Ustanowienie testu ELISpot do wykrywania odporności komórkowej przeciwko S. Pneumoniae u zaszczepionych biorców przeszczepu nerki

Abstrakcyjny:

U biorców przeszczepów narządowych częstość występowania inwazyjnych chorób pneumokokowych jest 25 razy większa niż w populacji ogólnej. W tej kohorcie zaleca się szczepienie przeciwko S. pneumoniae, ponieważ zmniejsza częstość występowania tej ciężkiej postaci zakażenia pneumokokowego. Wcześniejsze badania wskazują, że biorcy przeszczepów mogą wytwarzać specyficzne przeciwciała po szczepieniu przeciwko pneumokokom.

Jednak pozostaje niejasne, czy szczepienie indukuje również swoistą odporność komórkową. W bieżącym badaniu na 38 biorcach przeszczepu nerki opracowaliśmy test interferonu-ELISpot, który może wykrywać odpowiedzi komórkowe specyficzne dla serotypu przeciwko S. pneumoniae. Wyniki wskazują, że sekwencyjne szczepienie skoniugowaną szczepionką Prevenar 13 i szczepionką polisacharydową Pneumovax 23 prowadziło do wzrostu swoistej dla serotypu odporności komórkowej. Zaobserwowaliśmy najsilniejsze odpowiedzi przeciwko serotypom 9N i 14, które są składnikami szczepionki Pneumovax 23. Odpowiedzi komórkowe przeciwko S. pneumoniae dodatnio korelowały ze swoistymi przeciwciałami IgG (r=0,32, p=0,12 ).

Podsumowując, jest to pierwszy raport wskazujący, że biorcy przeszczepu nerki mogą uzyskać specyficzne odpowiedzi komórkowe po szczepieniu przeciwko pneumokokom. Stworzony przez nas ELISpot pozwoli na dalsze badania. Mogłyby one pomóc w określeniu, na przykład, czynników wpływających na swoistą odporność komórkową w kohortach z obniżoną odpornością lub czas trwania odporności komórkowej po szczepieniu.

Odporność komórkowa odnosi się do odporności komórek organizmu na obce patogeny, która jest częścią układu odpornościowego. Odporność komórkowa obejmuje różne typy komórek, w tym komórki T, komórki NKT, makrofagi, komórki NK itp. Komórki te rozpoznają i eliminują patogeny, takie jak wirusy, bakterie i grzyby, chroniąc w ten sposób organizm przed infekcjami i chorobami. Odporność komórkowa może również monitorować i eliminować komórki nowotworowe. Organizm ludzki również potrzebuje poprawy swojej odporności. Po badaniach okazuje się, że Cistanche może wzmacniać odporność. Wyciąg z Cistanche może stymulować proliferację i aktywność komórek odpornościowych, takich jak limfocyty T i komórki NK, wzmacniając w ten sposób odporność człowieka.

Kliknij, aby poznać zalety Cistanche Tubulosa

Słowa kluczowe:

szczepionki skoniugowane i polisacharydowe przeciwko pneumokokom; szczepienie sekwencyjne; biorcy przeszczepu nerki; odporność komórkowa specyficzna dla serotypu; interferon-ELISpot.

1. Wstęp

Gram-dodatnia bakteria Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) często kolonizuje nosogardło człowieka [1]. Poza nosogardłem może prowadzić do płatowego zapalenia płuc, zapalenia opon mózgowych, zapalenia ucha środkowego lub zapalenia zatok. Poza zakażeniem miejscowym może powodować inwazyjne choroby pneumokokowe (IPD), których śmiertelność wynosi około 10 proc. [1–3]. Według danych Centers for Disease Control and Prevention częstość IChP u biorców narządów jest 25 razy większa niż w populacji ogólnej [2,3]. Szczepienie przeciwko S. pneumoniae jest zalecane u osób z obniżoną odpornością, ponieważ wykazano, że zmniejsza częstość występowania IChP [4–6].

Oprócz szczepionek polisacharydowych przeciwko S. pneumoniae (np. Pneumovax 23, MSD Sharp and Dohme, Haar, Niemcy), istnieją szczepionki skoniugowane z nietoksyczną zmutowaną postacią toksyny błonicy (np. Prevenar 13, PCV13, Pfizer, Nowy Jork, NY , USA) [7], które działają w sposób zależny od limfocytów T.

W Niemczech osobom z obniżoną odpornością, takim jak biorcy przeszczepów, zaleca się sekwencyjne podawanie 13-walentnej skoniugowanej szczepionki przeciwko pneumokokom, a następnie 23-walentnej polisacharydowej szczepionki przeciwko pneumokokom po 6–12 miesiącach [8]. Szczepionki najpierw otrzymują szczepionkę glikokoniugatową Prevenar 13. Zgodnie z wcześniejszymi danymi uzyskanymi na myszach, limfocyty T CD4 plus mogły rozpoznawać peptydy modyfikowane glikanami, prezentowane przez główny układ zgodności tkankowej (MHC) klasy II (specyficzne dla węglowodanów komórki pomocnicze CD4 T plus, Tcarbs) [9 ,10]. Te specyficzne Tcarbs mogą zwiększać wytwarzanie odpowiedzi przeciwciał z przełączaniem klas (IgG) skierowanych przeciwko polisacharydom pneumokokowym.

Jednak te wcześniejsze dane nie są w stanie określić źródła wydzielania interferonu (IFN) w naszych testach ELISpot, w których komórki były stymulowane przez (nieskoniugowane) antygeny polisacharydowe.

Serologiczna kontrola odpowiedzi na szczepienie jest zalecana u pacjentów z obniżoną odpornością, chociaż nie jest jasne, w jakim stopniu miana przeciwciał odzwierciedlają ochronę [11]. Ochrona możliwa do osiągnięcia dzięki temu schematowi szczepień pozostaje niejasna w kohortach po przeszczepach [12-14]. Obecnie dostępne są jedynie dane dotyczące swoistej odporności humoralnej po szczepieniu przeciwko S. pneumoniae [12–16]. Specyficzne dane dotyczące limfocytów T po szczepieniu przeciwko pneumokokom nie zostały jeszcze opublikowane w kohorcie po przeszczepie. Jednak u zdrowych dorosłych można było wykazać, że szczepienie zwiększyło odporność komórkową na polisacharydy pneumokokowe [17].

