Wpływ ShRNA receptora angiotensyny II typu I na ciśnienie krwi i przebudowę lewej komory u szczurów z samoistnym nadciśnieniem

Abstrakcyjny:

Badanie to zostało zaprojektowane w celu zbadania wpływu shRNA receptora angiotensyny II typu I (AT1R) na ciśnienie krwi i przebudowę lewej komory u szczurów z samoistnym nadciśnieniem. Dziesięć szczurów Wistar Kyoto (WKY) wykorzystano jako grupę kontrolną normalnego ciśnienia krwi, a 20 szczurów z samoistnym nadciśnieniem (SHR) podzielono losowo na grupy eksperymentalne i grupy kontrolne z nadciśnieniem. Szczurom z grupy eksperymentalnej wstrzyknięto rekombinowany adenowirus AT1R shRNA (Ad5-AT1R-shRNA) przez żyłę ogonową, a szczurom z pozostałych dwóch grup wstrzyknięto rekombinowany adenowirus (Ad5-}EGFP ). Skurczowe ciśnienie krwi (SBP) w tętnicy ogonowej szczura mierzono przed i po wstrzyknięciu, a tkanki serca, nerek, aorty i nadnerczy uzyskano dwa dni po wielokrotnym wstrzyknięciu, aby obserwować rozkład Ad5-AT1R- shRNA pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przed wstrzyknięciem Ad5-AT1R-shRNA ciśnienie krwi w grupie eksperymentalnej i grupie kontrolnej z nadciśnieniem tętniczym było znacząco wyższe niż w grupie kontrolnej z prawidłowym ciśnieniem krwi (P<0.01). After two injections, the blood pressure in the experimental group decreased significantly, and the duration of blood pressure reduction reached 19 days. In the experimental group, the kidney, heart, aorta, and adrenal gland tissues showed vigorous fluorescence expression under the fluorescence microscope. Repeated administration of Ad5- AT1R-shRNA has a long-lasting hypotensive effect on SHR and can significantly improve ventricular remodeling.

W badaniu eksperymentalnym na szczurach odkryliśmy również, że Cistanche ma działanie ochronne na nerki, co może zapobiegać uszkodzeniom nerek i poprawiać ich czynność. Wśród nich Cistanche może zmniejszać odpowiedź na stres oksydacyjny kłębuszków nerkowych i kanalików nerkowych oraz zmniejszać poziom wolnych rodników w tkance nerkowej. Ponadto Cistanche może również zmniejszać odpowiedź zapalną nerek i promować regenerację i naprawę komórek nerkowych.

Kliknij czysty produkt cistanche

Wstęp

Przebudowa komorowa (lub mięśnia sercowego) to koncepcja proponowana w badaniach nad kardiomiopatią niedokrwienną, chorobą nadciśnieniową serca, kardiomiopatią rozstrzeniową i innymi postaciami uszkodzeń serca, które charakteryzują się głównie zmianami po uszkodzeniu mięśnia sercowego, takimi jak przerost kardiomiocytów, proliferacji i włóknienia mięśnia sercowego, na tej podstawie powiększa się jama serca i zwiększa się masa serca [1]. Przerost mięśnia sercowego jest najczęstszą patologiczną zmianą w nadciśnieniu tętniczym, gdzie w przerośniętym mięśniu sercowym często pojawia się szereg zmian w morfologii i strukturze subkomórkowej.

We wcześniejszych badaniach potwierdzono, że nadmierna aktywacja układu RAS (układu renina-angiotensyna) odgrywa kluczową rolę w patologicznym procesie nadciśnieniowej przebudowy komór, ze względu na funkcję wazopresyjną, wzrost komórek i efekt promujący proliferację [2]. Ang II jest główną substancją aktywną RAS i może wywierać działanie biologiczne poprzez specyficzną aktywację AT1R, który ma duże powinowactwo do powierzchni fibroblastów serca [3]. Ponadto Ang II ma również pewne działanie podobne do czynnika wzrostu i może bezpośrednio promować syntezę RNA i białka w kardiomiocytach, aby promować proliferację komórek włókienkowych, powodując przebudowę komór [4].

