Ciemnienie skóry jest konsekwencją nagromadzenia melaniny pigmentowej skóry. Aby temu zaradzić, w handlu dostępne są różne środki rozjaśniające skórę, z których większość hamuje syntezę melaniny. Dekoloryzacja melaniny to alternatywna metoda rozjaśniania skóry. W tym badaniu wykazaliśmy, że peroksydaza ligninowa (LiP), zewnątrzkomórkowy enzym oczyszczony z Phanerochaete chrysosporium NK-1 wyizolowany z gleby leśnej, może skutecznie rozkładać i odbarwiać melaninę in vitro. Zbadano warunki odbarwiania, w tym pH, temperaturę, czas inkubacji, stężenie enzymu i dodatek mediatora, aby zoptymalizować warunki reakcji. Wyniki wskazują, że pH 3, 40 stopni, 15 IU/ml i 10 godzin inkubacji były optymalnymi warunkami do odbarwienia melaniny. Stwierdzono również, że zastosowanie mediatora, alkoholu weratrylu, skutecznie zwiększa skuteczność dekolonizacji melaniny, z odbarwieniem do 92 procent. Wyniki skaningowej mikroskopii elektronowej wykazały puste przestrzenie na traktowanych granulkach melaniny w porównaniu z próbką nietraktowaną, co wskazuje na degradację melaniny. Zaobserwowano zmiany w obszarze linii papilarnych melaniny. Na przykład między liczbami falowymi 1500–500 cm-1 obecność nowych pików w traktowanej melaninie przy 1513, 1464 i 1139 cm-1 CH2, zgięcie CH3 i rozciągnięcie C–O–C reprezentowały zmiany strukturalne. W odbarwionej melaninie wykryto również nowy pik przy 2144 cm-1 (rozciągnięcie alkinylu C≡C). Badanie cytotoksyczności wykazało, że potraktowana melanina i LiP mają niewielkie działanie cytotoksyczne; jednak mediator alkoholu weratrylu może powodować wysoką śmiertelność, co sugeruje, że jego użycie powinno być skrupulatnie testowane w formułowaniu produktów zdrowotnych i do pielęgnacji skóry. Wyniki badania sugerują, że LiP wytwarzany przez Phanerochaete chrysosporium ma potencjał do wykorzystania w przemyśle medycznym i kosmetycznym, zwłaszcza do opracowywania biopochodnych kosmetycznych środków wybielających.

Według odpowiednich badań cistanche jest pospolitym ziołem znanym jako „cudowne zioło, które przedłuża życie”. Jego głównym składnikiem jest cistanozyd, który ma różne działanie, takie jak przeciwutleniacz, działanie przeciwzapalne i promowanie funkcji odpornościowych. Mechanizm między cistanche a wybielaniem skóry polega na działaniu przeciwutleniającym glikozydów cistanche. Melanina w skórze człowieka powstaje w wyniku utleniania tyrozyny katalizowanego przez tyrozynazę, a reakcja utleniania wymaga udziału tlenu, dlatego wolne rodniki tlenowe w organizmie stają się ważnym czynnikiem wpływającym na produkcję melaniny. Cistanche zawiera cistanoside, który jest przeciwutleniaczem i może zmniejszać wytwarzanie wolnych rodników w organizmie, hamując w ten sposób produkcję melaniny.