Obecne badanie miało na celu stworzenie testu ELISpot, który byłby wystarczająco czuły, aby wykrywać swoistą odporność komórkową przeciwko S. pneumoniae u zaszczepionych biorców przeszczepu nerki.

2. Materiały i metody

2.1. Pacjenci

W sumie do tego przekrojowego, jednoośrodkowego badania włączono 38 stabilnych klinicznie biorców przeszczepu nerki (70 próbek) (Tabela 1). Mediana wieku wynosiła 53 lata (zakres 23–77 lat); 12 pacjentów to kobiety, a 26 to mężczyźni. Chorzy otrzymali dwa szczepienia przeciwko S. pneumoniae. Szczepiono je sekwencyjnie, pojedynczą dawką szczepionki Prevenar 13, a sześć miesięcy później pojedynczą dawką szczepionki Pneumovax 23. Mediana odstępu między (ostatnim) przeszczepem nerki a pierwszym szczepieniem wynosiła 38 miesięcy (3 miesiące – 33 lata).

Stabilna funkcja alloprzeszczepu (zdefiniowana jako<15% change in serum creatinine concentration within one month before vaccination), an interval of ≥3 months to kidney transplantation, and absence of clinical infection, of allograft rejection and pregnancy, were defined as inclusion criteria. Blood samples were drawn immediately before vaccination with Pneumovax 23 (month 6), and one month and six months thereafter (months 7 and 12, respectively). This study was approved by the institutional review board of the University Hospital Essen (14-5858-BO), and written informed consent was obtained from all participants. It was carried out by the Declarations of Helsinki and Istanbul and their subsequent amendments.

2.2. Szczepionki

{{{{2{22}}}}}}walentna szczepionka przeciwko pneumokokom Prevenar 13 zawiera polisacharydy 13 serotypów pneumokoków (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 19A i 23F), indywidualnie skoniugowane z nietoksyczną zmutowaną formą materiału reagującego krzyżowo z toksyną błonicy 197 (CRM197). Szczepionkę formułuje się w 5 mM buforze bursztynianowym zawierającym 0,85 procent NaCl i 0,02 procent polisorbatu 80, przy pH 5,8 i zawiera fosforan glinu w ilości 0,125 mg/dawkę glinu jako adiuwant. Zawiera 2,2 µg/dawkę każdego z serotypów, z wyjątkiem serotypu 6B w ilości 4,4 µg/dawkę (0,5 ml).

23-walentna szczepionka Pneumovax 23 to nieskoniugowana szczepionka zawierająca po 25 µg każdego z 23 serotypów pneumokoków 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F i 33F. Szczepionka jest sformułowana w fenolu i<1 mmol sodium chloride per dose (0.5 mL). Both vaccines were injected into the deltoid muscle.

2.3. Oznaczanie odporności komórkowej przeciwko pneumokokom metodą ELISpot

Zebrano dziewięć mililitrów heparynizowanej krwi i komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) oddzielono przez wirowanie w gradiencie Ficoll. Liczby PBMC określono za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego (XP-300, Sysmex, Norderstett, Niemcy). Podwójne lub potrójne hodowle 200, 000 świeżo wyizolowanych PBMC hodowano bez polisacharydów pneumokokowych, a pojedyncze hodowle z 100, 150 i 200 µg/ml polisacharydów pneumokokowych (serotypy pneumokokowe (PS) 2, 6A, 9N, 11A, 14 i 25F, wszystkie z firmy Pfizer, ATCC, Manassas, VA, USA). Wytwarzanie IFN- określono stosując wstępnie powlekane płytki ELISpot i standaryzowany system wykrywania (zestaw T-Track® ELISpot, Mikrogen GmbH, Neuried, Niemcy; dawniej Lophius Biosciences GmbH, Regensburg, Niemcy). PBMC inkubowano bez i z polisacharydami pneumokokowymi w 150 µl pożywki AIMV (Gibco, Grand Island, NE, USA) w 37°C. Stymulacja mitogenem komórek T, fitohemaglutyniną (PHA, 4 µg/ml) służyła jako kontrola pozytywna. Komórki wstępnie inkubowano przez noc w płytkach z dnem U (BD Falcon, Nijmegen, Holandia).

Następnie inkubowano je przez kolejne 19 godzin na płytkach ELISpot. Warunki te można określić jako optymalne. Aby zoptymalizować warunki testu ELISpot, zmiareczkowaliśmy polisacharydy pneumokokowe (0,5–800 µg/mL) i przeprowadziliśmy hodowle komórkowe bez wstępnej inkubacji przez noc iz nią. Wykrywanie kolorymetryczne komórek wydzielających cytokiny przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Liczby plamek analizowano za pomocą czytnika ELISpot (AID Fluorospot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Niemcy).

Oprócz uwzględnienia stężeń polisacharydów u poszczególnych osób, określiliśmy mediany wartości optymalnych stężeń (100, 150 i 200 µg/mL) i odjęliśmy medianę kontroli negatywnych. W ten sposób wygenerowaliśmy przyrosty plamek, wskazujące konkretne plamy. Warto zauważyć, że kontrole negatywne osiągnęły średnią wartość 0,71 plamki i średnie odchylenie standardowe 0,47 plamki.

2.4. Oznaczanie odporności komórkowej przeciwko pneumokokom za pomocą testu proliferacji

W podgrupie pacjentów przeanalizowaliśmy również proliferację limfocytów, mierząc wychwyt 3H-tymidyny. Użyliśmy 200, 000 PBMC na hodowlę komórkową i stymulowaliśmy komórki 50–800 µg/ml polisacharydów 2, 6A, 9N i 14. PBMC inkubowano bez i z polisacharydami pneumokokowymi w 150 µl pożywki AIMV do pięć dni w temperaturze 37 ◦C przy użyciu płytek w kształcie litery U. Stymulację PHA zastosowano jako kontrolę pozytywną.