Co więcej, technologia interferencji RNA odnosi się do wykorzystania shRNA do produkcji aktywnego RNA, krótkiego interferującego RNA (siRNA) w komórkach i specyficznie wiąże i degraduje mRNA komplementarnych genów docelowych, hamując ekspresję docelowego genu [5]. Rekombinowany wektor adenowirusowy (Ad5-AT1R-shRNA), zaprojektowany w oparciu o zasadę interferencji RNA, specyficznie blokował ekspresję AT1R i wykazywał znaczące działanie hipotensyjne we wcześniejszych badaniach hipotensyjnych prowadzonych przez badaczy [6–8]. Jednak jako stosunkowo nowa forma terapii genowej nadciśnienia tętniczego nie wiadomo, czy wpływa ona na przebudowę komór spowodowaną nadciśnieniem, a skutki i skutki uboczne wielokrotnego wstrzyknięcia dożylnego nie zostały zgłoszone.

W niniejszym badaniu szczury z spontanicznym nadciśnieniem (SHR) wybrano jako osobniki doświadczalne, ciśnienie krwi i przebudowę komór SHR obserwowano po wielokrotnym wstrzyknięciu Ad 5- AT1R-shRNA w celu zbadania wpływu blokowania genu AT1R indukowane przez Ad5-AT1R-shRNA na przebudowę w nadciśnieniu.

Materiały i metody

Leki, odczynniki i instrumenty

Ad5-AT1R-shRNA i kontrolny rekombinowany wektor adenowirusowy (Ad5-}EGFP) przenoszący shRNA receptora angiotensyny II typu 1 (AT1R) zostały skonstruowane i zsyntetyzowane przez Benyuan-Zhengyang Gene Technology Co., Ltd . (Pekin, Chiny). Zestaw do wykrywania hydroksyproliny (HYA) zakupiono w Nanjing Jiancheng Biological Engineering Institute. Nieinwazyjny przyrząd do pomiaru ciśnienia krwi w tętnicy ogonowej szczura (PowerLab, ADInstruments, Nowa Południowa Walia, Australia) został dostarczony przez Laboratorium Kardiologii w naszej uczelni. Spektrofotometry z 722 siatkami zostały wykonane przez Shanghai Third Analytical Instrument Factory (Szanghaj, Chiny). Transmisyjny mikroskop elektronowy (transmisyjna mikroskopia elektronowa typu Fei Tecnai G{9}}, FEI Company, Hillsboro, OR, USA) został dostarczony przez Electron Microscope Room of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology. Obecne badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Klatkowego Tian Jin.

Grupowanie i administracja zwierząt

Dorosłe samce szczurów SHR i Wistar Kyoto (WKY) miały 12 tygodni i ważyły ​​​​280–320 g. W klatce znajdowało się 3–5 szczurów, w pomieszczeniu utrzymywano temperaturę 24 ± 2 stopnie, a wilgotność względną utrzymywano na poziomie 60–65%. Zapewniono 12-h sztuczny cykl dnia i nocy, w którym 7:00 AM–7:00 PM oznaczało oświetloną część cyklu, a 7:00 PM –7: 00 AM wskazywało na ciemną część cyklu. Szczury mogły swobodnie jeść i pić. Grupy szczurów obejmowały grupę kontrolną z prawidłowym ciśnieniem krwi (grupa WKY, n{18}}), grupę kontrolną z nadciśnieniem (grupa SHR, n=10) i grupę eksperymentalną z nadciśnieniem (grupa eksperymentalna, n{ {20}}).

Szczurom z grupy eksperymentalnej wstrzyknięto dożylnie 1 ml Ad5-AT1R-shRNA o mianie TCID50 1,7 × 109 przez żyłę ogonową, a szczurom z grup SHR ​​i WKY wstrzyknięto dożylnie 1 ml Ad{8}}EGFP o mianie TCID50 1,7 × 109 przez żyłę ogonową. Czas iniekcji miał miejsce na początku eksperymentu oraz po powrocie ciśnienia krwi do stanu początkowego po pierwszej iniekcji.

Od wszystkich szczurów w każdej grupie pobrano około 80–90 g tkanki mięśnia sercowego, a operację przeprowadzono ściśle według instrukcji zestawu do wykrywania hydroksyko3iny.

