Wpływ glieozydów cistanche na uczenie się funkcji poznawczych i plastyczność synaptyczną u szczurów modelowych pozbawionych snu

ABSTRAKCYJNY

Cel:Aby zbadać, czy glikozydy cistanche mogą poprawić funkcje uczenia się i poznawcze szczurów modelowych pozbawienia snu poprzez regulację plastyczności synaptycznej.

Metody: Pięćdziesiąt samców szczurów Wistar podzielono losowo na ślepą grupę kontrolną (kontrola), grupę kontrolną platformy (PC), grupę modelową (model),glikozydy z grupy cistanche (GC)i grupa estazolamu (Est). Model pozbawienia snu szczurów przygotowano za pomocą zmodyfikowanej wieloplatformowej metody środowiska wodnego. Do wykrycia przestrzennych funkcji poznawczych i zmian emocjonalnych szczurów wykorzystano labirynt wodny Morrisa i test otwartego pola. Do obserwacji zmian w morfologii i ilości komórek nerwowych w komórkach nerwowych zastosowano barwienie Nisslaobszar CAl hipokampa szczurów. Do wykrycia poziomów ekspresji synaptofizyny (SY'N), substancji gęstej w błonie postsynaptycznej 95 ( PSD -95 ) zastosowano Western blot i R'T - PCR orazmózgowy czynnik neurotroficzny (BDNF). 

Wyniki;Wyniki labiryntu wodnego Morrisa pokazały, że w porównaniu z grupą kontrolną,zdolność uczenia się i zdolności poznawcze szczuróww grupie Model uległ znacznemu zmniejszeniu ( P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasulepszone leczenie GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the poziomy ekspresji białek i genów BDNF, SYN i PSD -95w grupie Mlodel uległy znacznemu zmniejszeniu ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

ZIOŁOWE SUPLEMENTY DO FORMULACJI CISTANCHE DLAPOPRAWA NAUKI I FUNKCJI POZNAWCZYCH

SŁOWA KLUCZOWEGlikozydy cistanche; hipokamp; Brak snu; Uczenie się i pamięć; Lęk; Plastyczność synaptyczna

Zaburzenia snu (SD)jestzaburzenie funkcjonalne polegające na nieprawidłowym śniespowodowane szeregiem złożonych czynników, npbezsenność, senność, Iłatwe przebudzenie. W ostatnich latachczęstość występowania SDstopniowo wzrasta. Powiązane badania wykazały, że SD może powodowaćchoroby układu krążenia,dysfunkcja metaboliczna,choroby immunologiczne, Icentralny układ nerwowychoroby zwyrodnieniowe, takie jak choroba Alzheimera [1]. SD może powodować uszkodzenie oksydacyjne neuronów hipokampa, powodować dysfunkcje poznawcze i powodować zmiany nastroju, takie jak lęk i depresja [2]. Cistanche Deserticola to cenny surowiec leczniczy, który w Chinach może być stosowany zarówno jako lek, jak i żywność. Ma działanie tonizujące nerki i uzupełniające qi, nawilżające jelita, wspomagając wypróżnienia i wzmacniające yang. Główny ekstrakt Cistanche desericola, glikozydy cistanche (GC), ma działanie przeciwutleniające, przeciwapoptotyczne, chroniące wątrobę i neuroprotekcyjne [3]. Nasze poprzednie badania wykazały, że GC mogą poprawić funkcje uczenia się i poznawcze myszy SAMP8, odgrywając rolę przeciwutleniającą i przeciwapoptotyczną [4].

Powiązane badania wykazały, że dysfunkcje poznawcze spowodowane SD są ściśle powiązane z plastycznością synaptyczną [5]. Istnieje jednak niewiele raportów na temat mechanizmu, dzięki któremu GC regulują plastyczność synaptyczną i poprawiają upośledzenie uczenia się i pamięci oraz pogorszenie funkcji poznawczych u szczurów wywołane brakiem snu. Dlatego też niniejsze badanie ma na celu zbadanie, czy GC wpływają na plastyczność synaptyczną poprzez regulację ekspresji markerów związanych z synapami, poprawiając w ten sposób funkcje uczenia się i poznawcze szczurów z modelami pozbawienia snu, a także dostarczenie nowych pomysłów i planów leczenia GC w leczeniu uczenia się i funkcji poznawczych upośledzenie spowodowane zaburzeniami snu.