Przez ostatnie 16 godzin hodowle znakowano 37 kBq 3H tymidyną na kulturę. Następnie komórki zebrano (Harvester 96, Tomtec, Hamden, CT, USA) na wkłady filtracyjne (Wallac, Turku, Finlandia) i wbudowaną radioaktywność oznaczono ilościowo przez zliczanie scyntylacyjne w cieczy (1450 Microbeta Trilux, Wallac). Wyniki wyrażono jako zliczenia na minutę. Dodatkowo uwzględniono wskaźniki stymulacji (SI) (iloraz proliferacji przy specyficznej stymulacji i kontroli negatywnej (proliferacja bez stymulacji)). SI co najmniej 3 zdefiniowano jako pozytywną odpowiedź.

2.5. Oznaczanie przeciwciał przeciw pneumokokom

Przeciwciała przeciwko S. pneumoniae określono za pomocą testu ELISA, który wykrywa przeciwciała IgG przeciwko 23 serotypom pneumokoków (VaccZyme™, The Binding Site, Schwetzingen, Niemcy). Test przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta.

2.6. Analiza statystyczna

Dane analizowano przy użyciu GraphPad Prism 8.4.2.679 (San Diego, CA, USA). Dane wygenerowane bez preinkubacji i z preinkubacją oraz przed lub po szczepieniu szczepionką Pneumovax 23 porównano za pomocą testu U Manna-Whitneya. Do korelacji wyników testu ELISpot ze zmiennymi numerycznymi zastosowano test Spearmana oraz test Manna–Whitneya do analizy wpływu płci pacjentów na wyniki testu ELISpot. Jeśli nie zaznaczono inaczej, podano wartości średnie. Dwustronne wartości p < 0, 05 uznano za istotne.

3. Wyniki

3.1. Optymalizacja warunków ELISpot

Początkowe eksperymenty miareczkowania z PBMC od biorców przeszczepu nerki przeprowadzono z 0,5–50 µg/ml polisacharydów pneumokokowych i wykazały one prawie niewykrywalne odpowiedzi komórkowe (ryc. 1a), pomimo szczepienia przeciwko S. pneumoniae. Wzrost stężeń polisacharydów (50–800 µg/ml) w połączeniu z całonocną inkubacją wstępną w płytkach z dnem U (ryc. 1b, c) doprowadził do wykrywalnych, zależnych od dawki odpowiedzi komórkowych, osiągając maksimum przy 100–200 µg/ml.

3.2. Przebieg czasowy odpowiedzi ELISpot specyficznych dla pneumokoków

Wykorzystując zoptymalizowane warunki (100, 150 i 200 µg/ml polisacharydów i preinkubacja), przebadaliśmy stabilnych klinicznie biorców przeszczepu nerki w 6, 7 i 12 miesiącu po rozpoczęciu szczepienia przeciwko pneumokokom, tj. wpływ skoniugowanej szczepionki przeciw pneumokokom Prevenar 13 w 6. miesiącu oraz łączny wpływ obu szczepionek (Prevenar 13 i Pneumovax 23) w 7. i 12. miesiącu. Warto zauważyć, że wybraliśmy serotypy polisacharydów zawarte tylko w w Pneumovax 23 (2, 9N, 11A), w obu szczepionkach (14) lub w żadnej z nich (25F). Plamy IFN wykryte w naszym teście ELISpot specyficznym dla pneumokoków można scharakteryzować jako duże i intensywne (ryc. 2).

Rycina 1. Optymalizacja warunków testu ELISpot w celu określenia swoistej odporności komórkowej przeciwko S. pneumoniae. (a) Miareczkowanie niskich stężeń polisacharydów pneumokokowych serotypów (PS) 2, 6A, 9N i 14 (0,5–50 µg/ml), bez etap inkubacji, tj. komórki inkubowano bezpośrednio na płytkach ELISpot (bez wstępnej inkubacji). (b, c) Wyniki po stymulacji wyższymi stężeniami polisacharydów pneumokokowych (50–800 µg/ml), bez (b) lub z (c) całonocną inkubacją wstępną w płytkach z dnem typu U. We wszystkich przypadkach (a – c) testowaliśmy biorców przeszczepu nerki po szczepieniu przeciwko pneumokokom. Wartości mediany zaznaczono szarymi poziomymi liniami. Eksperymenty z kontrolą pozytywną przeprowadzono z mitogenem komórek T, fitohemaglutyniną (PHA). Wyniki przedstawione w (b, c) porównano za pomocą testu Manna – Whitneya. * p < 0,05, ** p < 0,01.

Rycina 2. Wyniki testu Interferon-ELISpot (200,000 PBMC/dołek) u jednej 49--letniej kobiety po przeszczepie nerki w 12. miesiącu. Pacjentka otrzymała szczepionkę Prevenar 13 i Pneumovax 23 w odpowiednio 12 miesięcy i 6 miesięcy przed krwawieniem. Każdy serotyp polisacharydów pneumokokowych (PS) stosowano w trzech stężeniach (100, 150 i 200 ug/ml). Lewy panel pokazuje wyniki ELISpot, a prawy panel układ płytki. Konfluentne plamy wypełniające całą studzienkę, jak pokazano w kontroli pozytywnej z fitohemaglutyniną (PHA), zostały ustawione na 600.

Do obliczeń wykorzystaliśmy wartości mediany dla trzech stężeń, uzyskując pojedynczy wynik na próbkę i punkt czasowy. Dla serotypów polisacharydów 2, 6A, 9N i 14 zaobserwowaliśmy wzrost odpowiedzi w miesiącu 7 vs. 6 (ryc. 3). Wydaje się, że wzrost ten był nieco silniejszy w przypadku trzech z czterech serotypów zawartych w szczepionce Pneumovax 23 (2, 9N i 14) niż w przypadku serotypu 6A, który występuje wyłącznie w szczepionce Prevenar 13. Odpowiedzi na PS 25F, serotyp, który nie występuje w żadnej ze szczepionek, były niewykrywalne w 12 miesiącu.