Pomiar ciśnienia krwi i tętna oraz obserwacja zwierząt doświadczalnych

Skurczowe ciśnienie krwi (SBP) tętnicy ogonowej i częstość akcji serca mierzono metodą mankietu ogonowego w cichym otoczeniu o 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21 dni wstrzyknięcia. Ogon tego szczura podgrzano do około 40 stopni i ustawiono w wygodnej pozycji. Mankiet uciskowy umieszczono u nasady ogona szczura, napompowano go i poddano działaniu ciśnienia. Gdy ciśnienie osiągnęło 270 mm Hg (1 mm Hg=0, 133 kPa), ciśnienie zostało automatycznie i powoli obniżone, a ciśnienie krwi i tętno zostały zarejestrowane przez system eksperymentalny funkcji biologicznych Medlab podłączony do przetwornika ciśnienia i wzmacniacz. Wszystkie szczury mierzono pięć razy w sposób ciągły, a średnie obliczano i stosowano jako SBP i tętno. Apetyt, aktywność, temperaturę ciała, masę ciała (BW) i inne reakcje zwierząt obserwowano codziennie aż do zakończenia doświadczenia.

Wykrywanie rozmieszczenia rekombinowanego wektora adenowirusowego w głównych tkankach

Zwierzętom w grupie eksperymentalnej wstrzyknięto Ad{{0}}AT1R-shRNA znakowany białkiem fluorescencyjnym. Dwa dni po wielokrotnym wstrzyknięciu Ad5-AT1R-shRNA pobrano tkanki serca, nerek, aorty i nadnerczy z grupy eksperymentalnej, które następnie natychmiast przygotowano do zamrożonych skrawków. Ekspresję fluorescencyjną obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Gdy ciśnienie krwi spadło, niektóre zwierzęta uśmiercono i zważono. Zwierzętom wstrzyknięto dootrzewnowo 0,4 ml/100 g pentobarbitalu w celu znieczulenia i szybko usunięto tkanki serca, nerek, aorty i nadnerczy. Ostrym ostrzem narządy te pocięto na małe skrawki tkanek o wymiarach 1 × 1 × 1 cm i wysłano do Zakładu Patologii, gdzie przygotowano je w postaci zamrożonych skrawków. Ich grubość mierzono w zakresie 5–8 µm, a ekspresję białka fluorescencyjnego obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby ocenić wchłanianie Ad5-AT1R-shRNA przez główne narządy.

Przygotowanie próbek mięśnia sercowego

Na koniec eksperymentu zmierzono BW szczurów. Szczurom wstrzyknięto dootrzewnowo {{0}},4 ml/100 g pentobarbitalu w celu znieczulenia. Po otwarciu klatki piersiowej szybko usunięto serce, odcięto okoliczne naczynia krwionośne, krew serca osuszono na bibule filtracyjnej, zważono masę całego serca w stanie mokrym (HW) i stosunek masy serca do masy ciała (HW/ BW) obliczono [9, 10]. Z regionu wierzchołkowego pobrano kilka kawałków tkanki mięśnia sercowego 1-mm3, przemyto 0,1 mol/l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie wstępnie utrwalono 2,5% aldehydem glutarowym (pH 7,2). Następnie utrwalono je 1-procentowym roztworem tetratlenku osmu (pH 7,2), odwodniono alkoholem i acetonem o rosnącym gradiencie, nasączono i zatopiono w żywicy epoksydowej i przygotowano w ultracienkie skrawki. Do pomiaru HYA pobrano kolejne 60–100 g mięśnia sercowego lewej komory.

Wskaźniki obserwacji

SBP tętnicy ogonowej w stanie spokojnego czuwania rejestrowano przed wstrzyknięciem i we wszystkich punktach czasowych po wstrzyknięciu. Pobrano około 80–90 g tkanki mięśnia sercowego i oznaczono zawartość HYA w tkance mięśnia sercowego metodą biologiczną, zgodnie z instrukcją zestawu do wykrywania HYA, a następnie przeliczono na zawartość kolagenu według wzoru: kolagen zawartość=zawartość HYA × 7,46 [11]. Rejestrowano BW i HW szczurów i obliczano stosunek HW/BW. Ultracienkie skrawki barwiono zarówno octanem uranylu, jak i cytrynianem ołowiu, a następnie obserwowano i fotografowano pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Wykrywanie ekspresji mRNA AT1R za pomocą fluorescencyjnej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

