Ocena wpływu szczepionki podjednostkowej E2Fc i E2Ft na odporność błony śluzowej bydła

Abstrakcyjny:

Wirusowa biegunka/choroba błon śluzowych bydła, sklasyfikowana jako choroba zakaźna klasy B przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt (OIE), jest ostrą, wysoce zaraźliwą chorobą wywoływaną przez wirus wirusowej biegunki bydła (BVDV). Sporadyczne endemity BVDV często prowadzą do ogromnych strat ekonomicznych w przemyśle mleczarskim i mięsnym. Aby rzucić światło na zapobieganie i kontrolę BVDV, opracowaliśmy dwie nowe szczepionki podjednostkowe poprzez ekspresję rekombinowanych białek fuzyjnych E2 wirusa wirusowej biegunki bydła (E2Fc i E2Ft) poprzez zawieszone komórki HEK293. Oceniliśmy także wpływ szczepionek na układ odpornościowy. Wyniki wykazały, że obie szczepionki podjednostkowe indukowały intensywną odpowiedź immunologiczną błon śluzowych u cieląt. Mechanicznie, E2Fc wiązał się z receptorem Fc (Fc RI) na komórkach prezentujących antygen (APC) i promował wydzielanie IgA, prowadząc do silniejszej odpowiedzi immunologicznej komórek T (typ Th1). Miano przeciwciał neutralizujących stymulowane przez szczepionkę podjednostkową E2Fc immunizowaną błoną śluzową osiągnęło poziom 1:64, czyli był wyższy niż w przypadku szczepionki podjednostkowej E2Ft i szczepionki inaktywowanej domięśniowo. Dwie nowe szczepionki podjednostkowe stosowane w leczeniu odporności śluzówkowej opracowane w tym badaniu, E2Fc i E2Ft, można dalej stosować jako nowe strategie zwalczania BVDV poprzez wzmacnianie odporności komórkowej i humoralnej.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Słowa kluczowe: BVDV; szczepionka podjednostkowa; szczepienie błony śluzowej; adiuwanty molekularne; receptor Fc; ferrytyna

1. Wstęp

Wirus wirusowej biegunki bydła (BVDV), wraz z wirusem choroby granicznej (BDV) i wirusem pomoru świń (CSFV), należy do rodzaju Pestivirus z rodziny Flaviviridae [1]. Połączenie trwałej infekcji (PI) i infekcji cytopatycznej u cieląt często skutkuje ciężką chorobą błon śluzowych, ze śmiertelnością sięgającą 100% [2]. BVDV jest szeroko rozpowszechniony na świecie, ze stosunkowo wysokim odsetkiem przeciwciał dodatnich. W Chinach dominują typy 1B, 1M i 1Q typu-1 BVDV [3–5]. Analiza filogenetyczna wykazała, że ​​wirus wirusowej biegunki bydła typu 1 został przywieziony do Chin w latach 60. XX wieku i że w Chinach krąży co najmniej osiem genotypów wirusa BVDV-1. Wśród nich głównymi genotypami są 1B i 1m [6]. Jest to zgodne z naszym dochodzeniem epidemiologicznym dotyczącym wirusa BVDV w Tybecie. Sferyczny wirion BVDV ma średnicę około 40–60 nm i jest otoczony torebką. Genom jednoniciowego wirusowego RNA wirusa BVDV ma długość około 12,5 KB. Wirusowa poliproteina jest następnie rozszczepiana przez kombinację proteaz gospodarza i wirusa na cztery białka strukturalne (C, E0, E1, E2) i osiem białek niestrukturalnych (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) [7, 8]. BVDV-E2 charakteryzuje się silną immunogennością, a dowody wykazały, że przeciwciała neutralizujące (NAbs) indukowane u zakażonych zwierząt atakują głównie E2 [9]. Tymczasem multiwalentne szczepionki podjednostkowe E2 ukierunkowane na główne krążące szczepy BVDV mogą zapewnić częściową ochronę przed szczepami homologicznymi. Rekombinowana szczepionka przeciwko herpeswirusowi zbudowana z białka E2 BVDV i białka D bydlęcego wirusa opryszczki 1 (BoHV-1) indukowała specyficzną odpowiedź immunologiczną na oba wirusy u żywiciela po nebulizacji donosowej [10]. Dlatego dobrą strategią kontroli BVDV może być zastosowanie immunodominującego białka E2 BVDV jako szczepionki podjednostkowej. Jama nosowa jest bogata w limfocyty i komórki prezentujące antygen, zapewnia odpowiednie mikrośrodowisko do immunizacji błony śluzowej i chroni szczepionki białkowe przed destabilizacją przez kwasy i zasady. Ponadto indukowana szczepionką donosową immunoglobulina A (IgA) oraz limfocyty B i T pamięci rezydentnej w górnych drogach oddechowych są w stanie skutecznie blokować replikację wirusa [11]. Szczepienie przez jamę nosową nie tylko indukuje odporność błony śluzowej, ale także stymuluje systematyczną odpowiedź immunologiczną, która wywiera działanie immunologiczne. Poprzednie badania wykazały, że antygeny mogą zostać całkowicie dostarczone do nabłonka błony śluzowej poprzez skierowanie szczepionek podjednostkowych na noworodkowy receptor Fc (FcRn) komórek M na nabłonku błony śluzowej, skutecznie stymulując w ten sposób specyficzne odpowiedzi immunologiczne [12–14]. Efekty immunizacyjne aerozolu do nosa są znacznie zwiększone poprzez zastosowanie rozpuszczalnej, rekombinowanej szczepionki utworzonej w wyniku fuzji adiuwanta molekularnego i antygenu immunologicznego [15]. IgGFc oddziałuje z FcRn na powierzchni komórek odpornościowych, uczestnicząc w transporcie IgG przez powierzchnie błony śluzowej, poprawiając immunogenność białek fuzyjnych z Fc u ssaków [16]. Doniesiono, że białka fuzyjne IgGFc tworzą stabilne dimery poprzez wiązania dwusiarczkowe w regionie zawiasowym Fc, co zwiększa okres półtrwania i stabilność rekombinowanych białek, poprawiając w ten sposób komórkową, śluzówkową i humoralną odpowiedź immunologiczną [17,18]. Nowe szczepionki, w których pośredniczy IgGFc, z powodzeniem zastosowano przeciwko wirusowi grypy A (HA-HuFc) [19] i wirusowi pomoru świń (CSFV-E2Fc) [20].