Podsumowując, dane wskazują, że szczepienie szczepionką Pneumovax 23 doprowadziło do nasilenia odpowiedzi komórkowych na większość serotypów zawartych w tej szczepionce. Największą liczbę specyficznych komórek można było wykryć miesiąc po tym szczepieniu. Jednak serotyp 11A zawarty również w szczepionce Pneumovax 23 nie indukował wykrywalnej odporności komórkowej. W 12 miesiącu odporność spadła, czego należy się spodziewać w przebiegu po szczepieniu. Nieoczekiwanie mógł również wystąpić niewielki wzrost odpowiedzi na serotyp 6A w 7 miesiącu, co można wytłumaczyć reaktywnością krzyżową. Brak odpowiedzi komórkowych na serotyp 25F w 12 miesiącu spełnił nasze oczekiwania, ponieważ nie był zawarty w żadnej ze szczepionek.

Rycina 3. Swoista odporność komórkowa przeciwko S. pneumoniae u biorców przeszczepu nerki po otrzymaniu szczepionki Prevenar 13 (miesiąc (M) 6) lub Prevenar 13 i Pneumovax 23 (M7 i M12). Warto zauważyć, że wybraliśmy serotypy pneumokoków (PS) zawarte tylko w szczepionce Prevenar 13 (6A, niebieski), tylko w Pneumovax 23 (2, 9N, 11A, czarny), w obu szczepionkach (14, czerwony) lub w żadnej z je (25F, zielony). Odpowiedzi wobec PS 14 mierzono tylko w 41 z 55 próbek, a odpowiedzi wobec PS 25F mierzono tylko w siedmiu (przy M12). Zastosowaliśmy mediany wartości dla trzech stężeń każdego polisacharydu (100, 150 i 200 µg/ml), uzyskując pojedynczy wynik na próbkę i punkt czasowy. Wartości mediany zaznaczono szarymi poziomymi liniami. Eksperymenty z kontrolą pozytywną przeprowadzono z mitogenem komórek T, fitohemaglutyniną (PHA). Przyrost oznacza, że ​​kontrole negatywne zostały odjęte od wyników po stymulacji polisacharydami S. pneumoniae.

3.3. Zależność od stężenia odpowiedzi proliferacyjnych specyficznych dla pneumokoków

Używając 50–800 µg / ml polisacharydów pneumokokowych, przeprowadziliśmy również testy proliferacji. Konkretne odpowiedzi były słabe. We wszystkich przypadkach z wyjątkiem jednego liczba zliczeń na minutę po stymulacji polisacharydami pneumokokowymi wynosiła poniżej 2200, co klasyfikujemy jako odpowiedź graniczną (ryc. 4). Trzech z pięciu zaszczepionych biorców przeszczepu nerki wykazało wykrywalną proliferację, określoną przez maksymalny wskaźnik stymulacji wynoszący co najmniej 3. Pierwszy pacjent zareagował na serotypy 2, 9N i 14 (SI odpowiednio do 5,8, 3,6 i 3,8) , drugi do serotypów 6A i 9N (SI odpowiednio do 3,1 i 5,1), a trzeci do serotypu 2 (SI do 3,9).

Rycina 4. Odpowiedzi proliferacyjne u zaszczepionych biorców przeszczepu nerki po stymulacji polisacharydami z S. pneumoniae. (a) Wyniki podane jako zliczenia na minutę; (b) wskaźnik stymulacji, tj. jako iloraz kultur stymulowanych i niestymulowanych. Użyliśmy polisacharydów pneumokokowych serotypu (PS) 2, 6A, 9N i 14 w stężeniach 50–800 µg/ml i hodowaliśmy komórki przez sześć dni. Wskaźniki stymulacji co najmniej 3 zdefiniowano jako odpowiedzi pozytywne (linia przerywana). Wartości mediany zaznaczono szarymi poziomymi liniami. Kontrole negatywne to komórki hodowane bez specyficznej stymulacji, a komórki kontroli pozytywne stymulowano mitogenem komórek T, fitohemaglutyniną (PHA).

3.4. Korelacja między swoistymi dla Pneumokoków odpowiedziami ELISpot a swoistymi przeciwciałami

Równolegle z testami ELISpot oznaczono przeciwciała IgG przeciwko 23 serotypom pneumokoków za pomocą testu ELISA. Analizę korelacji Spearmana przeprowadzono w 12 miesiącu po szczepieniu i uwzględniono sumę odpowiedzi ELISpot wobec serotypów 2, 6A, 9N i 14 przy użyciu zoptymalizowanych warunków ELISpot (n=25). Zaobserwowaliśmy dodatnią korelację (r=0},32, p=0,12), jak pokazano na rycinie 5. Rozważaliśmy również poszczególne testy ELISpot i zaobserwowaliśmy dodatnią korelację we wszystkich czterech serotypach (PS 2 : r=0.04; PS 6A: r=0}.15; PS 9N: r=0.28; PS 14: r=0.36). Ponadto dane dotyczące PS 11A były dostępne u 22 z 25 pacjentów (r=0, 26).

Rycina 5. Analiza korelacji Spearmana wyników testu ELISpot i przeciwciał IgG przeciw S. pneumoniae. Ta analiza uwzględnia wyniki biorców przeszczepu nerki w 12 miesiącu, tj. po otrzymaniu szczepionki Prevenar 13 i Pneumovax 23. Podsumowaliśmy odpowiedzi testu ELISpot na serotypy pneumokoków (PS) 2, 6A, 9N i 14, badane w stężeniach 100, 150 i 200 µg/ml. Użyliśmy wartości mediany dla trzech stężeń każdego serotypu, uzyskując pojedynczy wynik na próbkę. Przeciwciała IgG przeciwko 23 serotypom pneumokoków określono równolegle za pomocą komercyjnego testu ELISA (n=25). Linia ciągła przedstawia linię regresji, a linie przerywane 95-procentowy przedział ufności.