Kliknij Cistanches Herba do wybielania

Po więcej informacji:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanina to grupa złożonych, opornych i wszechobecnych policyklicznych biopolimerowych pigmentów skóry wytwarzanych przez wyspecjalizowane komórki skóry zwane melanocytami 1,2. Jego podstawową funkcją jest ochrona skóry przed szkodliwym promieniowaniem UV światła słonecznego poprzez tworzenie czapeczek nadjądrowych wokół DNA komórek skóry 3. Poza tym odpowiada za różne kolory skóry poprzez pochłanianie różnych wolnych rodników w cytoplazmie. Większość z tych środków rozjaśniających skórę uzyskanych z zasobów naturalnych hamuje wytwarzanie melaniny w komórkach skóry poprzez hamowanie enzymów tyrozynazy, hamowanie biosyntezy pigmentu oraz poprzez niektóre alternatywne szlaki. Różne związki, takie jak hydrochinon, etery mono-benzylowe hydrochinonu, rtęć, kortykosteroidy i arbutyna są stosowane w komercyjnych preparatach kosmetyków wybielających skórę, jednak ich stosowanie wiąże się z poważnymi skutkami ubocznymi. Na przykład zgłasza się, że rtęć powoduje uszkodzenie nerek, a ołów powoduje niepokój, depresję i psychozy 4,5. Stosowanie kortykosteroidów może powodować zespół Cushinga, cukrzycę, nadciśnienie, niedoczynność kory nadnerczy, immunosupresję, ścieńczenie skóry, trądzik, zapalenie skóry i nadmierne owłosienie 6. Tain i in. (2009) podali, że stosowanie arbutyny w kosmetykach wybielających skórę było skuteczne przy stężeniach do 3 procent, ale dalszy wzrost stężenia powodował efekty cytotoksyczne. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, zastosowanie tych inhibitorów w kosmetykach wybielających skórę spotkało się z szeroką krytyką organów ds. BHP. Zaproponowano, że kosmetyki wybielające skórę mogą osiągnąć do 2021 roku 155,44 miliarda dolarów przy rocznej stopie wzrostu na poziomie 4,9%. Ze względu na rosnące zapotrzebowanie na bezpieczne i naturalne środki wybielające skórę na całym świecie, enzymatyczna dekolonizacja melaniny spotkała się z dużym zainteresowaniem 7-9.

Zewnątrzkomórkowe enzymy drobnoustrojów, takie jak lakaza, peroksydaza manganu i peroksydaza ligniny (LiP), zostały wcześniej przetestowane pod kątem odbarwiania melaniny i są uważane za potencjalną ekologiczną alternatywę dla toksycznych chemikaliów 1. Spośród nich LiP okazał się bardzo skuteczny w odbarwianiu melaniny ze względu na jej wysoki potencjał redoks do utleniania alkoholu weratrylowego (VA) niż inne pokrewne enzymy. Pomimo wysokiego potencjału utleniania i wydajnej katalizy melaniny, produkcja objętościowa i trudności w oczyszczaniu są głównymi ograniczeniami dla komercyjnych zastosowań LiP w środkach wybielających skórę. Ponadto LiP traci swoją aktywność enzymatyczną dla dekolonizacji melaniny pod nadmiarem nadtlenku wodoru, który jest uważany za krytyczny dla utleniania melaniny. Oprócz swojej ważnej roli, H2O2 dezaktywuje LiP, zmniejszając w ten sposób wydajność katalityczną enzymu.

Wyniki

Odbarwienie melaniny przez Phanerochaete chrysosporium NK‑1.Szczepy grzybów badano pod kątem odbarwiania melaniny. Grzyby inokulowano punktowo na podłożu stałym zawierającym melaninę i VA jako induktor LiP. Po siedmiu dniach inkubacji Phanerochaete chrysosporium NK -1 wykazał zdolność odbarwiania melaniny, jak pokazano na ryc. 1.

Warunki optymalnego odbarwiania melaniny.pH. Oczyszczony enzym zastosowano do odbarwiania syntetycznej melaniny in vitro. Zaobserwowano wpływ różnych warunków na odbarwienie melaniny 10. Najpierw zbadano wpływ pH na odbarwianie melaniny przez LiP. W tym celu przeprowadzono odbarwianie melaniny w różnych warunkach pH wahających się od 2,{4}} do 6,0 w temperaturze 30 stopni, zarówno w obecności, jak i przy braku VA przez okres inkubacji wynoszący 6 godzin. Wyniki na ryc. 2 pokazują, że ogólnie odbarwienie melaniny w obecności VA było wyższe we wszystkich warunkach pH. Szczególnie jest bardziej widoczny w warunkach o wyższym pH. VA może pomóc w tworzeniu rodników kationowych 11. Rodniki te mają znacznie wyższy potencjał redoks do niespecyficznego ataku na wiązania C-C w melaninie i powodują odbarwienie 12. W obecności VA osiągnięto najwyższe odbarwienie melaniny wynoszące 88 procent przy pH 3, a następnie 71 procent przy pH 2, podczas gdy najniższe odbarwienie melaniny wynoszące 39 procent zaobserwowano przy pH 6. W przypadku braku VA, największe odbarwienie melaniny wynoszące 86 procent zaobserwowano przy pH 3, podczas gdy najniższe odbarwienie melaniny o 35 procent i 36 procent zaobserwowano odpowiednio przy pH 5 i 6. Odbarwianie melaniny za pomocą LiP w tym badaniu było wysoce skuteczne w warunkach niższego pH, tj. 2 i 3 (ryc. 2), chociaż inne badania wykazały optymalne warunki pH przy 4 1.