Korzyści z cistanche tubulosa-wzmocnić układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Odpowiednia modyfikacja powierzchni pozwala nanocząstkom stabilnie przebywać w układzie krążenia [21]. Doniesiono, że ferrytyna (Ft), charakteryzująca się dużą powierzchnią i pustą kulistą strukturą, tworzy nanocząstki z 24 identycznych polipeptydów poprzez samoorganizację z różnymi wyrażanymi białkami fuzyjnymi, co sprzyja rozpoznawaniu i wychwytywaniu antygenu przez komórki prezentujące antygen, tym samym wywołując silną odpowiedź immunologiczną [22,23]. Ferrytyna jest szeroko stosowana w opracowywaniu szczepionek. Kowalencyjna integracja antygenu domeny wiążącej receptor (RBD) białka kolczastego SARS-CoV-2 i samoorganizującej się ferrytyny niehemowej Helicobacter pylori skutkuje silną produkcją przeciwciał neutralizujących. Nanocząsteczki białka ferrytyny mają również dużą zdolność do poprawy stabilności antygenu, pokonywania barier biologicznych i osiągania ukierunkowanego dostarczania. Ponieważ nanoszczepionki mogą być skutecznie wychwytywane przez komórki dendrytyczne i makrofagi [24], nanocząsteczki ferrytyny stanowią nową i obiecującą platformę dostarczania antygenów. Obecnie głównymi dostępnymi szczepionkami przeciwko BVDV są szczepionki inaktywowane i szczepionki podjednostkowe, przy czym obie wymagają czasochłonnego i pracochłonnego szczepienia we wstrzyknięciu domięśniowym. Tymczasem inaktywowane szczepionki wytwarzane przez komórki MDBK są podatne na wywoływanie pancytopenii noworodkowej bydła (BNP) [25]. Jednakże szczepionki podjednostkowe wykazały lepszy profil bezpieczeństwa [26]. Wykazano, że immunizacja donosowa kieruje antygeny do receptora FcR, wywołując śluzówkową i ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną [15,16]. Jednakże wpływ immunologiczny donosowej immunizacji szczepionkami BVDV i skuteczność BVDV-E2 w połączeniu z adiuwantami molekularnymi (IgGFc i Ft) pozostają słabo zbadane. Dlatego też opracowanie szczepionek śluzówkowych zawierających białko BVDV-E2 w celu poprawy ich skuteczności immunologicznej jest najwyższym priorytetem w tej dziedzinie. W bieżącym badaniu w komórkach HEK293 wytworzono szczepionki zawierające fuzję białka E2 z podjednostkami Fc lub Ft. Odkrycia wykazały, że szczepienie donosowe szczepionką podjednostkową BVDV E2Fc było skuteczniejsze niż szczepienie donosowe szczepionką podjednostkową E2Ft, co dodatkowo potwierdza wskazania, że ​​białko fuzyjne E2Fc jest silniejszą opcją szczepionki podjednostkowej.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

2. Wyniki

2.1. Ekspresja rekombinowanych białek w zawieszonych komórkach HEK293

Schematy strukturalne E2, E2Ft i E2Fc pokazano na rysunku 1A. Najpierw przeprowadzono pośrednie testy immunofluorescencyjne przy użyciu zakonserwowanego przeciwciała monoklonalnego (mAb) BVDVE2 w celu sprawdzenia ekspresji immunologicznej rekombinowanych białek fuzyjnych. Komórki transfekowane plazmidami zawierającymi geny E2, E2Ft lub E2Fc emitowały sygnał fluorescencyjny, podczas gdy komórki traktowane pozornie nie wykazywały sygnału fluorescencyjnego (Figura 1B). Wskazywało to na silną ekspresję E2, E2Ft i E2Fc w komórkach HEK293. Aby określić, czy białka te ulegały ekspresji wydzielniczej, po 6 dniach zebrano supernatanty komórek HEK293 transfekowanych plazmidami zawierającymi geny E2, E2Ft lub E2Fc. Poziomy ekspresji immunologicznej każdego białka analizowano metodą Western blot z przeciwciałem BVDV-E2. Wyniki wykazały, że komórki transfekowane plazmidami zawierającymi geny E2, E2Ft i E2Fc eksprymowały odpowiednie białka o masach cząsteczkowych odpowiednio 45 kDa, 60 kDa i 80 kDa (Figura 1C). Wyniki barwienia SDS-PAGE i błękitu Coomassie wykazały, że prążki każdej próbki były zgodne z wynikami analizy blottingu (Figura 1D). Aby zapewnić specyficzność i dokładność wykrywania immunoekspresji białka, najpierw przeprowadzono testy przedabsorpcji mAb BVDV-E2, a następnie testy replikacji wirusa i analizę Western w celu potwierdzenia specyficzności mAb BVDV E2. Wyniki wykazały, że przeciwciało może reagować jedynie na białko BVDV-E2 (Rysunek S1). Podsumowując, dowody wykazały, że rekombinowane białka E2, E2Fc i E2Ft ulegały obfitej ekspresji w komórkach HEK293.

Rycina 1. Immunekspresja i identyfikacja białek E2, E2Ft i E2Fc w komórkach HEK293. (A) Schematy konstrukcyjne BVDV-E2, BVDV-E2Ft i BVDV-E2Fc. (B) Wykrywanie immunoekspresji rekombinowanych białek metodą IFA; 48 godzin po transfekcji E2, E2Fc lub E2Ft, komórki HEK293 utrwalono w obecności IFA. Jako przeciwciało pierwszorzędowe i drugorzędowe zastosowano odpowiednio przeciwciało monoklonalne BVDV E2 i kozie anty-mysie IgG FITC. Jądro wybarwiono DAPI (niebieski). Pasek skali reprezentuje 20 µm. (C) Wykrywanie oczyszczonych rekombinowanych białek metodą Western blot. (D) Identyfikacja oczyszczonych rekombinowanych białek metodą SDS-PAGE.

2.2. Aktywacja APC-Fc RI przez BVDV-E2Fc

Rozpoznawanie antygenu BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) przez makrofagi odgrywa ważną rolę w aktywacji odpowiedzi immunologicznej. W celu wykrycia efektu aktywacji białka fuzyjnego na układ odpornościowy, sprawdzono in vitro funkcję rozpoznawania i aktywność fagocytarną białka fuzyjnego przez bydlęce makrofagi pęcherzykowe (BAM). Wyniki pokazały, że CD64 (Fc RI), wykryty za pomocą znaczników kozich przeciwciał IgG znakowanych Cy3- (czerwone), był zlokalizowany w cytoplazmie i błonie komórkowej bydlęcych makrofagów. E2Fc wykryto przy użyciu koziej anty-mysiej IgG (zielona fluorescencja). Obrazy połączono w celu analizy kolokalizacji CD64 (Fc RI) i E2Fc w bydlęcych makrofagach pęcherzykowych (kolor żółty; Figura 2A). Natomiast CD64 nie kolokalizował z E2 lub E2Ft. Wyniki pokazały, że w translokacji białka fuzyjnego E2Fc przez barierę śluzówkową pośredniczy FcRI.

Rysunek 2. Aktywacja APC-Fc RI przez BVDV-E2Fc. (A) Analizę kolokalizacji CD64 (Fc RI) z białkiem E2Fc na BAM wykryto za pomocą mikroskopii konfokalnej. CD64 (Fc RI) na BAM wybarwiono króliczym anty-CD64 i znakowanym Cy3-kozim antykróliczym IgG znakowanym Cy jako przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi, odpowiednio.

Fagocytozę, pobieranie cząstek przez makrofagi, mierzono jako szybkość fagocytozy. Szybkość fagocytozy mikrosfer sprzężonych z FITC, białka E2, E2Ft i E2Fc przez bydlęce makrofagi pęcherzykowe wynosiła odpowiednio 28,9%, 55,6%, 57,1% i 65,6%. Innymi słowy, szybkość fagocytozy E2Fc była wyższa niż E2Ft, co dodatkowo dowodziło, że wychwytywanie antygenów przez monocyty zostało zakończone przez związanie specyficznego receptora na jego powierzchni z odpowiednimi ligandami. Jednakże bydlęce makrofagi pęcherzykowe nie posiadały receptorów dla białek E2 i E2Ft, a ciała obce usuwały jedynie poprzez fagocytozę, która jest najbardziej podstawową metodą obrony organizmu (ryc. 2B).

2.3. Silne odpowiedzi immunologiczne błony śluzowej i humoralnej indukowane przez E2Fc in vivo

Procedurę immunizacji cieląt przedstawiono na Rycinie 3A. Poziomy IgA i SIgA wytwarzanych przez cielęta immunizowane białkiem fuzyjnym wykrywano metodą pośredniego testu ELISA. Pobrano próbki surowicy, kału i błony śluzowej nosa i wykryto je za pomocą komercyjnego zestawu ELISA. Grupa immunizowana E2Fc wykazywała najwyższe poziomy IgA i SIgA w surowicy i błonie śluzowej, zarówno u zwierząt immunizowanych domięśniowo, jak i przez błonę śluzową (p <0.01) (Figura 3B, C). Nie zaobserwowano znaczących różnic w poziomach IgA pomiędzy grupą immunizowaną E2- E2-a grupą immunizowaną E2Ft, ale różniły się one w poziomach SIgA (p < 0,05). Podsumowując, białko fuzyjne E2Fc było zdolne do indukowania silniejszych odpowiedzi immunologicznych błon śluzowych i humoralnych niż inne białka.

