ABSTＲAKT

Cel: Wyjaśnienie, czy ogólnecistanozydy(GC) poprawia sięZaburzenia funkcji poznawczychszybko starzejące się myszy (SAMP8) poprzez pośredniczenie w specyficznych receptorach androgenowych (AＲ) wregulacja ekspresji białka synaptycznego． 

Metody: Łącznie 76 7-miesięczne samce myszy SAMP8 podzielono losowo na grupę modelową, grupę GC, grupę GC + flutamid (F), grupę GC + fulwestrant (ICI), grupę F i grupę ICI. Funkcje uczenia się i pamięci myszy w każdej grupie testowano za pomocą labiryntu wodnego Morrisa. Do badania wykorzystano Western blot i RT-PCRpoziom ekspresji synaptofizyny(SYN), gęstość postsynaptyczna – 95 (PSD – 95) i czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) myszy w każdej grupie.

Wyniki: GC znacznie poprawiły funkcje uczenia się i poznawcze myszy SAMP8.

W porównaniu z grupą GC, funkcja uczenia się i pamięci myszy w grupie GC + F i GC + ICI została znacznie obniżona. Wyniki Western blot i RT-PCR wykazały, że poziom ekspresji BDNF, SYN i PSD-95 był znacząco zwiększony na poziomie białka i genu w grupie GC w porównaniu z grupą Model ( P ＜ 0． {{ 11}}5) ． Poziom ekspresji SYN był podwyższony w grupie GCs + F i GCs + ICI, a poziom ekspresji BDNF i PSD - 95 był znacząco obniżony w grupie GCs + F i GCs + ICI w porównaniu z grupą GCs ( P ＜ 0． 05) ．

Wniosek: GC mogą specyficznie pośredniczyć w AＲ, zwiększając plastyczność synaptyczną u myszy SAMP8, co z kolei poprawia funkcje uczenia się i poznawcze.

SŁOWA KLUCZOWE:Ogólne cistanozydy; Receptor androgenowy; Plastyczność synaptyczna; Myszy SAMP8

Suplement Cistanche Poprawa funkcji poznawczych Suplement diety PhGs75% Ech 30% Act 12%

Choroba Alzheimera(AD) jest powszechneneurologiczna choroba zwyrodnieniowa, klinicznie charakteryzujący się postępującym pogorszeniem funkcji poznawczych oraz zmianami stanu psychicznego i psychicznego [1]. Badania wykazały, że poziom testosteronu u mężczyzn chorych na AD jest znacznie niższy niż u zdrowych mężczyzn.

Tenfunkcje poznawcze pacjentówpóźniej uległa poprawie w różnym stopniuketonowa terapia zastępcza[2], co wskazuje, że związany z wiekiem spadek poziomu androgenów może być czynnikiem ryzyka rozwoju AZS u starszych mężczyzn.

Całkowita zawartość glikozydów Cistanche desericola (ogólne cistanozydy, GC) to jeden z głównych ekstraktów Cistanche Deserticola, który może poprawić proces uczenia się związany z AD iZaburzenia funkcji poznawczych[3]. Ponadto podawanie GC przez zgłębnik znacząco zwiększało poziom testosteronu u zwierząt [4]. GC pełnią również funkcję promowania yang i mogą wywierać wpływ

Efekty farmakodynamiczne podobne do androgenów. Poprzednie badania donosiły, że testosteron może poprawiać funkcje uczenia się i funkcje poznawcze zwierząt modelowych AD, a proces ten opiera się na specyficznych receptorach androgenowych, w których pośredniczy receptor androgenowy (receptor androgenowy, AR) [5].

Powszechnie wiadomo, że zaburzenia funkcji poznawczych u pacjentów z AD są ściśle powiązane z plastycznością synaptyczną. Jednak specyficzny mechanizm, dzięki któremu GC regulują plastyczność synaptyczną, a tym samym poprawiają funkcje uczenia się i poznawcze, jest nadal niejasny. Celem tego badania było sprawdzenie, czy GC pośredniczą w specyficznym AR, wpływając na plastyczność synaptyczną, a tym samym poprawiając funkcje uczenia się i poznawcze w AD.

1 Materiały i metody

1.1 Zwierzęta doświadczalne i sprzęt

Samce 3-miesięcznych myszy SAMP8 zakupiono w Szkole Medycznej Uniwersytetu w Pekinie (SCXK [Pekin] 2016-0010) i hodowano do 7 miesiąca życia. Zwierzęta trzymano w czystym środowisku w temperaturze (24 ± 1) stopnia

Zwierzętom zapewniono naturalne oświetlenie, swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz zapewniono opiekę humanitarną zgodnie z zasadami 3R dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych. To badanie eksperymentalne zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Doświadczalnej Zwierząt Baotou Medical College (Baotou Medical College nr 20201102).