Pod koniec eksperymentu ze wszystkich grup pobrano {{0}},5 g tkanki lewej komory w celu wykrycia ekspresji mRNA AT1R. Sekwencja szczurzego genu AT1R została wybrana w GenBank (numer seryjny NM {4}}), a startery i sondy zostały zaprojektowane przy użyciu Primer Premier 5.0 i zsyntetyzowane przez Sangon Biotech (Szanghaj, Chiny). Starterem w górę AT1R był 5'-ACG ATG CTG GTG GCC AAA GT -3', a starterem w dół był 5'-ATG ATA AGG AAA GGG AAC AAG AAG C -3'. Sekwencją sondy była 5'-ATT ATG AGT CTC GGAATT CGA CGC TCC CCA{16}}', a modyfikacją sondy była 5'-FAM, 3'-TAMRA, 3'-PO4. Starterem w górę -aktyny był 5'-AGG GAA ATC GTG CGT GAC AT -3', a starterem w dół był 5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3'. Sekwencją sondy była 5'-CAC TGC CGC ATC CTC TTC CTC CCT GG-3', a modyfikacją sondy była 5'-FAM, 3'-TAMRA, 3'-PO4.

Całkowity RNA ekstrahowano z tkanek przy użyciu jednoetapowej metody Trizol i poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA za pomocą systemu odwrotnej transkrypcji wirusa białaczki Moloneya Murine'a (MMLV). Przygotowanie próbek krzywej standardowej składało się z genu docelowego i genu metabolizmu podstawowego (-aktyny) z próbki, która miała być amplifikowana przez PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Produkt rozcieńczono gradientem w celu uzyskania krzywej wzorcowej. System reakcji PCR składał się z 2 µl 10 × buforu, 2 µl MgCl2 i 0,5 µl dNTP. Było {{10}},5 µl startera w górę, 0,5 µl startera w dół, 1 µl sondy, 0,4 µl enzymu Taq i 2 µl matrycy reakcyjnej i sterylnie zdejonizowano dodawano wodę aż objętość osiągnęła 20 ul. System PCR umieszczono w probówce do fluorescencyjnej reakcji PCR, przeprowadzono amplifikację i zebrano sygnały fluorescencji na detektorze ilościowej fluorescencji Rotor-gene do PCR. Warunki reakcji były następujące: 95 stopni, 5 min; 94 stopnie, 5 sekund; 60 stopni , 30 s w sumie 45 wykonanych cykli. Następnie zebrano sygnały fluorescencyjne i przeanalizowano wyniki.

W celu dalszego wyeliminowania wpływu oznaczania ilościowego mRNA i wydajności reakcji PCR na wyniki w eksperymencie przeprowadzono jednocześnie ilościowe wykrywanie bezwzględnej liczby kopii kontroli wewnętrznej -aktyna, stosunek bezwzględnej liczby kopii AT1R do -aktyny zastosowano jako względną ekspresję genu AT1R.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania statystycznego SPSS 12.0. Powtarzane dane pomiarowe wśród trzech grup analizowano za pomocą analizy kowariancji. Wszystkie zestawy danych spełniły założenia do przeprowadzenia ANCOVA. Test Studenta-Newmana-Keulsa (SNK)-q zastosowano do wielokrotnych porównań między średnimi z wielu grup. Dane we wszystkich grupach wyrażono jako średnią ± SD. P<0.05 was considered statistically significant.

Wyniki

Ad5-AT1R-shRNA znacznie zmniejszył SBP w SHR

Przed wstrzyknięciem SBP było istotnie wyższe w grupie eksperymentalnej, a w grupie SHR było wyższe niż w grupie WKY (P<0.05). Twenty-four hours after the first injection, SBP was significantly lower in the experimental group than in the SHR group (P<0.01), and="sbp=" did=" not=" decrease=" significantly=" in=" the=" shr=" group=" wky=" p=">0.05). Po pierwszym wstrzyknięciu Ad5-AT1R-shRNA efekt hipotensyjny utrzymywał się w grupie eksperymentalnej przez pięć dni, a ciśnienie krwi wróciło do normy w 7 dniu. Po drugim wstrzyknięciu ciśnienie ponownie znacznie się obniżyło, a czas trwania był dłuższy niż po pierwszym wstrzyknięciu i trwał 14 dni (ryc. 1). Codziennie obserwowano miejscowe i ogólnoustrojowe reakcje zwierząt i nie stwierdzono nieprawidłowości, takich jak anoreksja, utrata masy ciała, podwyższona temperatura. Nie było znaczących zmian częstości akcji serca w trzech grupach, a różnice między trzema grupami nie były istotne statystycznie.