Temperatura. Odbarwianie melaniny za pomocą LiP badano w różnych temperaturach w zakresie od 20–60 stopni, zarówno w obecności, jak i nieobecności VA w okresie inkubacji wynoszącym 6 godzin. W przypadku braku VA podobne wartości procentowe (19 procent) odbarwienia melaniny obserwowano w temperaturze 20 i 30 stopni (ryc. 3). Najwyższe i najniższe odbarwienie melaniny przy braku VA zaobserwowano odpowiednio w 40 i 50 stopniach. Jednak z VA w roztworze odbarwienie melaniny wzrosło z 20 do 40 stopni i spadło do 60 stopni. W obecności VA największe odbarwienie melaniny wynosi około 60 procent przy 40 stopniach. Odbarwienie jest na ogół niższe, ponieważ doświadczenie przeprowadzono w łagodniejszych warunkach pH.

stężenie LiP. Zbadano również odbarwienie melaniny przy zmianach stężeń enzymów. Pięć różnych stężeń, tj. 5, 10, 15, 20 i 25 IU/ml LiP zbadano pod kątem odbarwiania melaniny w obecności i nieobecności VA, jak pokazano na ryc. 4. Co zaskakujące, najskuteczniejsze stężenie enzymu wynosiło 15 IU/ml dla obu roztworów z i bez VA. Po 6-godzinnym okresie inkubacji najwyższe odbarwienie melaniny wyniosło 92% w obecności VA i 70% przy braku mediatora przy stężeniu enzymu 15 IU/ml, podczas gdy najniższe odbarwienie melaniny wynoszące 23% zaobserwowano w brak VA przy użyciu 5 IU/ml LiP. Nie jest jasne, czy odbarwianie jest mniej skuteczne przy wysokich stężeniach enzymu, tj. 20 i 25 IU/ml (ryc. 4).

Czas inkubacji. Eksperymenty odbarwiania przeprowadzono po 2, 4, 6, 8 i 10 godzinach inkubacji. Reakcje te prowadzono również w obecności i nieobecności VA. Wyniki pokazały, że skuteczność odbarwiania jest dodatnio skorelowana z czasem inkubacji, zgodnie z oczekiwaniami (ryc. 5). Wzrost stopnia delokalizacji był bardziej widoczny w początkowej inkubacji. Najwyższe odbarwienie melaniny (68 procent) zaobserwowano po 10-godzinnym okresie inkubacji w obecności VA i 59 procent pod nieobecność VA. Odbarwienie melaniny było tak niskie, jak 15 procent po 2 godzinach inkubacji bez VA. Dlatego na podstawie wyników badań doszliśmy do wniosku, że optymalne warunki to pH 3, 40 st., 15 IU/ml i 10 h inkubacji.

Analizy SEM (skaningowy mikroskop elektronowy) i FTIR (spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera).Zmiany morfologiczne i strukturalne w melaninie scharakteryzowano odpowiednio za pomocą SEM i FTIR. Odbarwioną melaninę analizowano metodą SEM w celu zaobserwowania morfologicznych zmian powierzchni. Syntetyczną melaninę bez żadnej obróbki enzymatycznej zastosowano jako kontrolę. Jak pokazano na ryc. 6, na potraktowanych granulkach melaniny znajdowała się pusta przestrzeń w porównaniu z próbką nietraktowaną, co sugeruje, że cząstki melaniny zostały zaatakowane przez enzym.