Głównymi odczynnikami w doświadczeniu są:Glikozydy całkowite Cistanche Deserticola(GCs, Xi'an Ciyuan Biological Co., Ltd.); antagonista receptora androgenowego – flutamid (Sigma Company, USA); antagonista receptora estrogenowego-fulwestrant (ICI 182780, USA) Med Chem Express); Królicze przeciwciało przeciw mysiem BDNF,

przeciwciało PSD-95, przeciwciało SYN, przeciwciało -aktyna (Proteintech Company ze Stanów Zjednoczonych); roztwór do elektroforezy białek, roztwór do przenoszenia białek, TEMED, bufor akryloamidowy, nadsiarczan amonu, Tris (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.); Zestaw do syntezy cDNA, ilościowe wykrywanie fluorescencji talentów

Zestaw odczynników (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.) itp. Główny sprzęt eksperymentalny obejmuje zbiornik do elektroforezy na płytkach pionowych, aparat do elektroforezy, zbiornik transferowy, wytrząsarkę do odbarwiania (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), system analizy obrazowania żelu białkowego (Shanghai Tanon Technology Co., Ltd.), instrument do ilościowego fluorescencyjnego PCR w czasie rzeczywistym (USA Roche) itp.

1.2 Grupowanie i administracja

Dwie myszy zdechły w sposób naturalny podczas karmienia, a pozostałe 78 myszy podzielono losowo na grupę modelową, grupę GC, grupę GC + flutamid (F), grupę GC + fulwestrant (ICI), grupę F, ICI

Grupy po 13 zwierząt każda. Z wyjątkiem grupy modelowej, grupy F i grupy ICI, pozostałym grupom podawano w sposób ciągły GC w dawce 50 mg/(kg·d) przez 30 dni.

Od 24 dnia po podaniu GKS, grupie GKS + flutamid (F) i grupie GC + fulwestrant (ICI) podawano dootrzewnowy zastrzyk F (5 mg/kg/d) 30 minut po podaniu GC przez sondę. ), ICI (1 mg/kg/d), wstrzyknięcie ciągłe przez 7 dni. Dostosuj stężenie dawkowania, aby zapewnić, że maksymalna objętość żołądka myszy wynosi 0,5 ml, 1 raz/dzień.

1. 3 Test labiryntu wodnego Morrisa

Myszy przystosowały się do środowiska wodnego dzień wcześniej. Labirynt wodny Morrisa trwał 6 dni. Pierwsze 5 dni to test pozycjonowania i nawigacji. Myszy trenowano raz dziennie w każdym z czterech kwadrantów przez 1 minutę za każdym razem. Każdy interwał treningowy trwał 15 minut i zapisy były rejestrowane w tym samym czasie. Opóźnienie ucieczki w teście pozycjonowania i nawigacji zwierzęcia; szóstego dnia wyjmij platformę z wody i przeprowadź test eksploracji kosmosu. Zapisz liczbę przejść przez platformę i procent czasu spędzonego w docelowym kwadrancie myszy. docelowy kwadrant) i trajektoria pływania eksploracji przestrzennej (Trajektoria pływania testu sondy przestrzennej) i inne wskaźniki.

1.4 Wykrywanie metodą Western blot

Ekspresja białek związanych z synapsami SYN, PSD-95 i BDNF. Po teście labiryntu wodnego Morrisa wszystkie myszy rutynowo znieczulono, odcięto im głowy, usunięto mózgi i pozbawiono hipokampów. Tkankę hipokampa poddano lizie białek, rozbito ultradźwiękami w temperaturze 4 stopni, pozostawiono na lodzie na 30 minut i wirowano przy 12,000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4 stopni. Pobrano supernatant i zmierzono stężenie białka metodą BCA. Po załadowaniu białka należy wykonać elektroforezę w żelu stackującym przy stałym napięciu 80 V, elektroforezę w żelu separacyjnym przy stałym napięciu 120 V oraz transfer na mokro przy stałym przepływie 300 mA; wyjąć membranę PVDF, zablokować ją 5% odtłuszczonym mlekiem na 80 minut w temperaturze pokojowej i przemyć membranę trzykrotnie TBST. 15 min/czas, przeciwciało pierwszorzędowe inkubowano przez noc na wytrząsarce w temperaturze 4 stopni; następnego dnia membranę przemyto 3 razy TBST.

15 min/czas, przeciwciało drugorzędowe inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, następnie przeprowadzono wywoływanie koloru ECL i przeprowadzono obrazowanie za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. -aktynę zastosowano jako wzorzec wewnętrzny, a wartość gęstości optycznej prążka analizowano przy użyciu oprogramowania Image J.

1. 5ＲRT-PCRＲWykrywanie

Ekspresję mRNA SYN, PSD-95 i BDNF ekstrahowano z całkowitego RNA tkanki hipokampa zgodnie z metodą ekstrakcji Trizolem, a cDNA wygenerowano po odwrotnej transkrypcji. Do ilościowego wykrywania względnej fluorescencji zastosowano zestaw do ilościowego wykrywania fluorescencji Talent. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, a wyniki przeliczono na 2 - ΔΔCT. Startery mysiej aktyny, SYN, PSD-95 i BDNF zostały zaprojektowane przez Shanghai Sangon Company, a sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1.

1.6 Analiza statystyczna

Za pomocą oprogramowania statystycznego SPSS 25. 0 do przetwarzania, do rysowania wykresów statystycznych użyto oprogramowania Graphpad Prism 8, a do porównania średnich par z wielu próbek zastosowano jednokierunkową analizę ANOVA. P. <0. 05 oznacza, że ​​różnica jest istotna statystycznie.