Ad5-AT1R-shRNA znacznie zmniejsza ekspresję mRNA AT1R w tkance serca

Aby sprawdzić, czy Ad5-AT1R-shRNA ma wpływ interferencji RNA na ekspresję mRNA AT1R w tkankach, w 21 dniu po wstrzyknięciu Ad5-AT1RshRNA całkowity RNA tkanki serca wyodrębnione we wszystkich grupach. Po odwrotnej transkrypcji do cDNA liczbę kopii genów wykrywano metodą ilościowej PCR fluorescencji w czasie rzeczywistym. Wyniki krzywej amplifikacji PCR wykazały, że ekspresja mRNA AT1R w grupie eksperymentalnej była istotnie niższa niż w grupie kontrolnej z nadciśnieniem. Co więcej, różnica była istotna statystycznie (P<0.05, Fig. 2).

Dystrybucja Ad5-AT1R-shRNA w tkankach

Znakowany fluorescencyjnie rekombinowany adenowirus był rozprowadzany w tkankach serca, nerek, aorty i nadnerczy po 2 dniach powtarzanego wstrzykiwania Ad5-AT1RshRNA (ryc. 3). Ponieważ AT1R był szeroko rozpowszechniony w tkance, wyniki tego badania były zgodne z rozkładem AT1R in vivo.

Ad5-AT1R-shRNA znacznie zmniejsza przerost mięśnia sercowego w SHR

Stan przerostu mięśnia sercowego u szczurów można odzwierciedlić mierząc HW i stosunek HW/BW. Mierząc masę serca i masę ciała szczurów, badanie to wykazało, że HW i HW/BW były znacznie wyższe w grupie SHR niż w grupie WKY (P<0.01). The result suggests that there was obvious myocardial hypertrophy in untreated SHR. On the 21st day after Ad5-AT1R-shRNA injection, HW and HW/ BW were lower in the experimental group than in the SHR group (P<0.05) (Fig. 4).

Ad5-AT1R-shRNA może zmniejszyć stopień zwłóknienia mięśnia sercowego w SHR

Zawartość HYA i kolagenu była istotnie wyższa w grupie SHR niż w grupie WKY (P<0.01). These results suggest that obvious myocardial fibrosis has been found in the cardiac ventricle in the SHR group. The contents of HYA and collagen were significantly lower in the SHR group than in the SHR group (P<0.01) (Fig. 5).

Ad5-AT1R-shRNA znacznie poprawia ultrastrukturę mięśnia sercowego SHR

Ultrastrukturalna obserwacja mięśnia sercowego za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego wykazała, że ​​w grupie WKY błona jądrowa komórek mięśnia sercowego była nienaruszona, miofibryle były czyste, układ był schludny, linie poprzeczne były wyraźne, mitochondria były czyste, a ich brak proliferacji włókien kolagenowych w śródmiąższu mięśnia sercowego (ryc. 6A i B). W grupie SHR błona jądrowa komórek mięśnia sercowego nie była nienaruszona, miofibryle były rozmyte, a ich ułożenie było nieregularne, niektóre miofilamenty zanikły. Można było zauważyć, że linie poprzeczne nie były wyraźne, a mitochondria były spuchnięte i nagromadzone. Ponadto tworzyły się w nim wakuole, aw śródmiąższu mięśnia sercowego obserwowano dużą liczbę hiperplazji siateczki śródplazmatycznej i proliferacji włókien kolagenowych (ryc. 6C i D). W porównaniu z grupami WKY i SHR, w grupie eksperymentalnej błona jądrowa komórek mięśnia sercowego była stosunkowo nienaruszona, miofibryle były jasne, układ był stosunkowo schludny, linie poprzeczne były wyraźne, a mitochondria nie były spuchnięte. Jednak liczba mitochondriów wzrosła w lokalnych regionach i nie było oczywistej proliferacji włókien kolagenowych w śródmiąższu mięśnia sercowego (ryc. 6E i F).

