześniej [21] i składają się ze startera do przodu IBV50GU391 (50 -GCT TTT GAG CCT AGC GTT-30 ), startera do tyłu IBV50GL533 ({34}} {38}}GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT G-30 ) i podwójnie znakowaną sondę Taqman® IBV50G (50 -FAM-CAC CAC CAG AAC CTG TCA CCT C-BHQ{{45 }} ). Startery i sondy do NDV qRT-PCR zostały wcześniej opisane [22] i składają się ze startera do przodu NDV M plus 4100 (5'-AGT GAT GTG CTC GGA CCT TC-3'), startera do tyłu NDV M -4220 (5'-CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA-3') i podwójnie znakowaną sondę Taqman® NDV M plus 4169 (5'-FAM-TTC TCT AGC AGT GGG ACA GCC TGC -BHQ1-3').

Startery otrzymano z Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA), a sondę Taqman zsyntetyzowano przez BioSearch Technologies (Novato, CA, USA). Składniki RT-PCR w czasie rzeczywistym i parametry termocyklera zostały już wcześniej opisane [21]. Dane wyrażono jako średnią wartość progową cyklu (CT) dla wszystkich próbek w każdej grupie, z dodatnimi wartościami CT opartymi na granicy wykrywalności dla tego testu związanej z wykrywaniem wirusa w jajach [23].

Każda płytka reakcyjna qRT-PCR zawierała krzywą standardową jako kontrolę ekstrakcji RNA i jako kontrolę pozytywną. GA98 IBV wyizolowany z płynu omoczniowego zastosowano jako matrycę dla krzywej standardowej. Kontrole negatywne były również zawarte w każdej płytce i składały się z odczynników PCR bez RNA.

2.6. Ekstrakcja DNA

W przypadku ILTV całkowite DNA ekstrahowano z wymazów z tchawicy przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA MegaZorb® 96-dołków (Promega, Madison, WI, USA), jak opisano wcześniej [24].

2.7. qPCR

Duplex real-time PCR test, który amplifikuje fragment genu wirusowego UL44 w ILTV i fragment genu alfa 2-kolagenu kurzego przeprowadzono, jak opisano wcześniej [25].

2.8. Surowica Miana swoistych przeciwciał IgG przeciwko wirusowi zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV).

Specyficzne dla IBV miana IgG wykrywano przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do testowania przeciwciał IBV IgG (ELISA) (IDEXX, Westbrook, ME, USA). W skrócie, próbki surowicy (przechowywane w temperaturze -20 ◦C) rozcieńczono 1:500, a procedurę przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta.

2.9. Miana przeciwciał IBV swoistych dla IgA wydzielanych przez łzy

IgA specyficzne dla IBV łzy wykrywano przy użyciu komercyjnego zestawu testowego IgG ELISA IBV (IDEXX, Westbrook, ME, USA). Pokrótce, łzy seryjnie rozcieńczano dwukrotnie w PBS i inkubowano w podwójnych studzienkach przez noc w temperaturze 4°C. Wszystkie etapy przemywania przeprowadzono stosując PBS-Tween 20 (0,05 procent Tween 20). Płytki inkubowano w temperaturze 23°C przez 2 godziny w monoklonalnym mysim anty-kurzym IgA-BIOT (1:1000, klon A -1, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), a następnie przez 1 godzinę w Streptawidynie-HRP ( 1:4000, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). Końcowe etapy wykrywania przeciwciał zakończono zgodnie z instrukcjami producenta. Miana punktów końcowych określono, podając najniższe rozcieńczenie, przy którym gęstość optyczna (OD), zarejestrowana przy długości fali 650 nm, wynosiła co najmniej trzy odchylenia standardowe powyżej średniej z 12 studzienek kontrolnych inkubowanych bez próbek łez. Dane ze studzienek z punktową zmianą koloru z powodu resztkowego substratu lub pęcherzyków powietrza zostały wykluczone z analizy, a wyniki podano jako log2 miana punktu końcowego.

2.10. Analiza statystyczna

Dane analizowano przy użyciu oprogramowania Prism v.6.{1}} (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). W przypadku danych dotyczących miana wirusa zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) z posttestem Dunneta w celu porównania grup leczonych w każdym okresie zbierania danych. Wszystkie inne dane analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa z posttestem Dunna w celu porównania grup leczenia w każdym okresie zbierania danych. Istotne różnice określono przy p < 0,05.