2.4. E2Fc może indukować silniejszą odpowiedź immunologiczną komórek T (typ Th1) przeciwko BVDV w porównaniu z E2Ft in vivo

Cytokina typu Th{{0}}, IFN, wyrażana przez limfocyty T i komórki NK pośredniczy w odporności komórkowej, która jest niezbędna do usuwania wirusa. Aby wykryć rozmieszczenie komórek T CD4+ i CD8+ wykazujących ekspresję IFN u cieląt, limfocyty izolowano z PBMC cieląt 35 dni po immunizacji. Limfocyty stymulowano inaktywowanym BVDV, a następnie zastosowano cytometrię przepływową w celu identyfikacji limfocytów T CD{{8} i CD8+ wydzielających IFN. Grupy immunizowane błoną śluzową E2Fc i E2Ft wykazywały znacząco wyższy odsetek limfocytów T CD- -wydzielających IFN4+ i CD8+ w porównaniu z grupą E2. Grupa immunizowana błoną śluzową E2Fc miała wyższy poziom komórek T CD8+ wydzielających IFN- -wydzielających IFN3+ niż grupa immunizowana inaktywowanym wirusem BVDV (p < 0,05) (ryc. 4). Jednakże nie zaobserwowano istotnej różnicy w liczbie limfocytów T CD4+ wydzielających IFN3+ pochodzących z CD4+ pomiędzy grupami z E2Fc immunizowanymi błoną śluzową i z inaktywowanym BVDV. Podsumowując, zarówno wstrzyknięcie domięśniowe, jak i immunizacja błony śluzowej E2Fc indukują silniejszą odpowiedź immunologiczną komórek T (typu Th1) przeciwko BVDV w porównaniu z E2Ft.

Rycina 3. Schemat blokowy eksperymentów immunizacji cieląt oraz śluzówkowa i humoralna odpowiedź immunologiczna indukowana przez E2Fc in vivo. (A) Schemat blokowy konstrukcji szczepionki podjednostkowej BVDV i schemat eksperymentu uodporniania cieląt. (B, C) Pomiar poziomów (B) IgA i (C) wydzielniczych IgA w wymazach z nosa, kale i próbkach surowicy pobranych 14 dnia po wtórnej immunizacji metodą ELISA. n=5, * p < 0.05 i ** p < 0,01

Rycina 4. Odpowiedzi immunologiczne komórek T przeciwko BVDV in vivo. Procent komórek T CD4+ IFN- + i komórek T (B) CD8+ IFN- + po stymulacji w bydlęcych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 i ** ** p < 0,0001.

2.5. Szczepienie rekombinowanymi szczepionkami podjednostkowymi zwiększa zawartość cytokin Th1-typu

Aby zweryfikować wpływ rekombinowanej szczepionki podjednostkowej na komórkową odpowiedź immunologiczną, przeanalizowaliśmy poziomy proliferacji limfocytów i cytokin we krwi obwodowej immunizowanych cieląt. W pierwszej kolejności od cieląt pobrano antykoagulanty 49 dni po immunizacji. Po rozdzieleniu limfocyty stymulowano inaktywowanym ultrafioletem BVDV i mierzono skorelowane wskaźniki. W porównaniu z grupą PBS, wskaźniki stymulacji limfocytów (SI) w grupach immunizowanych szczepionkami podjednostkowymi (E2, E2Fc i E2Ft) wzrosły w różnym stopniu, przy czym najwyższy wskaźnik stymulacji limfocytów (p < 0. 001) w grupach szczepionych E2Fc i inaktywowanych (Rysunek 5A). Ponadto zastosowano komercyjne zestawy kanapkowe ELISA z podwójnymi przeciwciałami przeciwko bydlęcym IFN-, IL-2 i IL-4 w celu wykrycia poziomów cytokin typu Th1- i Th2- w krew obwodowa uodpornionych cieląt. W porównaniu z cielętami leczonymi PBS, poziomy IFN i IL-2 wyrażane u immunizowanych cieląt były znacząco wyższe niż IL-4 w 49 dni po immunizacji. Poziomy IFN- były wyższe w grupie IN-E2Fc niż w grupie szczepionki inaktywowanej (p < 0,05), ale nie było różnicy w IL-2 i IL-4 pomiędzy IM-E2Fc i grupy szczepionek inaktywowanych (ryc. 5B – D). Wyniki te sugerują, że szczepionka podjednostkowa IN-E2Fc znacząco promuje komórkową odpowiedź immunologiczną typu Th1-u cieląt.

Rycina 5. Wzrost zawartości cytokin typu Th1-po immunizacji rekombinowanymi szczepionkami podjednostkowymi. (A) Proliferację komórek limfocytów krwi obwodowej cieląt po 49 dniach immunizacji wykryto za pomocą zestawu do badania proliferacji limfocytów. (B–D) Cytokiny Th1 i Th2 w supernatantach limfocytów wykryto za pomocą bydlęcego zestawu kanapkowego ELISA z podwójnymi przeciwciałami IFN-, IL-2, IL-4. n=5, * p < 0}}.05, ** p < 0,01 i *** p < 0.00

2.6. Przeciwciała specyficzne dla wirusa BVDV mogą być silnie indukowane przez rekombinowane szczepionki podjednostkowe E2Ft i E2Fc in vivo

Przeciwciała specyficzne dla BVDV wykryto metodą ELISA w celu zbadania humoralnej odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez szczepionki podjednostkowe E2, E2Ft i E2Fc. Nie u wszystkich cieląt przed immunizacją nie wykryto przeciwciał swoistych dla wirusa BVDV. Poziomy przeciwciał indukowanych przez szczepionki podjednostkowe E2Ft i E2Fc były znacząco wyższe niż w grupie E2 21 dni po rozpoczęciu (pierwsza dawka) immunizacji (p < 0.00 1). Poziomy przeciwciał dla odporności śluzówkowej po 35 dniach (14 dni po drugiej dawce) i 49 dniach (14 dni po trzeciej dawce) różniły się istotnie pomiędzy grupami E2Ft i E2 (p < 0,05). Ponadto E2Fc było znacząco wyższe niż E2 (p < 0,001). Poziom przeciwciał w grupie immunizacji śluzówkowej (grupy IN-E2Ft i IN-E2Fc) był wyższy niż w grupie, której podano wstrzyknięcie domięśniowe (grupy IM-E2Ft i IM-E2Fc), a poziom przeciwciał w grupie szczepionki inaktywowanej nie był znacząco różni się od grupy IN-E2Fc (ryc. 6). Podsumowując, rekombinowane szczepionki podjednostkowe E2Ft i E2Fc były w stanie wywołać silną humoralną odpowiedź immunologiczną, a odporność błon śluzowych była lepsza niż po wstrzyknięciu domięśniowym, co wskazuje, że rekombinowane szczepionki podjednostkowe E2Fc i E2Ft były wysoce antygenowe.