Odbarwioną melaninę analizowano również za pomocą FTIR z nietraktowaną melaniną jako kontrolą (ryc. 7). Uzyskano molekularne odciski palców zarówno odbarwionej, jak i nietraktowanej melaniny i porównano je, aby potwierdzić wszelkie zmiany strukturalne w potraktowanej melaninie 13. Widma FTIR melaniny (C18H10N2O4) wykazały szerokie widmo absorpcji przy 3272 cm-1, które można przypisać charakterystycznemu O Drgania rozciągające –H lub N–H rozciągające kwasu karboksylowego i grup fenolowych. Zauważalne były zmiany w widmie FTIR traktowanej melaniny. Szerokopasmowe przy liczbach falowych 3000–3500 cm-1 wskazuje na obecność grup -NH i -OH zarówno w próbkach kontrolnych, jak i traktowanych. Jednak intensywność potraktowanej próbki jest znacznie wyższa niż próbki kontrolnej, co sugeruje, że obróbka obejmowała dodanie tych grup funkcyjnych do struktury w wyniku ataków enzymatycznych. Piki przy 2884,4 cm-1 i 2822 cm-1 wskazywały na obecność grup alkilowych w próbie kontrolnej, podczas gdy w odbarwionej melaninie pik przy liczbie falowej 2884,4 cm-1 był nieobecny. Pik przy 2822 cm-1 odbiegał od długości fali 2835,92 cm-1, co również reprezentowało zmiany strukturalne w potraktowanej melaninie w tym regionie. Pik przy liczbie falowej 1710 cm-1 w próbie kontrolnej przypisywano obecności kwasu karboksylowego. Ten pik był również nieobecny lub zmniejszony w dużym stopniu w odbarwionej melaninie, ponownie potwierdzając zmiany strukturalne w traktowanej melaninie. Były też pewne zmiany w regionie linii papilarnych. Na przykład między liczbami falowymi 1500-500 cm-1 obecność nowych pików w traktowanej melaninie przy 1513, 1464 i 1139 cm-1 reprezentowała zmiany strukturalne. W odbarwionej melaninie wykryto również nowy pik przy 2144 cm-1.

Efekty cytotoksyczności.Cytotoksyczność zdegradowanej melaniny i LiP badano metodą cytotoksyczności krewetek solankowych 14,15. W niniejszym badaniu efekty cytotoksyczne traktowanej melaniny i LiP były niskie, a wskaźniki żywotności larw krewetek były większe lub równe 90 procent (Tabela 1). Wzrost stężenia LiP nie miał wpływu na żywotność larw krewetek do 80 ul/mL (~80 IU/ml), co sugeruje jego niską aktywność cytotoksyczną. W kontrolach pozytywnych z VA śmiertelność wynosiła 100 procent, co sugeruje, że należy zachować ostrożność podczas stosowania LiP w obecności VA jako mediatora w medycynie i kosmetyce.

Dyskusja

W przypadku temperatury największy wzrost grzybów i produkcję enzymów osiągnięto przy 40 stopniach, co odpowiada naturalnemu siedlisku P. chrysosporium. Zdolność LiP do degradacji melaniny opiera się na podobieństwie strukturalnym melaniny i ligniny 18. Skuteczność degradacji melaniny przez LiP in vitro została skorelowana z kilkoma czynnikami, takimi jak pH, temperatura, stężenie enzymu i czas inkubacji. jako istnienie VA. LiP może utleniać VA do jego rodników kationowych (VA∙ plus ) i służyć jako mediator redoks, który dalej odbarwia melaninę, jak pokazano na ryc. 8.

H2O2 jest niezbędnym substratem jako końcowy akceptor elektronów podczas odbarwiania melaniny. LiP łatwo ulega inaktywacji w nadmiernym stężeniu, które indukuje pęknięcie struktury hemu lub utworzenie nieaktywnego związku III. Podaje się, że ten efekt hamujący można stłumić przez utlenianie VA do kationorodnika VA 1 . LiP utlenia VA do rodników kationowych VA, które działają jako mediator redoks w celu odbarwienia melaniny. VA jest naturalnym związkiem wytwarzanym z grzybów białej zgnilizny, które mają mniej skutków ubocznych. Jednak obecność mediatora VA skutkowała wysoką śmiertelnością badanych organizmów w porównaniu z niskimi efektami cytotoksycznymi traktowanej melaniny i LiP. Powinien być dokładnie przetestowany w formułowaniu produktów zdrowotnych i do pielęgnacji skóry.