Dyskusja

W niniejszym badaniu odkryliśmy, że Ad5-AT1R-shRNA może znacznie obniżyć ciśnienie krwi SHR i zmniejszyć ekspresję mRNA AT1R w tkance serca. Zrekombinowany wektor adenowirusowy ma pewien efekt celowania, który może być absorbowany przez tkankę zawierającą AT1R po wstrzyknięciu do żyły ogonowej. Ponadto Ad{5}}AT1R-shRNA może zmniejszać przerost mięśnia sercowego w SHR, poprawiać zwłóknienie mięśnia sercowego w SHR poprzez hamowanie ekspresji AT1R i poprawiać ultrastrukturalne zmiany mięśnia sercowego w SHR.

U normalnych szczurów SBP wynosi 110–120 mmHg, a u SHR SBP może przekraczać 200 mmHg. Częstość występowania nadciśnienia wynosiła 100 procent, a te szczury wskazywały również na nadciśnieniową chorobę sercowo-naczyniową. Dlatego ten typ szczura nadaje się do badania nadciśnienia u ludzi. U szczurów z nadciśnieniem samoistnym zwykle zaczyna się pojawiać przerost lewej komory w wieku 10 tygodni, który stopniowo pogarsza się wraz z wiekiem, zawartość kolagenu w mięśniu sercowym znacznie wzrasta, dochodzi do włóknienia mięśnia sercowego i przebudowy śródmiąższowej mięśnia sercowego [12, 13]. Niniejsze badanie wykazało, że w porównaniu z 16-tygodniowymi szczurami WKY, HW, HW/ BW, zawartość HPA i kolagenu w mięśniu sercowym znacząco wzrosła u 16-tygodniowych SHR. Wzrost HW i HW/BW odzwierciedla proliferację i przerost kardiomiocytów oraz wzrost masy serca.

Ponadto HYA jest unikalny dla włókien kolagenowych, a jego zawartość może odzwierciedlać zawartość kolagenu i stopień zwłóknienia. Ponadto wyniki badania mikroskopem elektronowym wykazały, że w grupie SHR błona jądrowa komórek mięśnia sercowego była nienaruszona, miofibryle były rozmyte, ułożenie było nieregularne, niektóre miofilamenty zanikły, linie poprzeczne były niewyraźne, mitochondria były spuchnięte i gromadził się, tworząc w nim wakuole. W śródmiąższu mięśnia sercowego obserwowano dużą liczbę hiperplazji retikulum endoplazmatycznego i proliferacji włókien kolagenowych. Wyniki ujawniły, że przebudowa komór była oczywista u 16-tygodniowego SHR.

Badania nad terapią genową nadciśnienia wykazały, że antysensowne hamowanie ekspresji AT1R i innych członków układu RAS obniżyło ciśnienie krwi i poprawiło zmiany patologiczne serca w SHR [14, 15]. Wyniki poprzednich badań wykazały, że shRNA ulegał silnej ekspresji w nerkach, sercu, wątrobie, aorcie i tkankach nadnerczy. Jest to podobne do wyników tego badania. Ponadto Ad5-ACE-AT1R-shRNA może poprawić ultrastrukturę kardiomiocytów i obniżyć ciśnienie krwi poprzez regulację w dół ekspresji ACE i AT1R.

Podobnie technologia interferencji RNA została wykorzystana we wcześniejszych eksperymentach przeprowadzonych przez innych badaczy [16], gdzie ekspresja genu AT1R była hamowana przez wlew do żyły ogonowej Ad5-AT1RshRNA, który obniżył ciśnienie krwi. Próbowaliśmy odwrócić przerost lewej komory i zwłóknienie mięśnia sercowego poprzez terapię genową. Niniejsze badanie wykazało, że po wielokrotnym wstrzyknięciu Ad5-AT1RshRNA ciśnienie krwi w SHR nie tylko wykazywało oczywisty efekt hipotensyjny, ale także miało efekt superpozycji, to znaczy amplitudy i czasu trwania efektu hipotensyjnego po drugim iniekcji były istotnie wyższe niż po pierwszej iniekcji. Wyniki sugerują, że efekt wielokrotnej iniekcji Ad5-AT1R-shRNA jest lepszy. HW, HW/BW oraz zawartość HYA i kolagenu w sercu były istotnie niższe w grupie eksperymentalnej niż w grupie SHR. Wyniki badania mikroskopem elektronowym wykazały również, że uszkodzenie mięśnia sercowego było istotnie mniejsze w grupie eksperymentalnej niż w grupie SHR, a ekspresja mRNA AT1R była istotnie niższa w grupie eksperymentalnej niż w grupie SHR.