Rycina 6. Wykrywanie przeciwciał w próbkach surowicy immunizowanych cieląt metodą ELISA w 0, 21, 35 i 49 dniu po immunizacji. n=5, * p < 0.05 i *** p < 0,001

2.7. Neutralizujące przeciwciała przeciwko BVDV indukowane przez rekombinowane szczepionki podjednostkowe in vivo

Próbki krwi pobrano z żyły szyjnej cieląt w 0, 21, 35 i 49 dniu po pierwszej immunizacji. Próbki surowicy oddzielano aseptycznie i inaktywowano w łaźni wodnej w temperaturze 56°C przez 30 min. Przeprowadzono testy neutralizacji w celu określenia poziomów przeciwciał w oddzielonej surowicy. Przeciwciała neutralizujące przeciwko BVDV wykryto w grupach immunizowanych przez błonę śluzową rekombinowanymi szczepionkami podjednostkowymi, przy mianie przeciwciała neutralizującego E2Fc do 1:64. Jest to porównywalne z inaktywowaną szczepionką i lepsze niż domięśniowo wstrzykiwane rekombinowane szczepionki podjednostkowe E2Ft i E2Fc (Figura 7).

Rycina 7. Wykrywanie przeciwciał neutralizujących w próbkach surowicy immunizowanych cieląt w 0, 21, 35 i 49 dniu po immunizacji. Inaktywowane próbki surowicy rozcieńczono w stosunku i wstępnie inkubowano z 200 TCID50 BVDV XZ02 przez 1 godzinę. Próbki surowicy następnie dodano do komórek w 96-dołkowych płytkach i inkubowano przez 72 godziny. Jako przeciwciała pierwotne i wtórne zastosowano królicze przeciwciało anty-E2 i kozie antykrólicze IgG skoniugowane z FITC. n=5, * p < 0,05 i ** p < 0,01

3. Dyskusja

Donoszono, że białko E2 wyrażane w komórkach ssaków jest bardziej skuteczne w neutralizowaniu ochrony przed BVDV niż białko E2 otrzymywane z bakulowirusowego układu ekspresji owadów (brE2) [27]. Hodowla zawiesinowa komórek ssaków charakteryzuje się prostszym procesem i wyższą wydajnością [28]. Zawieszone komórki HEK293 są zdolne do wzrostu w warunkach wolnych od surowicy, a liczba komórek jest wielokrotnie większa niż w hodowli przylegającej, która może być wykorzystana do produkcji przeciwciał na dużą skalę [29]. Wydajność ekspresji pcDNA3.1 w połączeniu z zastosowanym w tym badaniu systemem ekspresji przejściowej ekspresji w komórkach eukariotycznych w zawiesinie była stosunkowo wysoka, a rekombinowane białko można było zebrać sześć dni po transfekcji w stężeniu do 30 mg·L -1, co był wystarczający do późniejszego zastosowania u zwierząt.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Wirus wirusowej biegunki bydła atakuje głównie górne drogi oddechowe i przewód pokarmowy, powodując wyciek z nosa, kaszel, duszność, podwyższenie temperatury ciała i leukopenię, a po przedostaniu się wirusa do krwi następuje wiremia. Dlatego wziewne szczepienie donosowe może zapewnić skuteczniejszą ochronę niż szczepionki podawane bezpośrednio w miejsca zakażenia wirusem. Niedawno wykazano, że immunizacja donosowa może prezentować antygeny receptorom FcR i wywoływać odpowiedzi immunologiczne błon śluzowych i układowe [16]. Ponadto bydlęca IgG1Fc była zdolna do wiązania się z bydlęcym FcR, receptorem o wysokim powinowactwie dla IgG [30). Nasze wyniki dostarczyły dowodów, że Fc z bydlęcej IgG1 może wiązać się z Fc RI na bydlęcych makrofagach pęcherzykowych (BAM), aby osiągnąć transport przezśluzówkowy. Może to przedłużyć trwałość białka fuzyjnego w organizmie i sprzyjać wytwarzaniu specyficznych przeciwciał. Nasze wyniki ujawniły, że poziom SIgA indukowany przez E2Fc immunizowany błoną śluzową był znacząco wyższy niż poziom E2 immunizowanych błoną śluzową (p <0.{{30}}1). Jednakże zaobserwowano jedynie niewielką różnicę pomiędzy grupą E2Fc, której wstrzyknięto domięśniowo, a grupą E2 immunizowaną przez błonę śluzową. Może to być spowodowane faktem, że błona śluzowa jelita cienkiego i krezkowe węzły chłonne uwalniają niewielką ilość SIgA w odpowiedzi na domięśniowe wstrzyknięcie E2Fc z adiuwantem 1313VG. Poziomy IFN- wywołane przez immunizację błony śluzowej E2Fc były znacząco wyższe niż te po immunizacji błony śluzowej E2 (p < 0,01), immunizacji domięśniowej E2Fc i immunizacji błony śluzowej E2Ft. Poziomy IL-2 wywołane immunizacją błony śluzowej E2Fc były znacząco wyższe niż te po immunizacji błony śluzowej E2 i immunizacji domięśniowej E2Ft (p < 0,01). W następnym etapie po trzeciej immunizacji oznaczono ogólny poziom przeciwciał. Wyniki pokazały, że immunizacja błony śluzowej E2Fc indukowała znacząco wyższe poziomy ogólnych przeciwciał w porównaniu ze immunizacją błony śluzowej E2 (p < 0,001), podczas gdy poziomy przeciwciał wywołane przez wstrzyknięty domięśniowo E2Fc i immunizowany przez błonę śluzową E2 były porównywalne z wstrzykniętym domięśniowo E2Ft Grupa. Ogólny wpływ immunologiczny immunizacji błon śluzowych szczepionką podjednostkową E2Fc był lepszy niż immunizacji domięśniowej. Immunizacja błony śluzowej E2Fc nie tylko indukowała wydzielanie SIgA, ale także wywołała specyficzną komórkową odpowiedź immunologiczną typu Th1- i humoralną odpowiedź immunologiczną.

Doniesiono, że glikoproteina E2 CSFV eksponowana na powierzchni nanoklatek ferrytyny indukowała silną ekspresję wrodzonych cytokin odpornościowych IL-4 i IFN- u królików [31]. Udowodniono również, że szczepionka nanocząstkowa opracowana poprzez kowalencyjne wiązanie samoorganizującej się ferrytyny z domeną wiążącą receptor (RBD) wirusa SARS-CoV-2 wywołuje silną humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną [24]. Jama nosowa jest bogata w tkankę limfatyczną związaną z błoną śluzową i wykazaliśmy, że poziomy SIgA indukowane przez E2Ft immunizowanych przez błonę śluzową były wyższe niż w przypadku E2 (p < 0.05). Liczba limfocytów T CD4+ i CD8+ była znacząco wyższa w grupie E2Ft immunizowanej błoną śluzową niż w grupie E2 (p < 0,01). Limfocyty T CD4+ i CD8+ odgrywają istotną rolę w obronie przed infekcją wirusową [32]. Wyniki testu neutralizacji i testu przeciwciał wykazały również, że immunizacja błony śluzowej E2Ft była skuteczniejsza niż immunizacja domięśniowymi E2Ft i E2. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że system rozpoznawania i prezentacji antygenu organizmu skutecznie fagocytuje ferrytynę (E2Ft) za pomocą 24 polimerów podjednostek, co skutkuje czułą i skuteczną odpowiedzią przeciwciał in vivo. Przeciwciała są wydzielane przez komórki plazmatyczne, a poziom przeciwciał neutralizujących jest ważnym wskaźnikiem wykrywania skutków immunologicznych. Gdy siła działania przeciwciał neutralizujących szczepionki BVDV jest większa niż 1:24, oznacza to, że szczepionka jest immunogenna [33].