Materiały i metody

Izolacja i identyfikacja szczepów grzybów.Izolacji grzybów dokonano ze skażonego miejsca, które przez długi czas było składowiskiem materiałów drzewnych. Próbkę pobrano do sterylnych butelek i przeniesiono do laboratorium w celu oczyszczenia. Oczyszczanie przeprowadzono na podłożu agarowym z dekstrozą typu seaboard. Z próbki wyizolowano i oczyszczono cztery różne kolonie grzybów. Selekcję najlepszego szczepu przeprowadzono na podstawie odbarwiania melaniny i produkcji biomasy w obecności melaniny jako jedynego źródła węgla w pożywce z solą mineralną (MSM). Na podstawie skriningu zidentyfikowano wybrany organizm poprzez sekwencjonowanie DNA 5,8S rRNA i 18S rRNA przy użyciu uniwersalnych starterów ITS-1 i ITS{4}}. Ich genomowy DNA wyekstrahowano zgodnie z metodą Andersona i in. 19. Po oczyszczeniu przeprowadzono sekwencjonowanie produktów PCR. Sekwencje dopasowano za pomocą narzędzia BLAST w NCBI, a homologi analizowano pod kątem filogenezy za pomocą Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA). Opierając się na maksymalnym prawdopodobieństwie, skonstruowano drzewo łączące sąsiada w celu identyfikacji wyizolowanego szczepu grzyba. Sekwencje przesłano do NCBI GenBank z numerem dostępu KX064682.1. Analiza filogenetyczna wykazała, że ​​izolat KX064682.1 był szczepem Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Test płytkowy do odbarwiania melaniny.Grzyb białej zgnilizny, Phanerochaete chrysosporium NK -1, został użyty do odbarwienia melaniny. Wiadomo, że Phanerochaete chrysosporium wytwarza LiP. Melaninę syntetyczną (B049-97–6) zastosowano jako melaninę modelową we wszystkich eksperymentach odbarwiania melaniny. Zmodyfikowaną pożywkę z VA 2 jako induktorem LiP zastosowano do testowania zdolności grzyba do odbarwiania melaniny. Do hodowli Phanerochaete chrysosporium NK -1 użyto szalek Petriego. Pożywkę przygotowano przez rozpuszczenie 10 g glukozy, 2 g ekstraktu słodowego, 4 g MgSO4·7H2O, 1 g KH2PO4, 0.01 g FeSO4, 0,005 g ZnSO4, 0,2 g syntetycznej melaniny i 15 g agaru w 1- l wody destylowanej. Zaszczepione płytki Petriego inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności. Zaobserwowano stopień odbarwienia melaniny pod i wokół kolonii grzyba. Stwierdzono, że grzyb jest zdolny do odbarwiania melaniny i jest dalej wykorzystywany do sporządzania roztworów enzymatycznych.

Przygotowanie enzymu do odbarwiania melaniny.Płynna pożywka hodowlana zawierała 10 g glukozy, 0,2 g ekstraktu drożdżowego, 0.07 g VA, 3.{13 }} g kwasu winowego, 1 g Tween 80, 0,2 g KH2PO4, 0,146 g CaCl2·2H2O, 0,157 g K2HPO4, 0.{45}}5 g MgSO4·7H2O, 42,5 mg ZnSO4·7H2O, 7,0 mg CoCl2·6H2O, 7,{51}} mg CuCl2·2H2O, 0,54 mg FeCl3, 0,9 mg NaCl i 0,2 mg syntetycznej melaniny na litr wody destylowanej 20. pH pożywki doprowadzono do wartości 4,0 za pomocą roztworów NaOH i HCl. 250 ml kolby zawierające porcje 100 ml pożywki hodowlanej autoklawowano i zaszczepiono 5 ml inokulum. Kolby następnie inkubowano na wytrząsarce obrotowej w 30 stopniach przez 15 dni. Duplikaty próbek zebrano do testów aktywności LiP w odstępie 24 godzin.

Test enzymatyczny.Odczynniki do testu LiP obejmowały 250 mM bufor winianu sodu o pH 5,5, 10 mM VA i 4 mM H2O2 (30 procent). Test enzymatyczny przeprowadzono w kuwecie krzemionkowej, a absorbancję zmierzono przy 310 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis (Shimadzu, Kyoto, Japonia). Absorbancję monitorowano w czasie 0–30 s w warunkach otoczenia. Aktywność enzymu obliczono zgodnie z prawem Beera, Eq. (1) 21.

gdzie c jest stężeniem gatunków atenuowanych; A to optyczna chłonność; ε jest molowym współczynnikiem tłumienia; d to długość ścieżki optycznej. Pomiar aktywności enzymu obejmuje określenie zmiany stężenia w czasie, równ. (2).