3.5. Korelacja między swoistymi dla Pneumokoków odpowiedziami ELISpot a charakterystyką pacjenta

Analiza Spearmana wykazała, że ​​odpowiedzi ELISpot w 12. miesiącu pozytywnie korelowały w przypadku pięciu z sześciu serotypów z przerwą między przeszczepem a szczepieniem, osiągając istotność statystyczną dla serotypu PS 6A (r=0,37, p=0). 04). Tak więc pacjenci zaszczepieni później po przeszczepie mieli wyższą odpowiedź komórkową. Mężczyźni uzyskali średnio 1,1-razy więcej odpowiedzi niż kobiety, co było nieistotne. Wiek nie miał określonego wpływu na odpowiedzi komórkowe (r=-0,35—r=0,25). Ponieważ 25 z 33 pacjentów badanych w 12. miesiącu otrzymało schemat immunosupresyjny oparty na takrolimusie, wpływ leków immunosupresyjnych nie mógł być odpowiednio przeanalizowany w naszej raczej małej kohorcie.

4. Dyskusja

W naszym obecnym badaniu opisujemy ustanowienie testu IFN-ELISpot do wykrywania swoistej odporności przeciwko S. pneumoniae u zaszczepionych biorców przeszczepu nerki. W porównaniu z poprzednim badaniem na zaszczepionych zdrowych osobach, odpowiedzi ELISpot na polisacharydy pneumokokowe okazały się ogólnie niższe u pacjentów po przeszczepach [17]. Wystąpiły jednak znaczne różnice w warunkach eksperymentalnych. Podczas gdy poprzednie badanie Wuorimaa i in. użyliśmy pełnej szczepionki polisacharydowej (bez adiuwantów) jako antygenu, tutaj użyliśmy pojedynczych serotypów polisacharydowych.

W ten sposób moglibyśmy zmierzyć odpowiedzi specyficzne dla serotypu. Inne wcześniejsze badania odporności komórkowej po szczepieniu przeciwko pneumokokom wykorzystywały koniugat, toksynę błonicy [18] lub kompletną szczepionkę zawierającą toksynę [17,19,20] jako bodziec antygenowy. W związku z tym testy komórkowe nie były specyficzne dla pneumokoków, ale mogły również wykazywać odpowiedzi na koniugat.

Ponadto istnieją badania odporności komórkowej z wykorzystaniem lizatów bakteryjnych, supernatantów lub pneumokokowego białka powierzchniowego A, białka powierzchniowego związanego ze ścianą komórkową S. pneumoniae, niezależnie od szczepienia i niezależnie od przeszczepu [21–24]. Te poprzednie doniesienia wskazują, że odpowiedzi limfocytów T CD4 plus przeciwko S. pneumoniae można zmierzyć za pomocą IFN-ELISpot lub cytometrii przepływowej, wykrywając odpowiednio wytwarzanie IFN- lub IL{6}} i ekspresję CD154 lub CD25. Wykorzystując PBMC zdrowych dorosłych, Wuorimaa i in. wykazali, że swoiste dla pneumokoków wydzielanie IFN- było znaczne i wzrastało po szczepieniu skoniugowanymi i nieskoniugowanymi z białkami szczepionkami przeciwko pneumokokom [17]. Warto zauważyć, że u ochotników otrzymujących nieskoniugowane szczepionki przeciw pneumokokom odpowiedź IFN na antygeny polisacharydowe (bez nośnika białkowego) wzrosła po szczepieniu (szczepienie wstępne: 0, dzień 14: 32, dzień 28: 22; dane przedstawiają średnią liczbę komórki wydzielające IFN). Zatem nasze obecne ustalenia są zgodne z poprzednim badaniem.

Należy wyjaśnić, jaki typ komórek jest źródłem wydzielania IFN-. Zgodnie z charakterystyką plamki (duża i intensywna), komórkami produkującymi IFN- -mogą być limfocyty T. Gdy zastosowano eksperymentalny mysi model komórkowy, mapowanie klonotypów limfocytów T CD4 plus aktywowanych polisacharydem pneumokoków in vivo i in vitro ujawniło transkrypty klonotypowego receptora komórek T (TCR) [25]. Sugerowano, że polisacharydy obojnacze indukują aktywację oligoklonalnych limfocytów T CD4 plus, która była zależna od komórek prezentujących antygen [25]. Autorzy zaproponowali, że polisacharydy mogą wiązać się z zewnętrzną częścią rowka wiążącego MHC klasy II i że są rozpoznawane przez domenę wiążącą CDR3 TCR. Prezentacja przez cząsteczki MHC klasy II wymagała również obecności cząsteczek HLA-DM.

Jednak zostało to wykazane przez Avci i in. że klony CD4 plus T rozpoznają i reagują z węglowodanami tylko w kontekście MHC klasy II, gdy są prezentowane przez peptyd [9]. Ale użyliśmy polisacharydów bez nośnika białkowego jako bodźców. Można również spekulować, że odpowiadające komórki mogą nie być komórkami T δ lub komórkami NKT. Wydaje się, że limfocyty T δ nie wymagają obróbki antygenu i prezentacji MHC epitopów peptydowych [26]. Stanowią niewielką populację we krwi obwodowej, pomost między wrodzonym a nabytym układem odpornościowym i wykorzystują swój TCR jako receptor rozpoznawania wzorców [26]. Ponadto istnieją dowody na udział specyficznych dla płuc podzbiorów limfocytów T δ w lokalnych odpowiedziach na zakażenie S. pneumoniae [27]. Wreszcie źródłem IFN- mogą być komórki NK, jak opisano wcześniej po stymulacji lipopolisacharydem, głównym składnikiem błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych [28]. Warto zauważyć, że Kanevskiy i in. stymulowali komórki NK lipopolisacharydami, ale nie polisacharydami pneumokoków (z bakterii Gram-dodatnich S. pneumoniae).