W tym badaniu przeprowadzono testy neutralizacji w celu oceny poziomów przeciwciał neutralizujących indukowanych przez rekombinowane białka E2. W związku z tym pobierano krew żylną szyjną immunizowanych cieląt w celu określenia poziomu przeciwciał IgG w surowicy. Wyniki pokazały, że wszystkie immunizowane cielęta wytwarzały różny stopień przeciwciał neutralizujących 14 dni po drugiej immunizacji. Poziom przeciwciał neutralizujących u cieląt w grupie immunizowanej błoną śluzową E2Fc i w grupie szczepionki inaktywowanej wzrósł znacząco i utrzymywał się na poziomie 1:64 po 14 dniach po trzeciej immunizacji (miana przeciwciał neutralizujących wykrywano aż do szóstego tygodnia). Warto jednak zauważyć, że poziomy przeciwciał neutralizujących w grupach E2 i E2Ft immunizowanych błoną śluzową oraz E2Fc i E2Ft immunizowanych domięśniowo utrzymywały się w zakresie od 1:8 do 1:16. Wnioskujemy, że antygeny rekombinowanej szczepionki E2Fc są powoli uwalniane przez receptor Fc, powodując w ten sposób przedłużoną humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną. W przeciwieństwie do pozostałych czterech szczepionek podjednostkowych, które wkrótce pozostają w organizmie z powodu braku odpowiedniego receptora. Dlatego w celu uzyskania oczekiwanych efektów immunologicznych może być konieczna szczepionka przypominająca lub zmiana adiuwantu.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

4. Materiały i metody

4.1. Wirus i komórki

Szczep BVDV XZ02 typu 1b (numer dostępu GenBank: MF278652) wyizolowano z Tybetu i hodowano przy użyciu bydlęcych komórek nerkowych Madin-Darby (MDBK). W naszym laboratorium zakonserwowano wirusa epidemicznej biegunki świń (PEDV). Komórki MDBK zakupiono od ATCC (ATCC-CCL-22) i utrzymywano w DMEM (nr kat. SH302403.01, HyClone, Szanghaj, Chiny), a bydlęce komórki makrofagów pęcherzykowych (BAM) utrzymywano w RPMI{ {8}} (nr kat. SH30027, Cytiva, Szanghaj, Chiny); wszystkie pożywki zawierały 10% inaktywowanej termicznie surowicy końskiej (nr kat. 16050122, Gibco, Carlsbad, Kalifornia, USA) i inkubowano w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2. Zawieszone komórki HEK293 zakupiono od ATCC (ATCC CRL-1573) i hodowano w wolnej od surowicy pożywce KOP293 (nr kat. M21201121A, KAIRUI-biotech, Zhuhai, Chiny).

4.2. Przeciwciała i zestawy testowe

W tym badaniu zastosowano następujące przeciwciała i zestawy testowe: przeciwciało anty-BVDV E2 (nr kat. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Wielka Brytania); Kozie przeciwciało antymysie HRP (nr kat. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-kozie przeciwciało przeciw mysim (nr kat. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA); FITC-kozie przeciwciało przeciw mysim (nr kat. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); przeciwciało CD64 (Fc RI) (nr kat. abs135850, Absin, Szanghaj, Chiny); Kozie przeciwciało przeciwko mysim IgG Alexa Fluor® 488 (nr kat. ab150113, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania); Cy3-kozie przeciwciało przeciw króliczej IgG (nr kat. ab6939, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania); mikrosfery sprzężone z FITC (nr kat. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA); przeciwciało FITC-CD4 (nr kat. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, Kalifornia, USA); przeciwciało PE-CD8 (nr kat. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN-przeciwciało (nr kat. MCA1783A, BIORAD, Hercules, Kalifornia, USA); FITC-kozie przeciwciało przeciw króliczej IgG (nr kat. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Zestawy i odczynniki obejmują zestaw do wykrywania przeciwciał BVDV-E2 (nr kat. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Szanghaj, Chiny); Zestaw do wykrywania IgA (nr kat. 177090b, CAMILO, Nanjing, Chiny); Zestaw do wykrywania SIgA (nr kat. 177053b, CAMILO, Nanjing, Chiny); Zestaw do wykrywania IFN (nr kat. 177020b, CAMILO, Nanjing, Chiny); Zestaw do wykrywania IL-2 (nr kat. 177028b, CAMILO, Nanjing, Chiny); Zestaw do wykrywania IL-4 (nr kat. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Chiny); Odczynnik do transfekcji TA-293 (nr kat. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Chiny); Podłoże do separacji limfocytów (nr kat. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).

4.3. Konstrukcja plazmidów

Skrócony E2 (oznaczony dalej jako E2) wygenerowano poprzez usunięcie regionu transbłonowego E2 (numer dostępu sekwencji genu: MF278652) przy użyciu narzędzia internetowego TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ dostęp 12 styczeń 2023) i dodanie znacznika histydynowego do C-końca (Rysunek 1A). Sekwencja genu jest pokazana w materiale uzupełniającym S1. Plazmid E2Fc skonstruowano przez dodanie fragmentu Fc zawierającego region zawiasowy bydlęcej IgG1 (numer dostępu: x62916.1) do C-końca E2 z pozycją porządkową regionu zawiasowego E2-syntetycznego elastycznego peptydu -CH2-domena CH3-6 × His [20]. Sekwencja genu jest pokazana w materiale dodatkowym S2. Plazmid E2Ft skonstruowano poprzez połączenie E2 z ferrytyną Helicobacter pylori (reszty 5–167) poprzez łącznik (Gly)3Ser [34]. Sekwencja genu jest pokazana w materiale dodatkowym S3. Peptyd sygnałowy IL-2 dodano do N-końca E2, E2Fc i E2Ft, aby ułatwić ekspresję wydzielniczą [35]. Docelowe geny (E2, E2Ft i E2Fc) sklonowano do pcDNA3.1 odpowiednio za pomocą BamHI i XhoI.

4.4. Ekspresja i oczyszczanie białek

Około 10{{30}} mL zawieszonych komórek HEK293 w stadium wykładniczym (około 2~4 × 106 komórek/ml) transfekowano odpowiednimi plazmidami. W skrócie, 5 ml KPM (bufor do transfekcji) i 100 µg sterylnego plazmidowego DNA dodano do sterylnej probówki wirówkowej, a następnie 5 ml KPM i 500 µl TA-293 (nr kat. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Chiny ) odczynniki do transfekcji dodano do innej sterylnej probówki wirówkowej. Następnie do rozcieńczonego plazmidu dodano rozcieńczony odczynnik do transfekcji i dokładnie wymieszano. Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej, do komórek dodano kompleks odczynnika do transfekcji DNA i całość wytrząsano. Komórki inkubowano w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO2 przy szybkości wytrząsania 140 obr./min. Komórki zebrano sześć dni po transfekcji przez wirowanie przez 30 minut przy 12000 obr/min/min i przesączono przez filtr 0,22 mm w celu usunięcia resztek komórek. Kolumny do chromatografii powinowactwa z niklem (nr kat. 17531801, GE, Boston, MA, USA) wykorzystano do oczyszczania białek E2, E2Ft i E2Fc ze znacznikiem histydynowym (His) [36]. W skrócie, 100 ml próbki dodano do kolumn powinowactwa z szybkością 1 ml/min. Kolumny następnie przemyto pięcioma objętościami kolumny (CV) buforu A (0,1 M PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) z szybkością 1 ml/min. Na koniec pozwolono, aby gradienty stężeń imidazolu (od 0 do 500 mM) przepływały przez kolumnę z szybkością 1 ml/min w celu zebrania cieczy odpowiadającej głównemu pikowi. Stężenia białek oznaczono ilościowo za pomocą zestawu do wykrywania białek BCA. Zebrane białka wykorzystano dalej do analizy Western blot.

cistanche roślina zwiększająca układ odpornościowy

4,5. Western Blot

Białka rozdzielono za pomocą SDS-PAGE. Po przeniesieniu na membranę filtra NC białka blokowano 2% odtłuszczonym mlekiem w proszku przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inkubowano z przeciwciałem anty-BVDV E2 (nr kat. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej . Po trzykrotnym przemyciu TBS-T membrany inkubowano z kozimi przeciwciałami przeciwko mysim HRP (nr kat. ab205719, Abcam, Cambridge, UK) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu TBS-T, zastosowano system chemiluminescencji ECL do wykrywania immunoekspresji białka.