Wszystkie te wyniki ujawniły, że Ad5-AT1RshRNA wywołał efekt interferencji RNA, który zablokował szereg efektów biologicznych połączenia Ang II i AT1R indukowanych przez nadciśnienie i przebudowę komór, co sugeruje, że ta terapia genowa może zmniejszyć tylko ciśnienie krwi, ale także poprawiają przebudowę komór w SHR. Poziom angiotensyny II w osoczu wzrastałby poprzez blokowanie genu receptora angiotensyny II typu 1. W klasycznym działaniu angiotensyny II na jej narządy docelowe pośredniczą głównie dwa receptory błonowe, receptory typu 1 (AT1R) i receptory typu 2 (AT2R), które pośredniczą w różnych funkcjach. Udowodniono, że AT1R promuje wzrost i proliferację, takie jak zwężenie naczyń, zwiększone ciśnienie krwi i kurczliwość serca, oraz pośredniczy w szkodliwych skutkach, w tym dysfunkcji śródbłonka, chorobach sercowo-naczyniowych i stanach zapalnych.

Natomiast uważa się, że AT2R wywołuje przeciwstawne efekty, hamuje wzrost, sprzyja apoptozie, rozszerzaniu naczyń i niedociśnieniu oraz zapobiega przebudowie układu sercowo-naczyniowego [17]. Po wielokrotnym wstrzyknięciu wektor adenowirusowy nie wywoływał oczywistych działań niepożądanych, a efekt hipotensyjny był bardziej długotrwały. Pod koniec eksperymentu w grupie eksperymentalnej ciśnienie krwi zasadniczo powróciło do stanu początkowego. Jednak ekspresja AT1R w mięśniu sercowym była niższa niż w grupie SHR. Nie sugeruje to, że zmiana ciśnienia krwi jest bezpośrednio związana z ekspresją AT1R w mięśniu sercowym. Spekuluje się, że system RAS tkanki miejscowej jest głównie zaangażowany w rolę zwłóknienia tkanki.

Jednym z ograniczeń tego badania było to, że ciśnienie krwi powinno być mierzone inwazyjnie za pomocą telemetrii radiowej lub przynajmniej systemu na uwięzi, ale ze względu na problemy techniczne mogliśmy korzystać tylko z pomiarów ciśnienia krwi za pomocą mankietu ogonowego, co nie było zbyt wiarygodne.

Wniosek

Terapia genowa wykorzystująca technologię RNAi do hamowania ekspresji AT1R może być stosowana nie tylko jako nowa metoda obniżania ciśnienia krwi, ale oczekuje się również, że będzie nową metodą poprawy przebudowy mięśnia sercowego i niewydolności serca. Niemniej jednak obecnie ta nowa technologia ogranicza się do badań na zwierzętach. Bezpieczeństwo i skuteczność jego stosowania w leczeniu ludzi muszą być dalej badane. Na przykład bezpieczeństwo i skuteczność wektora transdukcji oraz to, czy tę strategię terapii genowej można zastosować do innych typów zmian w mięśniu sercowym, wymagają dalszych badań.

Bibliografia

1. Suthahar N, Meijers WC, Silljé HHW, de Boer RA. Od stanu zapalnego do zwłóknienia — molekularne i komórkowe mechanizmy przebudowy tkanki mięśnia sercowego i perspektywy różnych możliwości leczenia. Przedstawiciel Curr Heart Fail 2017; 14: 235–250. [Linia medyczna] [Odnośnik]

2. Hasan HF, Radwan RR, Galal SM. Czynnik wzmacniający bradykininę wyizolowany z jadu skorpiona Leiurus quinquestriatus łagodzi kardiomiopatię u napromieniowanych szczurów poprzez przebudowę szlaku RAAS. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47: 263-273. [Linia medyczna] [Odnośnik]

3. Harvey A, Montezano AC, Lopes RA, Rios F, Touyz RM. Zwłóknienie naczyń w starzeniu i nadciśnieniu: mechanizmy molekularne i implikacje kliniczne. Can J Cardiol. 2016; 32: 659-668. [Linia medyczna] [Odnośnik]

4. Wu J, Montaniel KR, Saleh MA, Xiao L, Chen W, Owens GK i in. Pochodzenie komórek produkujących macierz, które przyczyniają się do zwłóknienia aorty w nadciśnieniu. Nadciśnienie. 2016; 67: 461–468. [Linia medyczna] [Odnośnik]