3. Wyniki

3.1. Wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli

Po 5 dniach od prowokacji IBV GA98, szczepione/prowokowane ptaki miały znacząco niższe ładunki RNA w porównaniu z kontrolami pozytywnymi we wszystkich czasach pobierania i we wszystkich próbkach tkanek, z wyjątkiem migdałków jelita ślepego w 24 WOA (Tabela 1). W szczepionych kontrolach nie wykryto RNA IBV we wszystkich momentach pobierania, z wyjątkiem migdałków jelita ślepego w 20 i 24 WOA oraz szczeliny nozdrzy tylnych w 20 WOA. Obciążenia IBV w kontrolach negatywnych we wszystkich tkankach były poniżej granicy wykrywalności przy użyciu wartości CT większej lub równej 36,17, jak podano wcześniej [23], we wszystkich czasach pobierania, z wyjątkiem kontroli negatywnych 24 WOA HG.

Kliniczne oznaki zakażenia IBV mierzone 5 dni po prowokacji były znacznie zmniejszone u ptaków szczepionych/prowokowanych w porównaniu z kontrolą pozytywną we wszystkich tygodniach z wyjątkiem 28 WOA, ale tendencje w ocenie objawów klinicznych były liczbowo niższe wśród ptaków szczepionych/prowokowanych (Tabela 2) . Objawy kliniczne były nieobecne u nie prowokowanych negatywnych i szczepionych ptaków kontrolnych, a objawy u szczepionych/prowokowanych ptaków nie różniły się istotnie od objawów u nie prowokowanych kontroli.

Tabela 1. Średnie ilościowe wartości progowe (CT) cyklu reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) dla RNA wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV) pobranego z nozdrzy tylnych, gruczołu Hardera, spojówki i migdałka jelita ślepego 5 dni po prowokacji IBV GA98 w wieku 20, 24, 28, 32 i 36 tygodni. Litery (a – d) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <0,05).

Tabela 2. Objawy kliniczne i zmiany mikroskopowe mierzono 5 dni po prowokacji IBV GA98. Litery (a – b) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <{3}},05).

Badanie histopatologiczne tchawicy ze wszystkich grup wahało się od w granicach normy do ogniskowego do wieloogniskowego minimalnego do umiarkowanego limfocytarnego zapalenia tchawicy; jednak umiarkowany naciek limfocytarny był częściej obserwowany w kontroli pozytywnej. We wszystkich tygodniach odsetek zaszczepionych/prowokowanych ptaków z decyliacją lub ostrą martwicą tchawicy był znacznie zmniejszony w porównaniu z kontrolami pozytywnymi i nie różnił się od kontroli negatywnych i szczepionych (Tabela 2).

Ciliostasis, defined as the cessation of tracheal ciliary movement, was measured at 5 DPC, and the number of birds positive for cryostasis and cryostasis protection scores was calculated for each group (Figure 1). At all collection times, vaccinated/challenged birds were protected from cryostasis (scores were >50), a kontrole pozytywne nie były chronione (wyniki były<50). The non-challenged negative controls and vaccinated controls were protected (scores were >50) przez cały czas odbioru.

Figure 1. Ciliostasis protection scores among tracheas were collected 5 days post-challenge with IBV GA98 for different groups of birds challenged at 20, 24, 28, 32, and 36 weeks of age (WOA). Groups with a protection score >50 (linia pozioma) są chronione, a grupy z oceną ochrony<50 are not protected. Fractions above each bar represent the proportion of birds positive for cryostasis for the respective group. −/− = non-vaccinated/non-challenged, +/− = vaccinated/non-challenged, +/+ = vaccinated/challenged, −/+ = non-vaccinated/challenged.

Miana IgG specyficzne dla IBV mierzono w surowicy pobranej w 5 DPC. Przez cały czas, z wyjątkiem 32 WOA, szczepione ptaki zarówno z grup nie prowokowanych, jak i prowokowanych wykazywały znacząco wyższe miana w porównaniu z nieszczepionymi ptakami zarówno z grup nie prowokowanych, jak i prowokowanych (Figura 2). Przy 32 WOA miana szczepionych ptaków, niezależnie od statusu prowokacji, były znacząco wyższe w porównaniu z kontrolami pozytywnymi. Miana szczepionych/prowokowanych ptaków nie różniły się istotnie od mian szczepionych kontroli do 36 WOA, kiedy szczepione/prowokowane ptaki miały znacznie wyższe miana. W porównaniu z kontrolą negatywną, szczepione/prowokowane ptaki miały przez cały czas znacząco wyższe miana.

