Estrogenna aktywność glikozydów z Cistanche Deserticola jako adiuwanta receptorów estrogenowych in vitro

WSTĘP

Cistanche desericola(„Rou Cong Rong” po chińsku), tradycyjny chiński lek ziołowy, który po raz pierwszy odnotowano w rShenNongBenCaoJing, był stosowany w leczeniu niewydolności nerek, impotencji, zaparć starczych i niedoborów krwi od tysięcy lat.[1] Występuje głównie w pustynnych regionach północno-zachodnich Chin, takich jak Gansu i Xinjiang.[2]Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że C. desericola może wspomagać szerokie funkcje lecznicze, takie jak regulacja hormonów, działanie immunomodulujące, przeciwutleniające, neuroprotekcyjne, przeciwzapalne idziałanie estrogenne.[3,4] Glikozydy Cistanches(GC) uznano za jeden z głównych składników aktywnych o różnym działaniu biologicznym.

Receptory estrogenowe (ER) i ER to podtypy ER, które mogą regulować funkcje fizjologiczne.[7] Białka te mogą regulować transkrypcję docelowych genów poprzez wiązanie się z powiązanymi sekwencjami regulacyjnymi DNA w jądrze komórkowym. Oba podtypy ulegają wyraźnej ekspresji w układzie sercowo-naczyniowym i ośrodkowym układzie nerwowym.[8,9] ER występuje głównie w gruczole sutkowym, macicy, jajniku, kości, męskich narządach rozrodczych i prostacie. ER występuje głównie w prostacie, jajniku i pęcherzu.[10,11] Co więcej, istnieją pewne wspólne role fizjologiczne dla tych dwóch podtypów, takie jak rozwój i funkcjonowanie jajników oraz ochrona układu sercowo-naczyniowego. 12,13] Poprzednie badania w naszej grupie ujawniły estrogenopodobny mechanizm GC metodą analizy metabolomicznej.[14] W ciągłym badaniu analizowaliśmy mechanizm estrogennego działania GC na linie komórkowe MCF-7 powiązane z ER.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWYAKTYWNOŚĆ ESTROGENNAPHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIAŁY I METODY

Instrumenty

Inkubator ECO‑170P‑230 pochodził od New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., czytnik mikropłytek Bio‑Rad 680 i aparat do elektroforezy pochodziły od Bio‑Rad Laboratories, Inc., mikroskop CX21 pochodził od Olympus Co., Ltd., System obrazowania żelowego GIS‑2019 pochodził od Tanon Science and Technology Co., Ltd., płytka z płaskim dnem pochodziła od Corning Inc., cytometria przepływowa EPICS‑XL pochodziła od Beckman‑Coulter Inc., a reakcja łańcuchowa polimerazy StepOnePlus Real-Time ( PCR) pochodził z firmy Thermo Fisher Scientific.

Chemikalia i odczynniki

GC przygotowano w naszym laboratorium zgodnie z metodą opisaną wcześniej [14], a czystość GC określono na 52% (akteozyd zastosowano jako marker do określenia GC) za pomocą spektrofotometrii w ultrafiolecie. Estradiol (E2) zakupiono od Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny). Płodowa surowica bydlęca (FBS) i RPMI-1640 pochodziły z Gibco Co., Ltd., 96-dołkowa płytka z płaskim dnem pochodziła z Corning Inc., a sulfotlenek dimetylu (DMSO) i 3-[4,5-dimetylo-2-tiazolil Bromek ]-2,5-difenylotetrazoliowy (MTT) zakupiono od Sigma-Aldrich Corporation. Odczynnik TRIzol, zestaw odwrotnej transkrypcji (RT) i zestaw TB Green™ RT-PCR zakupiono od TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Chiny. Przeciwciała anty-ER Rabbit pAb, anty-ER Rabbit pAb i przeciwciała aktyny zakupiono od Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Wszystkie pozostałe popularne chemikalia zakupiono od standardowych dostawców komercyjnych.

przygotowanie próbki

Przygotowanie glikozydów z roztworu podstawowego Cistanches

Ekstrakt GC rozpuszczono w DMSO, otrzymując roztwór podstawowy o stężeniu 0,1051 g/ml i przechowywano w temperaturze 4°C. Do rozcieńczenia roztworu podstawowego do różnych stężeń przed użyciem zastosowano RPMI‑1640 niezawierający czerwieni fenolowej.