Optymalizacja pod kątem zwiększonej produkcji LiP i odbarwiania melaniny in vitro.Optymalizacja pod kątem zwiększonej produkcji LiP z Phanerochaete chrysosporium NK-1 przy użyciu melaniny jako substratu została przeprowadzona przy użyciu projektu Placketa Burmana. Pełnowymiarowa Placket została oparta na fakcie, że podważa interakcyjne efekty między różnymi zmiennymi, podczas gdy uwzględnia tylko trendy liniowe, Eq. (3) 22.

gdzie Y oznacza odpowiedź, a symbole oznaczają współczynnik regresji, a k liczbę badanych czynników. Zbadano łącznie 9 czynników, aby osiągnąć najwyższe stężenie LiP z Phanerochaete chrysosporium NK-1 do odbarwiania melaniny obecnej w podłożu. Schemat Placketa-Burmana został skonstruowany z łącznie 12 przebiegów eksperymentalnych, jak pokazano w Tabeli 2. Eksperymenty prowadzono łącznie przez 35 dni i mierzono odpowiedź (aktywność LiP IU/ml). Dane eksperymentalne analizowano za pomocą oprogramowania statystycznego „Design Expert 9”. Zoptymalizowane podłoże zastosowano do ulepszonej produkcji LiP i oczyszczono przez wytrącanie amoniakiem.

Optymalizacja produkcji i oczyszczania enzymów.Do określenia optymalnego czasu inkubacji pod względem aktywności LiP zastosowano zanurzoną pożywkę. Jak pokazano na Uzupełnionej Ryc. 1, roztwór hodowlany ma maksymalną aktywność enzymatyczną ósmego dnia, wynoszącą 140 IU/ml. Dlatego do wytworzenia roztworu enzymu zastosowano czas inkubacji wynoszący 8 dni.

W sumie przeprowadzono 12 eksperymentów w celu określenia czynników (9), które mają wpływ na działania LiP. Wśród testów wartości odpowiedzi aktywności LiP wahały się od 171 IU/ml do 576 IU/ml, jak pokazano na Uzupełnionej Ryc. 2. Cykle z najwyższą aktywnością LiP przeprowadzono 3 (576 IU/ml), a następnie przebieg 10 (547 j.m./ml). Zgodnie z analizą regresji temperatura, czas, stężenie glukozy, stężenie substratu i mediator mają pozytywny wpływ na aktywność LiP. Stwierdzono, że wpływ ekstraktu drożdżowego jest znikomy. Inne czynniki mają negatywne skutki. Optymalne warunki do produkcji LiP to czas: 35 dni, temperatura: 40 stopni, glukoza (na litr): 20 g, fruktoza: 10 g, ekstrakt drożdżowy: 2 g, pepton: 2 g, inokulum: 10 ml, substrat mediator: 0,1 ml. Te warunki wykorzystano następnie do zwiększonej produkcji LiP, który oczyszczono metodami wytrącania amoniakiem i chromatografii żelowej (Sephadex G -75).

Przeprowadzono ekstrakcję enzymatyczną przy optymalnym pH, temperaturze i czasie inkubacji. Kolumnę do filtracji żelowej Sephadex G75 zastosowano do oddzielenia frakcji zawartości białka od lizatu komórkowego pod względem gradientu gęstości zgodnie z instrukcjami producenta. Obfitość białek w surowym ekstrakcie została również wskazana poprzez liczbę prążków, które pojawiły się w analizie żelu sodowego dodecylopoliakryloamidu (SDS-PAGE). Masa cząsteczkowa oczyszczonego enzymu wynosiła 46,{3}} kDa, obliczona na podstawie analizy SDS-PAGE (uzupełniona fig. 3). Aktywności enzymatyczne po wytrąceniu amoniakiem i oczyszczeniu metodą chromatografii żelowej wynoszą odpowiednio 684,{7}} i 957,6 IU/ml.

Oczyszczony enzym zastosowano do odbarwiania melaniny w różnych warunkach fizykochemicznych, w tym pH, temperaturze, czasie inkubacji i stężeniu enzymu. Melaninę syntetyczną (B049-97-6) zastosowano jako melaninę modelową we wszystkich eksperymentach odbarwiania melaniny zgodnie z 23.