Miana IgA specyficzne dla IBV mierzono we łzach zebranych w 5 DPC w 28, 32 i 36 WOA. Przy 28 WOA, miana szczepionych/prowokowanych ptaków były znacząco wyższe w porównaniu z mianami w nieprowokowanych kontrolach negatywnych (Figura 3). W 32 WOA, szczepione/prowokowane ptaki wykazywały znacząco niższe miana w porównaniu z kontrolami pozytywnymi. Ponadto ptaki szczepione/prowokowane miały znacznie wyższe miana niż grupa szczepiona/nieprowokowana w 28 WOA. Nie wykryto żadnych innych istotnych różnic. Wirusy 2019.

Rycina 2. Miana IgG swoistych dla IBV w surowicy zebrano 5 dni po prowokacji IBV GA98 dla różnych grup ptaków poddanych prowokacji w 2 0, 24, 28, 32 i 36 WOA. Litery (a – c) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <0,05). −/−=nie szczepione/nie prowokowane, plus /−=szczepione/nie prowokowane, plus / plus=szczepione/prowokowane, −/ plus=nieszczepione/prowokowane.

Ryc. 3. Miano przeciwciał IgA swoistych dla IBV we łzach zebranych 5 dni po prowokacji IBV GA98 dla różnych grup ptaków poddanych prowokacji w 20, 24, 28, 32 i 36 WOA. Litery (a – c) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <0,05). −/−=nie szczepione/nie prowokowane, plus /−=szczepione/nie prowokowane, plus / plus=szczepione/prowokowane, −/ plus=nieszczepione/prowokowane.

3.2. Wirus choroby Newcastle (NDV)

W 5 dpc z NDV B1, szczepione/prowokowane ptaki miały niewykrywalne ładunki RNA lub znacząco niższe ładunki w porównaniu z mianami kontroli pozytywnej we wszystkich czasach pobierania i we wszystkich próbkach tkanek (Tabela 3). Nieprowokowane kontrole ujemne i szczepione kontrole były ujemne w kierunku wirusa RNA przy użyciu wartości CT większej niż lub równej 35.{5}}, jak podano wcześniej [22].

Tabela 3. Średnie wartości qRT-PCR CT dla NDV RNA zebranego z rozszczepu nozdrzy tylnych, gruczołu Hardera i spojówki 5 dni po prowokacji szczepionką NDV B1. Litery (a – c) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <{5}}, 05).

Objawy kliniczne mierzone w 5 dpc były istotne przy 20 WOA w kontroli pozytywnej, po czym objawy kliniczne w kontroli pozytywnej nie różniły się od żadnej z innych grup leczenia (Tabela 4). W żadnym momencie nie istniały żadne znaczące różnice w objawach klinicznych między ptakami szczepionymi/prowokowanymi a nie prowokowanymi kontrolami. We wszystkich tygodniach badanie histopatologiczne tchawicy mieściło się w granicach normy lub ujawniło ogniskowe lub wieloogniskowe minimalne lub łagodne limfocytowe zapalenie tchawicy i nie było różnic związanych z grupami.

Tchawice oceniano również pod kątem kriostazy i żadna grupa nie wykazywała kriostazy.

Miana IgG w surowicy swoistej dla NDV u szczepionych/prowokowanych ptaków i szczepionych kontroli były znacząco wyższe niż miana zarówno w kontroli dodatniej, jak iw kontroli negatywnej we wszystkich momentach pobierania (ryc. 4). W żadnym momencie nie było znaczącej różnicy w mianach pomiędzy szczepionymi/prowokowanymi ptakami i szczepionymi kontrolami. Podobnie, nie wykryto żadnej istotnej różnicy w mianach pomiędzy nieszczepionymi/prowokowanymi i negatywnymi kontrolami, z wyjątkiem 28 WOA, w którym miana z nieszczepionych/prowokowanych kontroli były znacząco wyższe.

Tabela 4. Objawy kliniczne mierzono 5 dni po prowokacji NDV B1. Litery (a – b) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <{3}},05).