5. Lu M, Xing H, Xun Z, Yang T, Ding P, Cai C i in. Dostarczanie małego RNA na bazie egzosomów: postęp i perspektywy. Asian J Pharm Sci. 2018; 13: 1–11. [Linia medyczna] [Odnośnik]

6. Xiao C, Qiu L, Zen Q. Konstrukcja shRNA ukierunkowanego na szczurze receptory angiotensyny II typu 1 i jej RNAi w cytoplazmie. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2006; 26: 4–8. [Linia medyczna] [Odnośnik]

7. Xiao CS, Zhang JL, Qiu L. [Wpływ shRNA ukierunkowany na receptor angiotensyny II typu 1 na ciśnienie krwi i ekspresję mRNA AT1R u szczurów z samoistnym nadciśnieniem]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2007; 35: 354–358 chiński. [linia medyczna]

8. Zhang JQ, Sun HL, Ma YX, Wang DW. [Wpływ interferencji RNA ukierunkowanej na receptor angiotensyny 1a na ciśnienie krwi i przerost mięśnia sercowego szczurów z nadciśnieniem 2K1C]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2006; 86: 1138–1143. [linia medyczna]

9. Reaves PY, Wang HW, Katovich MJ, Gelband CH, Raizada MK. Tłumienie nadciśnienia przez ogólnoustrojowe dostarczanie wektora retrowirusowego zawierającego antysensowny cDNA receptora angiotensyny II typu I. Metody. 2000; 22: 211–218. [Linia medyczna] [Odnośnik]

10. Guo K, Lan CZ, Yu TT, Huang LL, Wang XH, Pan C i in. Wpływ formuły Xin-Ji-Er-Kang na nadciśnienie indukowane przez 2K1C i przebudowę układu sercowo-naczyniowego u szczurów. J Etnofarmakol. 2014; 155: 1227-1235. [Linia medyczna] [Odnośnik]

11. Paulis L, Matuskova J, Adamcova M, Pelouch V, Simko J, Krajcirovicova K, et al. Regresja przerostu lewej komory i przebudowy aorty u szczurów z nadciśnieniem tętniczym z niedoborem NO: wpływ L-argininy i spironolaktonu. Acta Physiol (Oxf). 2008; 194: 45–55. [Linia medyczna] [Odnośnik]

12. Kang L, Ge CJ, Hu SJ. Korzystny wpływ atorwastatyny na przebudowę lewej komory u szczurów z samoistnym nadciśnieniem. Farmakologia. 2007; 80: 120–126. [Linia medyczna] [Odnośnik]

13. Bessa ASM, Jesus ÉF, Nunes ADC, Pontes CNR, Lacerda IS, Costa JM i in. Stymulacja osi ACE2/Ang-(1-7)/Mas u ciężarnych szczurów z nadciśnieniem łagodzi dysfunkcję sercowo-naczyniową u potomstwa dorosłych samców. Nadciśnienie Res. 2019; 42:1883-1893. [Linia medyczna] [Odnośnik]

14. Kimura B, Mohuczy D, Tang X, Phillips MI. Tłumienie nadciśnienia i przerostu serca przez wirusa związanego z adenowirusem dostarczającego antysensownego angiotensynogenu. Nadciśnienie. 2001; 37: 376–380. [Linia medyczna] [Odnośnik]

15. Zhou H, Bian YF, Li ML, Gao F, Xiao CS. [Wpływ interferencji RNA ukierunkowanej na receptor angiotensyny 1 i enzym konwertujący angiotensynę na ciśnienie krwi i przebudowę mięśnia sercowego u szczurów z nadciśnieniem samoistnym]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2010; 38: 60–66 (po chińsku). [linia medyczna]

16. Raja MAG, Katas H, Amjad MW. Projektowanie, mechanizm, dostarczanie i terapeutyki siRNA kanonicznego i substratu Dicer. Asian J Pharm Sci. 2019; 14: 497–510. [Linia medyczna] [Odnośnik]

17. Dasgupta C, Zhang L. Receptory angiotensyny II i odkrywanie leków w chorobach układu krążenia. Lek Discov dzisiaj. 2011; 16: 22–34. [Linia medyczna] [Odnośnik]

For more information:1950477648nn@gmail.com