Podczas gdy kilka badań dotyczących odporności humoralnej u biorców przeszczepów wskazuje, że ci pacjenci mogą wytworzyć odpowiedź przeciwciał po szczepieniu – chociaż na obniżonym poziomie – [12-16], dane dotyczące swoistej odporności komórkowej po szczepieniu nie zostały jeszcze opublikowane w tej kohorcie. Wyzwaniem było ustanowienie testu wykrywającego komórkową odpowiedź immunologiczną przeciwko S. pneumoniae u biorców przeszczepu nerki, ponieważ jest ona nawet na niskim poziomie u zdrowych osób z grupy kontrolnej [17]. Nie ustalono jeszcze, czy u tych pacjentów może rozwinąć się reakcja komórkowa przeciwko pneumokokom pomimo trwającego całe życie leczenia immunosupresyjnego. Podajemy tutaj, że biorcy przeszczepu nerki wykazywali wzrost komórkowej odporności na pneumokoki po szczepieniu. PS 9N i 14 — oba składniki szczepionki Pneumovax 23 — indukowały ogólnie najsilniejszą komórkową odpowiedź immunologiczną. Odkrycie dobrze pasuje do danych humoralnych u zaszczepionych biorców przeszczepu nerki [29]. To poprzednie badanie wykazało silny wzrost przeciwciał skierowanych przeciwko dwóm serotypom 9N i 14 po szczepieniu Pneumovax 23.

Ponadto przeciwciała skierowane przeciwko serotypowi 14 w porównaniu z 12 innymi serotypami osiągnęły najwyższe stężenie w zbiorczej surowicy 278 zdrowych ochotników immunizowanych Pneumovax 23 [30], co wskazuje, że ten serotyp jest wysoce immunogenny. Podobnie jak w przypadku odpowiedzi przeciwciał, istnieje duże zróżnicowanie między osobnikami, najprawdopodobniej z powodu wcześniejszego zakażenia S. pneumoniae i różnych stopni immunosupresji. Obecnie nie ma złotego standardu do wykrywania odpowiedzi komórkowych przeciwko S. pneumoniae, dlatego trudno jest określić czułość i swoistość naszego testu ELISpot. Ponadto analizę komplikuje fakt, że częste naturalne infekcje pneumokokami mogą również prowadzić do humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej.

Ponieważ zaobserwowaliśmy zależność od dawki odpowiedzi ELISpot (z krzywą dawka-odpowiedź w kształcie dzwonu) i wzrost odpowiedzi po szczepieniu, wyniki spełniają główne cechy odpowiedzi komórkowych specyficznych dla antygenu. Podczas gdy metodą ELISpot mogliśmy wykryć specyficzną dla serotypu produkcję IFN-, odpowiedzi proliferacyjne były ogólnie na niskim poziomie. To odkrycie dobrze pasuje do poprzedniego badania na zaszczepionych zdrowych osobach kontrolnych, które również nie mogły wykryć specyficznej proliferacji limfocytów T po stymulacji szczepionką polisacharydową [17].

Jak wykazała analiza Spearmana, odporność komórkowa i humoralna przeciwko S. pneumoniae korelowała dodatnio, ale raczej słabo (r {{0}}},32). Odkrycie to jest zgodne z odpowiedziami immunologicznymi na inne antygeny drobnoustrojów, np. na wirusa zapalenia wątroby typu B (r=0.38) [31] lub wirusa SARS-CoV-2 (r=0. 20–0,52, w zależności od bodźca antygenowego i kohorty) [32].

Wcześniej analizowaliśmy wpływ leczenia immunosupresyjnego na specyficzną dla serotypu odporność humoralną po szczepieniu Prevenarem 13 [15]. Nasze badanie wykazało, że 35 biorców przeszczepu nerki, którzy otrzymali leczenie mykofenolanem mofetylu w porównaniu z 14, odpowiedziało na szczepienie mniejszym wzrostem miana w teście zabijania opsonofagocytów (OPA), jak również globalnym i specyficznym dla serotypu anty-pneumokokowym polisacharydem otoczkowym (PCP) IgG, IgG2 i IgA w miesiącach 1 i 12 po szczepieniu. Trzydziestu trzech pacjentów otrzymujących takrolimus miało wyższe miana OPA i specyficzne dla serotypu anty-PCP IgG w porównaniu z 16, którzy tego nie robili. Ponadto wykazywały wyższe stężenia IgA 12 miesięcy po szczepieniu. Biorąc pod uwagę dodatnią korelację między odpornością komórkową i humoralną, można spekulować, że również odporność komórkowa przeciwko pneumokokom jest zależna od schematu immunosupresyjnego.

Chociaż pomiar jest zalecany, wartość predykcyjna mian przeciwciał przeciwko S. pneumoniae w zakresie ochrony przed infekcjami pozostaje niejasna u pacjentów po przeszczepach. Miejmy nadzieję, że odpowiedź komórek T wykryta metodą ELISpot lepiej koreluje z występowaniem zdarzeń klinicznych. Niemniej jednak należy to przeanalizować.

Podsumowując, opisana w niniejszej pracy metoda ELISpot pozwoli na dalsze badania. Mogłoby to pomóc w określeniu czynników wpływających na swoistą odporność komórkową przeciwko pneumokokom w kohorcie po przeszczepie lub na czas trwania odporności komórkowej po szczepieniu.

Autorskie Wkłady:

Konceptualizacja, OW, BW i ML; metodologia, ML; walidacja, ML i AG; analiza formalna, ML; dochodzenie, ML, AG i OW; zasoby, NM, KV, BW, UE, HR i OW; przechowywanie danych, ML, KV i AG; pisanie — oryginalne przygotowanie projektu, ML i AG; pisanie – recenzja i redakcja, BW, NM i PAH; wizualizacja, ML; nadzór, ML, NM i OW; administracja projektami, OW; pozyskanie finansowania, AG, PAH i OW Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu.

Finansowanie:

Badania te nie otrzymały żadnego zewnętrznego finansowania. AG jest wspierana przez grant badawczy od Stiftung Universitätsmedizin. OW jest wspierany przez nieograniczoną dotację z RudolfAckermann-Stiftung (Stiftung für Klinische Infektiologie).