Ryc. 4. Miana IgG swoiste dla NDV w surowicy zebrano 5 dni po prowokacji szczepionką NDV B1 dla różnych grup ptaków prowokowanych w 2 0, 24, 28, 32 i 36 WOA. Litery (a – c) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <0,05). −/−=nie szczepione/nie prowokowane, plus /−=szczepione/nie prowokowane, plus / plus=szczepione/prowokowane, −/ plus=nieszczepione/prowokowane.

3.3. Wirus zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy (ILTV)

W 5 dpc ze szczepem ILTV 63140 szczepione/prowokowane ptaki miały znacznie niższe miano wirusowego DNA niż kontrole pozytywne we wszystkich czasach pobierania i we wszystkich tkankach (Tabela 5). Obciążenia DNA w tchawicy i HG były niewykrywalne lub niskie i nie różniły się istotnie od ładunków DNA w nieprowokowanych negatywnych i zaszczepionych kontrolach, które były ujemne przy użyciu wartości CT większej lub równej 38,0, jak podano wcześniej [26]. W spojówce miano DNA u szczepionych/prowokowanych ptaków było znacznie wyższe niż miano DNA zarówno z nieprowokowanych negatywnych, jak i szczepionych kontroli, z wyjątkiem 28 WOA, w którym nie wykryto znaczącej różnicy między szczepionymi/prowokowanymi ptakami a szczepionymi kontrolami.

Tabela 5. Średnie wartości qPCR CT dla DNA ILTV pobranego z tchawicy, gruczołu Hardera i spojówki 5 dni po prowokacji patogennym szczepem ILTV 6314{4}}. Litery (a – c) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <0,05).

Objawy kliniczne i wirusowe DNA wykryto u prowokowanych ptaków w 3 DPC, ale objawy w kontroli pozytywnej stały się bardziej dotkliwe o 5 DPC, gdy wzrosło miano wirusa w tchawicy (Tabela 6). Oceny objawów klinicznych mierzone w 5 dpc były znacznie zmniejszone u szczepionych/prowokowanych ptaków w porównaniu z kontrolami pozytywnymi, we wszystkich punktach pobierania z wyjątkiem 36 WOA, gdzie oceny objawów klinicznych były liczbowo zmniejszone. Wszystkie kontrole negatywne i szczepione kontrole nie miały objawów klinicznych, a objawy kliniczne u szczepionych/prowokowanych ptaków nie różniły się znacząco w porównaniu z tymi kontrolami, z wyjątkiem 36 WOA, kiedy wyniki objawów klinicznych były znacznie wyższe.

Tabela 6. Objawy kliniczne mierzono 5 dni po prowokacji ILTV 6314{3}}. Litery (a – b) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <0,05).

Badanie histologiczne tchawicy mieściło się w granicach normy lub wykazało ogniskowe lub rozlane limfocytowe zapalenie tchawicy o minimalnym lub łagodnym nasileniu we wszystkich grupach. W przypadku kontroli pozytywnych, 3/9 i 1/10 odpowiednio w tygodniach 20 i 28 miało ostre ogniskowe martwicze zapalenie tchawicy z syncytią i inkluzjami wewnątrzjądrowymi (ryc. 5).

Rycina 5. Zmiany mikroskopowe w tchawicy są zgodne z zakażeniem zakaźnym zapaleniem krtani i tchawicy w wieku 20 tygodni. (A) Liczne syncytie z inkluzjami wewnątrzjądrowymi (strzałka). (B) Inna tchawica z tej samej grupy wykazała syncytię z inkluzjami wewnątrzjądrowymi (strzałka).

W tchawicy ptaków z żadnej z grup nie zaobserwowano ikonostasu.

Miana IgG specyficzne dla ILTV w surowicy pobranej 5 dni po prowokacji były znacząco wyższe u szczepionych ptaków zarówno z grup prowokowanych, jak i nieprowokowanych, w porównaniu z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi (Figura 6).

Rycina 6. Miana IgG specyficzne dla ILTV w surowicy zebrano 5 dni po prowokacji szczepem ILTV 6314{10}} dla różnych grup ptaków prowokowanych w 20, 24, 28, 32 i 36 WOA. Litery (a – b) wskazują na istotne różnice między grupami zaszczepionymi i prowokowanymi dla każdego tygodnia (p <0,05). −/−=nie szczepione/nie prowokowane, plus /−=szczepione/nie prowokowane, plus / plus=szczepione/prowokowane, −/ plus=nieszczepione/prowokowane.

For more information:1950477648nn@gmail.com