1 Materiały i metody

1.1 Zwierzęta doświadczalne

Samce szczurów rasy Wistar w wieku od 6 do 8 tygodni, o wadze 280 do 300 g, zakupiono od Pekinu Sibeifu z licencją na hodowlę zwierząt [SCXK (Pekin) 2019-0010). Wszystkie zwierzęta trzymano w Animal Experiment Center w Baotou Medical College w następujących warunkach: temperatura (24 ± 1) stopnia, wilgotność 50% do 55%, 12 godzin światła i 12 godzin ciemności oraz bez ograniczeń dotyczących pożywienia i wody. Eksperyment ten został zatwierdzony przez szkolną komisję etyki [Baoyi Lunshen 2022 nr (63)].

1.2 Główne odczynniki i instrumenty

Całkowitą ilość glikozydów Cistanche Deserticola zakupiono od Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (numer partii: KSM20220609011); Tabletki estazolamu zakupiono od CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (numer serii: 044220343); bufor do ładowania białka (P1015), bufor do lizy RIPA (R0010), roztwór chemiluminescencyjny (PE0010) itp. zakupiono od Beijing Solebao; substancję o gęstości postsynaptycznej w przeciwciele 95 (PSD-95) (AB192757) i przeciwciele synaptofizyny (SYN) (ab32127) zakupiono od Abcam, USA Company; mózgowy czynnik neurotroficzny (BDNF) (48503-2) i -aktynę (52901) zakupiono od SAB Company, USA; kozie przeciwkrólicze przeciwciało wtórne IgG (SA00001-20) zakupiono od firmy Proteintech Company, USA; melatoninę szczurzą (MT) i zestaw badań naukowych ELISA (MM-0657R1) zakupiono od Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Krajalnica do parafiny (Leica, Niemcy); mikroskop optyczny (Leica, Niemcy);

Labirynt wodny Morrisa, pudełko testowe w otwartym terenie (Shanghai Xinruan); aparat do elektroforezy pionowej (Beijing Liuyi Company); wytrząsarka do odbarwiania (Beijing Liuyi Company); system analizy obrazowania białek (Shanghai Tanon Technology); instrument do ilościowej fluorescencji PCR (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Metody eksperymentalne

1.3.1 Grupowanie zwierząt i podawanie leków

50 samców szczurów Wistar podzielono losowo na ślepą grupę kontrolną (grupa kontrolna), grupę kontrolną platformy (platforma kontrolna, grupa PC), grupę modelową (grupa modelową), grupę całkowitych glikozydów Cistanche Deserticola (grupa GCs) , 50 mg/kg) i grupa estazoliny (grupa Est, 0,54 mg/kg), po 10 szczurów w każdej grupie. Grupie kontrolnej i grupie PC podano przez zgłębnik 0,9% roztwór soli fizjologicznej. Wszystkim grupom podawano zgłębnik o godzinie 7 rano każdego dnia po rozpoczęciu modelowania, a zgłębnik trwał 21 dni.

1.3. 2. Przygotowanie zwierzęcego modelu deprywacji snu

Model pozbawienia snu opracowano przy użyciu zmodyfikowanej metody wieloplatformowego środowiska wodnego [6]. Sprzętem doświadczalnym był prostokątny zbiornik na wodę z żywicy polietylenowej o wymiarach 130 cm x 50 cm x 45 cm. W zbiorniku na wodę umieszczono małą platformę o średnicy 5 cm i wysokości 20 cm. Platforma grupy PC miała średnicę 10 cm i wysokość 20 cm. Zbiornik na wodę napełniono wodą do głębokości około 18 cm i utrzymywano temperaturę wody na poziomie (20 ± 1) stopnia. Na tydzień przed rozpoczęciem doświadczenia szczury umieszczano codziennie na 60 minut w boksie pozbawionym snu w celu zapoznania się z otoczeniem. Po ustaleniu modelu, z wyjątkiem grupy kontrolnej, szczury z każdej grupy umieszczano na małej platformie codziennie od 8:00 do 20:00 w celu pozbawienia snu przez 21 kolejnych dni.

Wszystkie szczury miały swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz swobodnie poruszały się po platformie. Cykl światła i ciemności trwał 12 godzin każdego dnia.

1. 3. 3 Eksperyment z labiryntem wodnym Morrisa

Labirynt wodny Morrisa podzielono na 4 obszary wypełnione wodą, a platformę umieszczono w 4. ćwiartce. Poziom wody znajdował się około 2 cm nad platformą. Do wody dodano jadalną melaninę spożywczą i utrzymywano temperaturę wody na poziomie (25 ± 1) stopnia. (1) Eksperyment z nawigacją pozycjonującą: Wybrano środek każdego obszaru i delikatnie umieszczono szczury w wodzie. Pozwolono im swobodnie zwiedzać. Rejestrowano czas potrzebny szczurom na znalezienie platformy docelowej w ciągu 60 sekund. Szczury, które nie znalazły platformy, prowadzono na platformę i pozostawały tam przez 20 sekund. Szkolenie kontynuowano przez 5 dni. (2) Test eksploracji przestrzennej: Szóstego dnia platformę usunięto i szczury umieszczono w wodzie od środka drugiej ćwiartki pod ścianą. Rejestrowano, ile razy szczury minęły platformę w ciągu 120 sekund i czas przebywania w 4. ćwiartce.