Eksperymenty odbarwiania.Wpływ pH na odbarwianie melaniny. Aby zaobserwować wpływ pH na odbarwianie melaniny przez LiP, przeprowadzono reakcje odbarwiania melaniny przy pH w zakresie od 2,0– 6,{3}}. Mieszanina reakcyjna zawierała 10 µl surowego enzymu rozpuszczonego w buforze TE i 1990 µl 0,02% wag./obj. melaniny. Reakcje te przeprowadzono zarówno w obecności, jak iw nieobecności VA. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze 30 stopni przez 6 godzin. Eksperymenty kontrolne prowadzono równolegle, zastępując aktywny LiP denaturowanym enzymem gotowanym w 95 stopniach. Mieszaniny reakcyjne monitorowano pod kątem odbarwiania melaniny za pomocą spektrofotometru przy długości fali 540 nm przed i po inkubacji. Skuteczność odbarwiania enzymu wyrażono w procentach (procentach). Odbarwienie melaniny obliczono z równania. (4) 11.

Wpływ czasu inkubacji na odbarwienie melaniny. W celu optymalizacji czasu inkubacji przeprowadzono reakcje odbarwiania melaniny przy czasach inkubacji rozciągających się od 2–1 0 h. Mieszanina reakcyjna zawierała 10 ul surowego enzymu rozpuszczonego w buforze i 1990 ul 0,02% wag./obj. melaniny przy pH 4 w obecności i nieobecności VA. Mieszaniny reakcyjne następnie inkubowano w temperaturze 30 stopni i uzyskano procent odbarwienia melaniny.

Analiza SEM zdegradowanej melaniny. Powierzchniowe zmiany morfologiczne melaniny analizowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (JEOL JSM{0}}, Peabody, MA, USA) 24. Jako kontrolę zastosowano melaninę nietraktowaną. Próbki wysuszono i umocowano na miedzianych króćcach (10×10mm2 ) dwustronną taśmą węglową (przylepną z obu stron). Króćce przemyto detergentem i wysuszono suszarką z opalarką (KADA 85U/SMD) w temperaturze 200 stopni przez 2 minuty przed utrwaleniem próbki. W celu zapewnienia przewodnictwa wiązki elektronów zastosowano pastę srebrową (SPI-CHEM, West Chester, PA, USA). Złoto osadzano na próbce za pomocą plazmy wytwarzanej w warunkach wysokiego napięcia (prąd 25 mA przez 50 s) i próżni (10-2 ATM). Morfologię powierzchni próbek badano przy powiększeniu 3000.

Analiza FTIR odbarwionej melaniny.Reakcje lub próbki, które wykazały największe odbarwienie melaniny w eksperymencie optymalizacyjnym, były dalej analizowane za pomocą spektroskopii FTIR (model nr 56, Merlin, Niemcy). Próbki odwirowano (10,{2}} obr./min przez 1 min) i wysuszono na powietrzu w ramach przygotowania do analizy FTIR 20. Analizę jakościową próbek melaniny przeprowadzono za pomocą spektrometru UV-Vis bliskiej podczerwieni (NIR) Lambda 900/Perkin Elmer Instruments. Widma rejestrowano w zakresie od 1000 do 3500 cm-1. Próbki przygotowano w peletkach KBr z dyspersją proszkową. Nietraktowaną syntetyczną melaninę zastosowano jako kontrolę w tej analizie.

Cytotoksyczność zdegradowanej melaniny i LiP.Przeprowadzono testy śmiertelności krewetek solankowych w celu sprawdzenia cytotoksyczności zdegradowanej melaniny 14,15. Jaja krewetek solankowych wylęgały się w prostokątnym naczyniu ze sztuczną wodą morską. Naczynie zawierało plastikową przegrodę z małymi otworami i dzieliło naczynie na dwie nierówne przegródki. Jaja były nakrapiane w większej komorze i przykryte, aby uniknąć przenikania światła, podczas gdy mniejsza komora była oświetlona lampą na górze. Wyklute larwy były przyciągane przez światło w kierunku małego przedziału. Po 48 h inkubacji dojrzałe naupliusy zebrano z oświetlonego przedziału za pomocą pasteryzowanej pipety.