4.6. Immunofluorescencja pośrednia

W celu immunofluorescencyjnego wykrywania immunoekspresji rekombinowanych białek komórki HEK293 transfekowano plazmidami wyrażającymi E2, E2Ft i E2Fc; 48 godzin po transfekcji komórki utrwalono paraformaldehydem przez 15 minut. Po trzykrotnym przemyciu PBS komórki permeabilizowano za pomocą 0,5% Trition-X100 przez 15 minut. Po intensywnym przemyciu PBS komórki następnie blokowano 2% BSA i inkubowano z przeciwciałem monoklonalnym BVDV E2 rozcieńczonym 1:500 (przygotowanym w naszym laboratorium) w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano Cy3 (nr kat. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) lub kozie przeciwciała antymysie skoniugowane z FITC (nr kat. ab150117, Abcam, Cambridge, UK). Jądra barwiono DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Białka wizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Niemcy) [37].

4.7. Celowanie w APC w rekombinowane białko fuzyjne E2Fc

Przeprowadzono analizę kolokalizacji immunofluorescencyjnej w celu potwierdzenia wiązania białka fuzyjnego BVDV-E2Fc z Fc RI na bydlęcych makrofagach pęcherzykowych (BAM). W skrócie, 3 µg oczyszczonego E2, E2Ft lub E2Fc dodano do bydlęcych makrofagów pęcherzykowych. Po inkubacji przez 12 godzin w temperaturze 37°C, komórki przemyto 0,1% BSA w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i utrwalono mieszaniną metanol/aceton (1:1) w temperaturze 20 ◦ C. Komórki następnie permeabilizowano 0,5% Trition-X100 przez 15 minut i blokowano 2% BSA w 37°C przez 2 godziny. Następnie komórki przemyto trzykrotnie PBS i inkubowano z przeciwciałem monoklonalnym BVDV E2 (źródło mysie; przygotowane w naszym laboratorium) i bydlęcym przeciwciałem poliklonalnym CD64 (Fc RI) (nr kat. abs135850, Absin, Szanghaj, Chiny) przez 2 H. Komórki przemyto trzykrotnie PBS i pokryto kozim przeciwciałem przeciwko mysim IgG Alexa Fluor® 488 (nr kat. ab150113, Abcam, Cambridge, UK) i znakowanym Cy3- kozim przeciwciałem przeciwko króliczym IgG (nr kat. ab6939, Abcam, Cambridge, UK) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jądra barwiono DAPI. Obrazy sfotografowano przy użyciu kolokalizacji immunofluorescencyjnej (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Niemcy).

4.8. Określanie szybkości fagocytarnej bydlęcych makrofagów pęcherzykowych

Aby określić wpływ rekombinowanych białek E2, E2Ft i E2Fc na fagocytozę bydlęcych makrofagów pęcherzykowych (BAM), bydlęce makrofagi pęcherzykowe w stężeniu 1 × 106 komórek/ml inkubowano wstępnie z rekombinowanymi białkami E2, E2Ft lub E2Fc (wszystkie stężenia doprowadzono do 350 ng/ml) przez 4 godziny. Po trzykrotnym przemyciu PBS, do każdej studzienki dodano 10 µl mikrosfer sprzężonych z FITC (nr kat. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) i 990 µl pożywki RPMI-1640 . Po 2 godzinach inkubacji komórki przemyto PBS w celu usunięcia pozakomórkowych mikrosfer sprzężonych z FITC. Przylegające makrofagi trawiono trypsyną (Gibco) zawierającą 0,05% EDTA, a trawienie kończono po pełnym trawieniu pożywką pełną 1640. Komórki następnie dodano do górnej warstwy 10 ml PBS z 0,45 g glukozy i 0,3 g BSA, a następnie wirowano w gradiencie przy 400 x g przez 10 minut. Oddzielone komórki przemyto dwukrotnie PBS i ponownie zawieszono w 800 µl PBS. Intensywność fluorescencji przy 488 nm oznaczono za pomocą cytometru przepływowego Beckman (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, Kalifornia, USA).

4.9. Przygotowanie szczepionki i procedura szczepień

E2, E2Ft i E2Fc wyrażane w HEK{{0}}E2, E2Ft i E2Fc emulgowano z adiuwantem IMS 1313VG (Seppic, Francja) w równych proporcjach do końcowego stężenia białka wynoszącego 200 µg/ml i przechowywano w temperaturze 4°C po zakończeniu kontrola jakości. Nie stwierdzono przeciwciał BVDV-E0 i BVDV-E2 (nr kat. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny) 3-miesięczne cielęta (n=35) podzieleni na siedem równych grup. Cielęta w czterech grupach immunizowano przez błonę śluzową nosa (in) odpowiednio PBS, E2, E2Ft i E2Fc. Cielakom w pozostałych trzech grupach wstrzyknięto domięśniowo (im) szczepionki inaktywowane E2Ft, E2Fc i BVDV jako kontrolę pozytywną (nr kat. 202002003, Huaweit, Jiangsu, Chiny). Cielęta szczepiono w 1., 21. i 35. dniu doświadczenia i każdemu cielęciu zaszczepiono 1 ml szczepionki o stężeniu białka 200 µg/ml. Krew pobierano od cieląt w 1., 21., 35. i 49. dniu doświadczenia pod kątem innych wskaźników (ryc. 3A). Wszystkie protokoły eksperymentów zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań Naukowych Wyższej Szkoły Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Rolniczego Huazhong w Hubei w Chinach (nr HZAUCA-2022-0011).

4.10. Produkcja IgA w kale i surowicy

Wymazy z nosa, kał i próbki surowicy cieląt pobrano 14 dnia po wtórnej immunizacji. Świeże krowie odchody rozcieńczono w 15% zawiesinie kału w PBS, zawiesinę odwirowano przy 18,000 x g w 4°C przez 30 minut, a supernatant zebrano do późniejszego użycia. Wymazy z nosa pobierano poprzez obracanie sterylnego wacika w głąb jamy nosowej krowy przez 6–8 obrotów. Wymazy umieszczono w probówce PBS zawierającej 1% penicyliny ze streptomycyną i dokładnie wymieszano. Próbki wirowano przy 18,000× g w temperaturze 4°C przez 10 minut, a supernatant zbierano do późniejszego wykorzystania. Próbki krwi bydlęcej pobrano za pomocą probówki z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA)--zawierającej antykoagulant, a próbki surowicy uzyskano poprzez odwirowanie próbek krwi w temperaturze 4°C i przy 400 g przez 5 minut. IgA (nr kat. 177090b, CAMILO, Nanjing, Chiny) i SIgA wykryto za pomocą zestawu ELISA (nr kat. 177053b CAMILO, Nanjing, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta.