Przygotowanie roztworu podstawowego estradiolu

Ekstrakt E2 rozpuszczono w DMSO, otrzymując roztwór podstawowy o stężeniu 0,27 mg/ml i przechowywano w temperaturze 4°C. Do rozcieńczenia roztworu podstawowego do różnych stężeń przed użyciem zastosowano RPMI‑1640 niezawierający czerwieni fenolowej.

Przygotowanie płodowej surowicy bydlęcej traktowanej węglem drzewnym i dekstranem

Sto mililitrów FBS zmieszano z 250 mg sproszkowanego węgla aktywowanego i 25 mg dekstranu. Po inkubacji przez 45 minut w temperaturze 55 stopni, mieszaninę odwirowano w temperaturze 4 stopni i 1000 obr./min przez 15 minut. Supernatant przefiltrowano przy użyciu membrany Millipore Express PES, aby otrzymać węgiel drzewny traktowany dekstranem (CDT)-FBS i przechowywano w temperaturze -20°C.

Hodowlę komórkową

Linie komórkowe ludzkiego raka piersi MCF-7 uzyskano z kolekcji kultur typu amerykańskiego (ATCC). Ponadto komórki hodowano na pożywce RPMI‑1640 zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 stopni w wilgotnej atmosferze 5% CO2. Komórki hodowano w pożywce RPMI‑1640 pozbawionej czerwieni fenolowej zawierającej 5% CDT‑FBS 4 dni przed oznaczeniem MTT, aby umożliwić usunięcie estrogenu z komórek.

Analiza proliferacji komórek estradiolu na liniach komórkowych MCF-7

Proliferację komórek mierzono za pomocą testu MTT dla komórek MCF-7.[15,16] E2 rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI-1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowym stężeniu {{27 }}.1, 1, 10, 100 i 1000 nM. Linie komórkowe MCF‑7 hodowano w pożywce RPMI‑1640 pozbawionej czerwieni fenolowej przez 4 dni. Po trzykrotnym przemyciu solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), do 96-dołkowych płytek dodano 100 µl pożywki RPMI-1640 niezawierającej FBS w ilości 1,5 x 104 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki traktowano roztworem E2 o różnych stężeniach przez 72 godziny. Następnie do każdej studzienki dodano 100 µl roztworu MTT (0,5 mg/ml). Komórki inkubowano przez 4 godziny. Na koniec dodano 150 µl DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Absorbancję mierzono przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek i obliczano szybkość proliferacji (PR).

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWY FUNKCJI SEKSUALNYCH PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza proliferacji komórek glikozydów Cistanches na liniach komórkowych MCF-7

Proliferację komórek mierzono za pomocą testu MTT dla komórek MCF‑7. GC rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI‑1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowych stężeniach 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 i 175 µg /ml. Linie komórkowe MCF‑7 hodowano w wolnej od czerwieni fenolowej pożywce RPMI‑1640 zawierającej 5% CDT‑FBS przez 4 dni. Po trzykrotnym przemyciu PBS, 100 µl pożywki RPMI‑1640 wolnej od FBS dodano do 96-dołkowych płytek po 1,5 x 104 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki traktowano roztworem GC o różnych stężeniach odpowiednio przez 24, 48 i 72 godziny. Następnie do każdej studzienki dodano 100 µl roztworu MTT (0,5 mg/ml). Komórki inkubowano przez 4 godziny. Na koniec dodano 150 µl DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Absorbancję mierzono przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek i obliczano PR. Bez czerwieni fenolowej RPMI‑1640 i pożywka zawierająca E2 (2,725 × 10–3 µg/ml) stanowiły odpowiednio grupę ujemną i dodatnią.