Analiza statystyczna.Dane eksperymentalne analizowano za pomocą oprogramowania statystycznego „Design Expert 9”. Obrazy graficzne zostały narysowane za pomocą trzech prób eksperymentalnych z obliczonym odchyleniem standardowym. Istotność statystyczną serii eksperymentalnej obliczono metodą ANOVA.

Dostępność danych

Bibliografia

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Te toksykologia rtęci — obecne narażenie i objawy kliniczne. N. angielski J. Med. 349, 1731-1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. i Lynde, C. Miejscowe leczenie melasmy i pozapalnych przebarwień. Terapia skóry Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. i Rustin, M. Kortykosteroidy. Clin. Dermatol. 15, 715-721 (1997).

7. Płonka, P. i Grabacka, M. Synteza melaniny w mikroorganizmach: aspekty biotechnologiczne i medyczne. Acta Biochim. pol. 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. i in. Hamujące działanie arbutyny na biosyntezę melaniny hiperpigmentacji wywołanej przez hormon stymulujący melanocyty w hodowanych brązowawych tkankach skóry świnki morskiej. Łuk. Farmacja Res. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Ponowna analiza produktów rozjaśniających skórę. Int. J. Kosmet. nauka 25, 169-181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Badania przesiewowe mikroorganizmów pod kątem odbarwiania melanin wytwarzanych przez grzyby sinizny. Aplikacja Mikrobiol. Biotechnologia. 55, 210-213 (2001).

11. Nagasaki, K. i in. Oczyszczanie, charakteryzacja i klonowanie genów Ceriporiopsis sp. szczep MD{1}} peroksydazy, które odbarwiają melaninę ludzkiego włosa. Aplikacja Otaczać. Mikrobiol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Mikrobiologiczna degradacja ligniny: w jaki sposób nieporęczny, oporny polimer jest skutecznie poddawany recyklingowi w przyrodzie i jak możemy to wykorzystać. Mikrob. Biotechnologia. 2, 164-177 (2009).

13. Holmes, EW i Tompson, KD (Patenty Google, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Cytotoksyczność krewetek Brine, właściwości przeciwzapalne i przeciwbólowe kwiatów Woodfordia fruticosa Kurz. Iranu. J. Pharm. Rez.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Badanie toksyczności materiałów dentystycznych do odbudowy przy użyciu larw krewetek solankowych (Artemia salina). J. Appl. nauka ustna.

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO i in. Funkcjonalności peroksydazy ligninowej i potencjalne zastosowania. Mikrobiologiaopen 6, e00394.

17. Sung, HJ Odbarwianie melaniny przez peroksydazę ligniny z H2O2 generowanym in situ do stosowania w kosmetykach wybielających (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Biodegradacja i biologiczna obróbka celulozy, hemicelulozy i ligniny: przegląd. Int. Mikrobiol. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Typowanie molekularne przez losową amplifikację polimorficznego DNA i południową hybrydyzację M13 spokrewnionych sparowanych izolatów Aspergillus fumigatus. J. Clin. Mikrobiol. 34, 87–93 (1996).

20. Sabar, MA i in. Degradacja niskowęglowego węgla przez Rhizopus oryzae wyizolowanego z pakistańskiej kopalni węgla kamiennego i zwiększone uwalnianie substancji organicznych. Paliwo 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Oczyszczanie, charakteryzacja i aktywność depolimeryzacji węgla peroksydazy ligninowej z Lenzitus betulina MTCC -1183. Aplikacja Biochem. Mikrobiol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. i Arunkumar, C. Zastosowanie projektu Placketta-Burmana do przesiewania składników pożywki do produkcji tannazy z łuski programowej przy użyciu fermentacji wgłębnej. Int. J. Pharm. Rez. Obj. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Odbarwienie melaniny przez peroksydazę ligninową z Phanerochaete chrysosporium. Biotechnologia. Bioproces. inż. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM i in. Hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych bez etapu zarodka wzmacnia osteogenezę in vitro. Komórki macierzyste 24, 835–843 (2006).

Potwierdzenie

Autorskie Wkłady

Konkurujące interesy

wydawcynotatkaSpringer Nature pozostaje neutralny w stosunku do roszczeń jurysdykcyjnych na opublikowanych mapach i powiązań instytucjonalnych.

Więcej informacji: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501