1. 3. 4 Doświadczenie w otwartym terenie

Wykorzystano pudełko doświadczalne o wymiarach 100 cm × 100 cm × 50 cm, którego dno podzielono na 9 siatek. Każdą grupę szczurów umieszczono wcześniej w pomieszczeniu doświadczalnym na otwartym terenie, aby przystosować się do środowiska wewnętrznego na 60 minut. Na początku eksperymentu szczury testowe umieszczano kolejno w stałych rogach pudełka doświadczalnego z otwartym polem i rejestrowano liczbę czasów stania, odległość ruchu i czas statyczny szczurów w ciągu 5 minut za pomocą oprogramowania do analizy behawioralnej. Podczas eksperymentu wymagana była cisza, a pomiędzy dwoma eksperymentami urządzenie eksperymentalne przecierano odpowiednio wodą i alkoholem, aby zapach pierwszego szczura nie wpłynął na ocenę zachowania następnego szczura.

1. 3. 5 Test immunoenzymatyczny (ELISA)

Wykrywanie poziomów MT w surowicy u szczurów Szczury znieczulono poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe i pobrano 5 ml krwi z aorty brzusznej. Po odczekaniu 30 minut w temperaturze pokojowej krew odwirowano w celu uzyskania surowicy. Do każdej studzienki dodano 40 µl rozcieńczalnika próbki, a następnie 10 µl badanej próbki. Po uszczelnieniu folią uszczelniającą płytkę inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 30 minut. Przemyto 5 razy, dodano 50 µl roztworu do znakowania enzymatycznego, płytkę zamknięto folią uszczelniającą i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 30 minut. Przemyto 5 razy, a następnie dodano kolejno roztwór wywołujący zabarwienie i roztwór kończący reakcję. Wartość OD każdej studzienki mierzono za pomocą znacznika enzymatycznego przy długości fali 450 nm.

1. 3. 6 Barwienie Nissla

Z każdej grupy wybrano trzy szczury, po czym usunięto tkankę mózgową przez dekapitację i utrwalono 4% roztworem polioksyetylenu. Tkankę odwodniono, zanurzono w roztworze wosku, zatopiono i pocięto konwencjonalnymi metodami. Plasterki przechowywano o grubości 5 µm, płukano PBS, barwiono 0,1% błękitem toluidynowym przez 0,5 h, różnicowano 95% alkoholem, odwadniano 100% alkoholem, przezroczystość ksylenem i uszczelnione neutralną gumą. Zmiany w morfologii i liczbie neuronów w regionie CA1 hipokampa szczura obserwowano pod mikroskopem i zbierano obrazy.

1. 3. 7 Eksperyment Western blot

Z każdej grupy wybrano cztery szczury i hipokamp wyizolowano przez dekapitację. Tkankę hipokampa zmieszano z buforem do lizy RIP A w środowisku łaźni lodowej i tkankę odwirowano w celu uzyskania supernatantu. Stężenie białka oznaczano metodą BCA. Do elektroforezy dodano 20 µg białka z buforem obciążającym białko. Po zakończeniu elektroforezy białek błonę przenoszono przy stałym przepływie 300 mA, blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku, przeciwciało pierwotne inkubowano w temperaturze 4°C przez noc, a przeciwciało wtórne inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po zastosowaniu roztworu wywołującego kolor prążki białek poddano analizie statystycznej przy użyciu systemu analizy obrazowania chemiluminescencyjnego.

1. 3. 8 Eksperyment RT-PCR

Z każdej grupy wybrano trzy szczury w celu przygotowania homogenatu tkanki hipokampa. Całkowity RNA z płynu tkankowego ekstrahowano metodą Trizol i mierzono jego stężenie. Do odwrotnej transkrypcji użyto zestawu do syntezy cDNA fastking i przeprowadzono ilościową reakcję amplifikacji fluorescencji przy użyciu zestawu ilościowego fluorescencji w celu wykrycia względnego poziomu ekspresji mRNA białka pokrewnego synaptycznie. Wyniki analizowano przy użyciu 2-ΔΔCt. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1 Sekwencje starterów RT-PCR

1.4 Metody statystyczne

Wyniki danych zgodne z rozkładem normalnym wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (x ± s), a analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 9.5. Do porównania wielu próbek wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji, a P < 0,05 wskazało, że różnica była istotna statystycznie.