Analiza proliferacji komórek glikozydów Cistanches z fulwestrantem na liniach komórkowych MCF-7

Proliferację komórek mierzono za pomocą testu MTT dla komórek MCF‑7. GC rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI‑1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowych stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/ml. Linie komórkowe MCF‑7 hodowano w wolnej od czerwieni fenolowej pożywce RPMI‑1640 zawierającej 5% CDT‑FBS przez 4 dni. Po trzykrotnym przemyciu PBS, 100 µl pożywki RPMI‑1640 wolnej od FBS dodano do 96-dołkowych płytek po 1,5 x 104 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki traktowano roztworem GC o różnym stężeniu i inkubowano z fulwestrantem (6,06 × 10-5 µg/ml) przez 48 godzin. Następnie do każdej studzienki dodano 100 µl roztworu MTT (0,5 mg/ml). Komórki inkubowano przez 4 godziny. Na koniec dodano 150 µl DMSO w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Absorbancję mierzono przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek i obliczano PR. Niezawierająca czerwieni fenolowej RPMI‑1640 i pożywka zawierająca E2 (2,725 × 10–3 µg/ml) stanowiły odpowiednio grupę ujemną i dodatnią.

Test cyklu komórkowego

GC rozpuszczono w pożywce hodowlanej RPMI‑1640 zawierającej 0,1% DMSO w końcowych stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/ml. Linie komórkowe MCF‑7‑hodowano w wolnej od czerwieni fenolowej pożywce RPMI‑1640 zawierającej 5% CDT‑FBS przez 4 dni. Po trzykrotnym przemyciu PBS, do 6-dołkowych płytek dodano 1 ml wolnej od FBS pożywki RPMI-1640 po 2,5 x 105 na dołek i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 24 godziny. Następnie komórki traktowano roztworem GC o różnym stężeniu i inkubowano z fulwestrantem (6,06 × 10-5 µg/ml) przez 48 godzin. Następnie komórki zebrano i przemyto trzykrotnie PBS, odwirowano przy 4 stopniach, 1000 obr./min przez 10 minut i utrwalono 70% etanolem w -20 stopniach przez noc. Po dwukrotnym przemyciu PBS komórki barwiono roztworem PI (50 mg/ml) zawierającym 1 mg/ml RNazy A i 0,1% Triton X-100 przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4°C. Cykl komórkowy wykrywano za pomocą cytometrii przepływowej i obliczano wskaźnik proliferacji (PI) w następujący sposób. Bez czerwieni fenolowej RPMI‑1640 i pożywka zawierająca E2 (2,725 × 10–3 µg/ml) stanowiły odpowiednio grupę ujemną i dodatnią.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100%

Izolacja RNA i ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Do pomiaru poziomu mRNA zastosowano ilościowy test PCR RT (qPCR). Całkowity RNA komórkowy ekstrahowano odczynnikiem TRIzol. W przypadku qPCR RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA z 4 µg całkowitego RNA przy użyciu zestawu RT. Analizy RT‑PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu TB Green™ RT‑PCR. Wszystkie protokoły wykonano zgodnie z instrukcjami producenta. Para starterów zastosowana do amplifikacji ER to 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (do przodu) i 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (do tyłu); parą starterów zastosowaną do amplifikacji ER była 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (do przodu) i 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (do tyłu). Warunki PCR dla ER i ER wynosiły 94 stopnie przez 3 minuty, a następnie odpowiednio 37 i 40 cykli, odpowiednio 94 stopnie przez 30 s, 58 stopni przez 2 minuty i 72 stopnie przez 2 minuty. Para starterów zastosowana do amplifikacji GAPDH to 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (do przodu) i 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (do tyłu). Warunki PCR dla GAPDH wynosiły 94 stopnie przez 3 minuty, następnie 30 cykli po 94 stopnie przez 30 s, 58 stopni przez 2 minuty i 72 stopnie przez 2 minuty. Za każdym razem eksperyment RT‑qPCR powtarzano więcej niż dwa razy. W tym celu jako kontrolę wewnętrzną zastosowano GAPDH. Obliczono względną ekspresję genu ER/ER transfektantów w komórkach kontrolnych: 2-(∆∆Ct).