Oświadczenie Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej:

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Essen, Niemcy (14-5858-BO).

Oświadczenie o świadomej zgodzie:

Świadomą zgodę uzyskano od wszystkich osób biorących udział w badaniu.

Oświadczenie o dostępności danych:

Dane przedstawione w tym badaniu są dostępne na żądanie od odpowiedniego autora. Dane nie są publicznie dostępne ze względu na ograniczenia prywatności.

Podziękowanie:

Jesteśmy wdzięczni Babette Große-Rhode za jej doskonałą pomoc techniczną.

Konflikt interesów:

Firma AG otrzymała wynagrodzenie dla mówców, honoraria i koszty podróży od firm Alexion, BioMérieux, Novartis i Sanofi. OW otrzymał granty badawcze na badania kliniczne, honoraria prelegentów, honoraria i koszty podróży od Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers Squibb, Correvio, Chiesie, Gilead, Hexal, Janssen, F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi i TEVA. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; lub w decyzji o opublikowaniu wyników.

Bibliografia

1. Simell, B.; Auranen, K.; Kayhty, H.; Goldblatt, D.; Dagan R.; O'Brien, KL; Przewóz pneumokoków, G. Podstawowy związek między przenoszeniem pneumokoków a chorobą. Ekspert Rev. Vaccines 2012, 11, 841–855. [CrossRef] [PubMed]

2. Biuro Krajowego Programu Szczepień. Plany szczepień dorosłych.

3. Arora, S.; Kipp, G.; Bhanot, N.; Sureshkumar, KK Szczepienia u biorców przeszczepu nerki: Oczyszczanie błotnistych wód. Świat J. Transpl. 2019, 9, 1–13. [CrossRef] [PubMed]

4. Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom. Stosowanie skoniugowanej szczepionki 13-Valent przeciwko pneumokokom i 23-Valentnej polisacharydowej szczepionki przeciwko pneumokokom u osób dorosłych z zaburzeniami odporności: zalecenia Komitetu Doradczego ds. Szczepień (ACIP). MMWR 2012, 61, 816–819.

5. Instytut Roberta Kocha. Wissenschaftliche Begründung für die Aktualisierung der Empfehlungen zur Indikationsimpfung gegen Pneumokokken für Risikogruppen. Epid. Byk. 2016, 37, 385–406.

6. Bonten, MJ; Huijts, SM; Bolkenbaas, M.; Webber, C.; Patterson, S.; Gault, S.; van Werkhoven, CH; van Deursen AM; Sanders, EA; Verheij, TJ; i in. Polisacharydowa skoniugowana szczepionka przeciwko pneumokokowemu zapaleniu płuc u dorosłych. N. angielski J. Med. 2015, 372, 1114–1125. [Odnośnik]

7. Europejska Agencja Leków: Sprawozdanie oceniające dotyczące preparatu Prevenar 13.

8. Soininen, A.; Seppala, I.; Nieminen, T.; Eskola, J.; Kayhty, H. Rozkład podklasy IgG przeciwciał po szczepieniu dorosłych skoniugowanymi szczepionkami przeciw pneumokokom. Szczepionka 1999, 17, 1889–1897. [Odnośnik]

9. Avci, FY; Li, X.; Tsuji, M.; Kasper, DL Mechanizm aktywacji adaptacyjnego układu odpornościowego przez szczepionkę glikokoniugatową i jego implikacje dla projektowania szczepionek. Nat. Med. 2011, 17, 1602–1609. [Odnośnik]

10. Słońce, X.; Stefanetti, G.; Berti, F.; Kasper, Struktura polisacharydu DL dyktuje mechanizm adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej na szczepionki glikokoniugatowe. proc. Natl. Acad. nauka Stany Zjednoczone 2019, 116, 193–198. [Odnośnik]

11. Niehues, T.; Bogdan C.; Hecht, J.; Mertens, T.; Wiese-Posselt, M.; Zepp, F. Impfen bei Immundefizienz. Bundesgesundheitsblatt Gesundh. Gesundh. 2017, 60, 674–684. [Odnośnik]

12. Tobudic, S.; Tłok, V .; Sunder-Plassmann, G.; Riegersperger, M.; Burgmann, H. Randomizowane, kontrolowane badanie z pojedynczą ślepą próbą w celu oceny strategii pierwotnej dawki przypominającej dla szczepienia przeciwko pneumokokom u biorców przeszczepu nerki. PLoS ONE 2012, 7, e46133. [Odnośnik]

13. Dendle, C.; Stuart, RL; Mulley, WR; Holdsworth, SR Szczepienia przeciwko pneumokokom u dorosłych biorców przeszczepów narządów miąższowych: przegląd aktualnych dowodów. Szczepionka 2018, 36, 6253–6261. [Odnośnik]

14. Hoffman, TW; Łagodny, B.; Rijkers, GT; Grutters, JC; van Kessel, DA Szczepienie koniugatem pneumokoków, a następnie szczepienie polisacharydem pneumokoków u kandydatów i biorców przeszczepu płuc. Transpl. Bezpośredni 2020, 6, e555. [Odnośnik]

15. Oesterreich S.; Lindemann, M.; Goldblatt, D.; Róg, Pensylwania; Wilde, B.; Witzke, O. Humoralna odpowiedź na 13-walentną skoniugowaną szczepionkę przeciwko pneumokokom u biorców przeszczepu nerki. Szczepionka 2020, 38, 3339–3350. [Odnośnik]

16. Blanchard-Rohner, G.; Enriquez, N.; Lemaitre, B.; Cadau, G.; Giostra, E.; Hadaya, K.; Meyer, P.; Gasche-Soccal, PM; Berney, T.; van Delden, C.; i in. Odporność na pneumokoki i odpowiedź na szczepionkę PCV13 u kandydatów i biorców SOT. Szczepionka 2021, 39, 3459–3466. [Odnośnik]