4.11. Analiza cytometrii przepływowej

Częstotliwość występowania IFN- -wytwarzających CD3+ CD4+ i limfocytów T CD3+ CD8+ wśród limfocytów CD3+ we krwi wynosiła analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki pobrano 14 dni po szczepieniu przypominającym [36]. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) ponownie zawieszono i rozcieńczono do 1 × 106 komórek/ml pełną pożywką RPMI-1640, stymulowano inaktywowanym promieniowaniem UV BVDV XZ02 (MOI=0.1) i inkubowano w temperaturze 37°C ◦C z 5% CO2 przez 72 godz. Jako kontrolę pozytywną zastosowano konkanawalinę A (Con A) (5 µg/ml; Sigma). Do wszystkich próbek na 12 godzin przed zebraniem komórek dodano inhibitor transportu białka brefeldynę A (BFA, 3 µg/ml, eBioscience) w celu zablokowania wydzielania IFN. Ilość 200 µl komórek przeniesiono do probówek FCM i wybarwiono przeciwciałem CD4 znakowanym FITC (nr kat. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, Kalifornia, USA) przez 30 minut w temperaturze 4°C w ciemności. Po trzykrotnym przemyciu PBS komórki inkubowano z przeciwciałem CD8 znakowanym R-PE (nr kat. MCA837, BIO-RAD, Hercules, Kalifornia, USA). Po trzykrotnym przemyciu komórki inkubowano z mysim przeciwciałem przeciwko bydlęcemu IFN (nr kat. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, Kalifornia, USA) przez 20 minut w ciemności w celu wybarwienia cytokin wewnątrzkomórkowych. Po przemyciu komórki ponownie zawieszono w PBS zawierającym 1% FBS. Cytometrię przepływową przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego FACS Caliber (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA), a dane zebrano i przeanalizowano w sposób opisany wcześniej [38].

4.12. Proliferacja limfocytów i wykrywanie cytokin

Antykoagulowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) każdego cielęcia wyizolowano przy użyciu podłoża do separacji limfocytów (nr kat. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA) w 49 dniu po immunizacji. Limfocyty bydlęcej krwi obwodowej rozcieńczono 10% pożywką FBS 1640 do 1 x 106 komórek/ml. Następnie do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodano 100 µl rozcieńczonych komórek i stymulowano odpowiednio BVDV inaktywowanym promieniami UV, konkanawaliną (kontrola pozytywna) lub pożywką hodowlaną (kontrola ujemna). Po 72 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C z 5% CO2, do każdej studzienki dodano 30 µl MTS i hodowlę komórek kontynuowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, zgodnie z instrukcjami producenta. Absorbancję przy 492 nm mierzono za pomocą automatycznego analizatora mikropłytek. Miano proliferacji limfocytów w każdej próbce określono za pomocą wskaźnika stymulacji (SI). Obliczono SI=(OD próbki-OD ślepej kontroli)/(OD ujemnej próbki-OD ślepej kontroli) [39]. Interferon (IFN)-, interleukina (IL)-2 i interleukina (IL)-4 wykryto przy użyciu zestawów ELISA. W skrócie, PBMC wyizolowano i rozcieńczono do 4 x 106 komórek/ml pożywką RPMI 1640 zawierającą 10% FBS i umieszczono w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej. Komórki stymulowano inaktywowanym BVDV XZ02 (MOI=1) przez 48 godzin w 37°C, a następnie zbierano supernatant. IFN- (nr kat. 177020b, CAMILO, Nanjing, Chiny), IL-2 (nr kat. 177028b, CAMILO, Nanjing, Chiny) i IL-4 (nr kat. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Chiny) wykrywano przy użyciu odpowiednich zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Zawartość IFN-, IL-2 i IL-4 w próbce obliczono przy użyciu krzywej standardowej.

4.13. Testy serologiczne

W celu wykrycia przeciwciał E2/E0 od każdego cielęcia pobierano próbki krwi w 0, 21, 35 i 49 dniach po immunizacji. Próbki surowicy zebrano poprzez odwirowanie próbek krwi przy 1000 x g przez 20 minut. Próbki surowicy przetwarzano zgodnie z wymaganiami zestawu do wykrywania przeciwciał BVDV E2 (nr kat. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny). Mikropłytki opłaszczone antygenem BVBV E2 równoważono przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do mikropłytki dodano odpowiednio 50 µl kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej i próbek surowicy. Następnie do mikropłytki dodano 50 µl przeciwciała wykrywającego znakowanego peroksydazą chrzanową (HRP) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po pięciokrotnym przemyciu buforem do przemywania dodano roztwór chromogenny w celu zmierzenia absorbancji czytnika mikropłytek przy 450 nm w celu określenia poziomu przeciwciała E2 w każdej immunizowanej grupie. Do wykrywania poziomu przeciwciał neutralizujących w próbkach surowicy zastosowano metodę surowicy z utrwalonym rozcieńczeniem wirusa. W skrócie, próbki całkowicie inaktywowanej surowicy odpornościowej rozcieńczono 2-1 do 2-12 i do płytek 96-dołkowych dodano 50 µl surowicy przy każdym mianie rozcieńczenia. Następnie do każdej studzienki dodano 50 µl rozcieńczonego roztworu wirusa zawierającego wirusa 200 TCID50- BVDV XZ02. Płytki delikatnie wytrząsano i mieszano. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37°C, komórki MDBK o stężeniu 5 x 105 komórek/ml dodano do płytek z dołkami 96- i inkubowano w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 przez 72 godziny. Aby wykryć neutralizujący efekt próbek surowicy, komórki traktowano przeciwciałem specyficznym dla E2- jako przeciwciałem głównym (nr kat. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Wielka Brytania) i kozim anty-króliczym IgG skoniugowanym z FITC jako przeciwciałem wtórnym przeciwciało (nr kat. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Typowy zielony sygnał fluorescencyjny wskazywał na brak neutralizacji. Zdjęcia wykonano pod mikroskopem fluorescencyjnym (TE2000, Nikon, Tokio, Japonia). Miano neutralizacji surowicy obliczono według metody Reeda-Muencha, a jako miano neutralizacji surowicy określono maksymalne rozcieńczenie surowicy, które mogłoby całkowicie zahamować fluorescencję.

4.14. Wykrywanie swoistości przeciwciała monoklonalnego BVDV E2

Najpierw przeprowadzono testy przedabsorpcji przeciwciała monoklonalnego BVDV E2, a następnie testy replikacji wirusa i analizę Western w celu potwierdzenia specyficzności mAb BVDV E2. Do testu replikacji wirusa, 400 TCID50 BVDV inkubowano wstępnie z PBS i 100 µg lub 200 µg mAb E2 w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, odpowiednio. Po inkubacji, wstępnie traktowanym wirusem BVDV zaszczepiono komórki MDBK i komórki hodowano w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze. Komórki zebrano przy 18 lub 24 hpi (godzina po zakażeniu) i RNA ekstrahowano odczynnikiem TRIZOL. Przeprowadzono RT-qPCR w celu określenia względnej ekspresji genu E2 wirusa BVDV. Do testu Western blot mAb E2 inkubowano wstępnie z Tween20, białkiem PEDV S lub białkiem E2 BVDV w TBS-T przez 2 godziny, odpowiednio, w temperaturze 4°C. Wstępnie traktowane mAb E2 poddano testowi Western blot jako przeciwciało pierwszorzędowe do wykrycia reakcji na białko E2 lub PEDV S BVDV.

4.15. Analiza statystyczna

Do wszystkich analiz wykorzystano program statystyczny GraphPad Prism. Do analizy danych i uzyskania wartości p (*, p < 0.05; **, p < 0 wykorzystano dwustronny test t dla niesparowanych partnerów.{{ 8}}1; ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). O ile nie zaznaczono inaczej, dane przedstawiono jako średnią ± SD.