Western blotting

Ekspresję białek ER i ER wykryto metodą Western blot jako opisaną metodą z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, komórki MCF-7 hodowano na płytkach 6-dołkowych w ilości 2,5 x 105 komórek na dołek i traktowano GC w końcowym stężeniu odpowiednio 1,75, 17,5 i 175 µg/ml przez 48 godzin. Po inkubacji przygotowano ekstrakty z całych komórek, stosując bufor RIPA zawierający 1 mM PMSF. Białka w ekstraktach całych komórek rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z 12% dodecylosiarczanem sodu, a następnie przeniesiono na membrany z difluorku poliwinylidenu. Błonę blokowano 5% (w/v) odtłuszczonym mlekiem rozpuszczonym w buforze TBST i inkubowano kolejno z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi. Obserwowano związane przeciwciała.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWYAKTYWNOŚĆ ESTROGENNAPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza statystyczna

Wyniki wyrażono jako średnie i odchylenia standardowe, a istotność statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta z oprogramowaniem SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was considered statistically significant. 

WYNIKI

Po 24 godzinach leczenia E2 wzrosła proliferacja komórek MCF‑7 [Rysunek 1a]. 10 nM roztworu E2 mogłoby oczywiście stymulować wzrost komórek (123,89%). Jednakże wraz ze wzrostem stężenia E2 zdolność komórek do proliferacji słabła. Zatem optymalne stężenie E2 w tym eksperymencie stanowiło 10 nM. Grupa GC w stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/mg mogła zwiększać proliferację linii komórkowych MCF-7 w sposób zależny od czasu i dawki i wykazywała znaczącą różnicę w porównaniu z grupą ujemną [Figura 1b]. W porównaniu z grupą ujemną, grupa E2 wykazywała wyraźną proliferację (120,06%). Grupę leków skojarzonych (CMG) (fulwestrant z E2 lub GC) w pożywce CDT‑FBS inkubowano z komórkami MCF‑4. Po 72 godzinach

inkubacji, CMG może prowadzić do wzrostu PR w porównaniu z indywidualną grupą leków (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

WNIOSEK

W badaniach tych wpływ GC na proliferację i cykl komórkowy MCF-7 oceniano odpowiednio metodą MTT i cytometrią przepływową.GC mogą zwiększać proliferację komórek MCF-7w stężeniach 1,75, 17,5 i 175 µg/ml po inkubacji przez 72 godziny. Jednakże wzrost ten ma tendencję do zwalniania w przypadku jednoczesnego stosowania CC i fulwestrantu. GC mogą zwiększać wartość PI komórek MCF-7, zmniejszać liczbę komórek w fazie G1 i zwiększać liczbę komórek w fazach S i G2.

Fulwestrant jest antagonistą specyficznym dla ER, który blokuje lokalizację ER w jądrze poprzez upośledzanie dimeryzacji receptora i transportu jądrowego zależnego od energii.[17] Wyniki tych badań potwierdziły, że fulwestrant może osłabiać proliferację GC na komórkach MCF-7 i wpływać na transformację cyklu komórkowego. Dlatego badanie to wykazało estrogenną aktywność GC, a także ER

cel GC. W eksperymencie RT‑PCR i Western blot ekspresja mRNA i białek ER i ER w komórkach MCF‑7 rosła wraz ze wzrostem stężenia GC. Stąd,GC mogą odgrywać rolę w aktywności estrogenowejzgodnie z regulowanym w górę mRNA i białkami ER i ER.

NATURALNY CISTANCHE TUBULOSA DLA POPRAWYAKTYWNOŚĆ ESTROGENNAPHGS75% ECH 30% ACT 12%