17. Wuorimaa, T.; Kayhty, H.; Eskola, J.; Bloigu, A.; Leroy, O.; Surcel, HM Aktywacja odporności komórkowej po immunizacji skoniugowaną lub polisacharydową szczepionką pneumokokową. Skanuj. J. Immunol. 2001, 53, 422–428. [Odnośnik]

18. Rabian, C.; Tschope, I.; Lesprit, P.; Katlama, C.; Molina, JM; Meynard, JL; Delfraissy, JF; Chene, G.; Levy, Y.; Grupa, APS Komórkowe odpowiedzi limfocytów T CD4 na pochodzące z błonicy białko nośnikowe skoniugowanej szczepionki przeciw pneumokokom i odpowiedź przeciwciał na szczepienie przeciw pneumokokom u dorosłych zakażonych wirusem HIV. Clin. Infekować. Dis. 2010, 50, 1174–1183. [Odnośnik]

19. Gazi, U.; Karasartova, D.; Sahiner, IT; Gureser, AS; Tosun, O.; Derici, MK; Dołapci, M.; Taylan Ozkan, A. Wpływ splenektomii na poziomy limfocytów B i T pamięci indukowanych przez PCV-13-. Int. J. Clin. ćwiczyć. 2018, 72, e13077. [Odnośnik]

20. Karasartova, D.; Gazi, U.; Tosun, O.; Gureser, AS; Sahiner, IT; Dołapci, M.; Ozkan, AT Komórkowe odpowiedzi immunologiczne wywołane szczepionką przeciwko pneumokokom u osób po splenektomii pourazowej. J. Clin. immunol. 2017, 37, 388–396. [Odnośnik]

21. Glennie, SJ; Sepako, E.; Mzinza, D.; Harawa, V.; mile, DJ; Jambo, KC; Gordon, SB; Williams, NA; Heyderman, RS Upośledzona odpowiedź komórek T CD4 na Streptococcus pneumoniae poprzedza wyczerpanie komórek T CD4 u dorosłych mieszkańców Malawi zakażonych wirusem HIV. PLoS ONE 2011, 6, e25610. [Odnośnik]

22. Sepako, E.; Glennie, SJ; Jambo, KC; Mzinza, D.; Iwajomo, Ohio; Banda, D.; van Oosterhout, JJAWN; Gordon, SB; Heyderman, RS Niepełne odzyskanie odporności limfocytów T CD4 na pneumokoki po rozpoczęciu terapii przeciwretrowirusowej u dorosłych mieszkańców Malawi zakażonych wirusem HIV. PLoS ONE 2014, 9, e100640. [Odnośnik]

23. Baril, L.; Dietemann, J.; Essevaz-Roulet, M.; Beniguel, L.; Coan, P.; Briles, Niemcy; Facet, B.; Cozon, G. Pneumokokowe białko powierzchniowe A (PspA) jest skuteczne w wywoływaniu odpowiedzi za pośrednictwem komórek T podczas inwazyjnej choroby pneumokokowej u dorosłych. Clin. Do potęgi. immunol. 2006, 145, 277–286. [Odnośnik]

24. Jaat, FG; Hasan, SF; Perry, A.; Cookson, S.; Murali, S.; Perry, JD; Lanyon, CV; De Soyza, A.; Todryk, SM Reakcje przeciwciał przeciwbakteryjnych i limfocytów T w rozstrzeniach oskrzeli są w różny sposób związane z kolonizacją płuc i chorobą. Oddech. Rez. 2018, 19, 106. [Odsyłacz]

25. Groneck, L.; Schrama, D.; Fabri, M.; Stephen, TL; Harms, F.; Meemboor, S.; Hafke, H.; Bessler, M.; Becker, JC; Kalka-Moll, WM Oligoklonalne komórki T CD4 plus promują odpowiedzi immunologiczne pamięci gospodarza na polisacharyd obojnaczy zapalenia płuc Streptococcus. Infekować. Odporność 2009, 77, 3705–3712. [Odnośnik]

26. Holtmeier, W.; Kabelitz, D. Komórki T Gamma delta łączą wrodzone i adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne. chemia immunol. Alergia 2005, 86, 151–183. [Odnośnik]

27. Kirby, AC; Newton, DJ; zgrzeblenie, SR; Kaye, PM Dowody na udział specyficznych dla płuc podzbiorów komórek T gamma delta w lokalnych odpowiedziach na infekcję Streptococcus pneumoniae. Eur. J. Immunol. 2007, 37, 3404–3413. [Odnośnik]

28. Kanevskiy, LM; Telford, WG; Sapożnikow AM; Kovalenko, EI Lipopolisacharyd indukuje produkcję IFN-gamma w ludzkich komórkach NK. Przód. immunol. 2013, 4, 11. [Odsyłacz]

29. Lindemann, M.; Heinemann, FM; Róg, Pensylwania; Witzke, O. Odporność na antygeny pneumokokowe u biorców przeszczepów nerki. Transplantacja 2010, 90, 1463–1467. [Odnośnik]

30. Goldblatt, D.; Plikaytis, BD; Akkoyunlu, M.; Antonello, J.; Ashton, L.; Blake, M.; Burton, R.; Pielęgnacja, R.; Durant, N.; Feavers, I.; i in. Ustanowienie nowej ludzkiej standardowej surowicy referencyjnej dla pneumokoków, 007sp. Clin. Immunol szczepionkowy. 2011, 18, 1728–1736. [Odnośnik]

31. Lindemann, M.; Barsegian, V.; Siffert, W.; Ferencik S.; Roggendorf, M.; Grosse-Wilde, H. Rola polimorfizmów podjednostki beta3 białka G C825T i HLA klasy II w odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu HBV. Wirusologia 2002, 297, 245–252. [Odnośnik]

32. Lindemann, M.; Klisanin, W.; Thümmler, L.; Fisenkci, N.; Tsachakis-Mück, N.; Ditschkowski, M.; Schwarzkopf S.; Klump, H.; Reinhardt, HC; Róg, Pensylwania; i in. Humoralne i komórkowe reakcje na szczepienie przeciwko SARS-CoV-2 u biorców przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych. Szczepionki 2021, 9, 1075. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com