5. Wnioski

W naszym badaniu wyrażono trzy rekombinowane białka, BVDV-E2, BVDV-E2Ft i BVDV-E2Fc, i wygenerowano odpowiednie szczepionki podjednostkowe. Badania in vivo wykazały, że szczepionka podjednostkowa E2Fc była skuteczniejsza niż E2Ft i E2, zarówno w immunizacji śluzówkowej, jak i domięśniowej. Potwierdziliśmy, że miana przeciwciał neutralizujących indukowane przez immunizowane błoną śluzową E2Fc i E2Ft wynosiły odpowiednio 1:64 i 1:16, co dodatkowo wskazuje, że E2Fc wiązał się z Fc RI na bydlęcych makrofagach pęcherzykowych, aby osiągnąć transport przezśluzówkowy. Szczepienie śluzówkowe multiwalentną szczepionką podjednostkową E2Fc głównego szczepu epidemicznego BVDV znacząco poprawiło działanie immunologiczne i nadaje się do praktycznego zastosowania. Nasze badanie dostarcza rozwiązania dla czasochłonnych i pracochłonnych konwencjonalnych szczepień poprzez zastosowanie szczepionki śluzówkowej. Białko E2 wirusa BVDV jest idealnym celem dla neutralizacji przeciwciał i oczekuje się, że białka fuzyjne E2Fc i E2Ft skonstruowane w tym badaniu będą dalej stosowane jako bezpieczne i skuteczne szczepionki podjednostkowe przeciwko zakażeniu BVDV.

Bibliografia

1. Truyers, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Program zwalczania wirusa wirusowej biegunki bydła na Orkadach 2001–2008. Wet. Rekomendacja 2010, 167, 566–570. [Odniesienie]

2. Peterhans, E.; Schweizer, M. BVDV: Pestiwirus wywołujący tolerancję wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Biologia 2013, 41, 39–51. [Odniesienie]

3. Zhong, F.; Li, N.; Huang, X.; Guo, Y.; Chen, H.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Typowanie genetyczne i obserwacja epidemiologiczna wirusa wirusowej biegunki bydła w zachodnich Chinach. Geny wirusów 2011, 42, 204–207. [Odniesienie]

4. Deng, Y.; Shan, Teksas; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Charakterystyka genomowa izolatu wirusa wirusowej biegunki bydła 1 pochodzącego od świń. Łuk. Wirol. 2014, 159, 2513–2517. [CrossRef] [PubMed]

5. Deng, Y.; Słońce, dowódca; Cao, SJ; Lin, T.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai,SL; Huang, L.; Shan, Teksas; Zheng, H.; i in. Wysoka częstość występowania wirusa wirusowej biegunki bydła 1 w chińskich stadach świń. Weterynarz. Mikrobiol. 2012, 159, 490–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, L.; Wu, X.; Wang, C.; Piosenka, C.; Bao, J.; Du, J. Pochodzenie i przenoszenie wirusa wirusowej biegunki bydła typu 1 w Chinach ujawnione na podstawie analizy filodynamicznej. Rozdzielczość Weterynarz. Nauka. 2020, 128, 162–169. [CrossRef] [PubMed]

7. Tautz, N.; Tews, BA; Meyers, G. Biologia molekularna pestiwirusów. Adw. Rozdzielczość wirusa 2015, 93, 47–160.

8. Becher, P.; Tautz, N. Rekombinacja RNA w pestiwirusach: Komórkowe sekwencje RNA w genomach wirusowych podkreślają rolę czynników gospodarza w utrzymywaniu się wirusa i śmiertelnej chorobie. Biol RNA. 2011, 8, 216–224. [Odniesienie]

9. Li, Y.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Y. Struktura krystaliczna glikoproteiny E2 z wirusa wirusowej biegunki bydła. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 2013, 110, 6805–6810. [Odniesienie]

10. Williams, LBA; Fry, LM; Herndon, Dr.; Franceschi, V.; Schneider, Da; Donofrio, G.; Knowles, DP Rekombinowana szczepionka wektorowa z bydlęcym wirusem opryszczki-4 podawana poprzez nebulizację donosową wywołuje u bydła miano przeciwciał neutralizujących wirusa. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [Odniesienie]

11. Ainai, A.; van Riet, E.; Ito, R.; Ikeda, K.; Senchi, K.; Suzuki, T.; Tamura, SI; Asanuma, H.; Odagiri, T.; Tashiro, M.; i in. Ludzka odpowiedź immunologiczna wywołana przez donosową inaktywowaną szczepionkę przeciw grypie H5. Mikrobiol. Immunol. 2020, 64, 313–325. [CrossRef] [PubMed]

12. Kang, H.; Yan, M.; Yu, Q.; Yang, Q. Charakterystyka tkanki limfatycznej związanej z nosem (NALT) i zdolność wchłaniania nosa u kurczaków. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]

13. Tak, L.; Zeng, R.; Bai, Y.; Roopenian, DC; Zhu, X. Skuteczne szczepienie błony śluzowej za pośrednictwem noworodkowego receptora Fc. Nat. Biotechnologia. 2011, 29, 158–163. [CrossRef] [PubMed]

14. Pabst, R. Szczepienie śluzówkowe drogą donosową. Tkanka limfatyczna związana z nosem (NALT) - struktura, funkcja i różnice gatunkowe. Szczepionka 2015, 33, 4406–4413. [Odniesienie]

15. Zhang, Y.; Zhou, Z.; Zhu,SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, ŁK; Wang, W.; Xiao, G. Nowatorska szczepionka z białkiem fuzyjnym RSV F-Fc zmniejsza uszkodzenie płuc wywołane infekcją syncytialnym wirusem oddechowym. Antywirus. Rozdzielczość 2019, 165, 11–22. [Odniesienie]

16. Wiedinger K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Wyniki specyficzne dla izotypu w celowaniu w receptor Fc gamma PspA przy użyciu białek fuzyjnych jako strategii szczepień przeciwko infekcji Streptococcus pneumoniae. Szczepionka 2020, 38, 5634–5646. [Odniesienie]

17. Czajkowski, DM; Hu, J.; Shao, Z.; Proszę, Białka fuzyjne RJ Fc: nowe osiągnięcia i perspektywy na przyszłość. EMBO Mol. Med. 2012, 4, 1015–1028. [Odniesienie]

18. Chen, X.; Zeng, F.; Huang, T.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Optymalizacja Fc w celu poprawy stabilności i odporności na agregację. Aktualny Farmacja. Biotechnologia. 2016, 17, 1353–1359. [Odniesienie]

19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Colaco, Kalifornia; Bailey, CR; Shelton, H.; Molesti, E.; Temperton, New Jersey; Barclay, WS; Jones, IM Szczepienie bez adiuwantu białkami fuzyjnymi hemaglutynina-Fc jako podejście do szczepionek przeciw grypie. J. Wirol. 2011, 85, 3010–3014. [Odniesienie]

20. Li, J.; Li, X.; Mam, H.; Ren, X.; Hao, G.; Zhang, H.; Zhao, Z.; Kieł, K.; Li, X.; Rong, Z.; i in. Skuteczne szczepienie błony śluzowej nowym wirusem klasycznego pomoru świń E2-białkiem fuzyjnym Fc, w którym pośredniczy noworodkowy receptor Fc. Szczepionka 2020, 38, 4574–4583. [Odniesienie]

21. Zhen, Z.; Tang, W.; Todd, T.; Xie, J. Ferritins jako nanoplatformy do obrazowania i dostarczania leków. Opinia eksperta. Lek dostarczany. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]

22. Lopez-Sagaseta, J.; Malito, E.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Samoorganizujące się nanocząstki białkowe w projektowaniu szczepionek. Oblicz. Struktura. Biotechnologia. J. 2016, 14, 58–68. [CrossRef] [PubMed]

23. Jacob, SI; Khogeer, B.; Bampos, N.; Sheppard, T.; Schwartz, R.; Lowe, CR Rozwój i zastosowanie syntetycznych ligandów powinowactwa do oczyszczania antygenów grypy na bazie ferrytyny. Biokoniugat Chem. 2017, 28, 1931–1943. [CrossRef] [PubMed]

24. Ma, X.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Y.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Deng, J.; Chen, T.; Piosenka, Z.; i in. Szczepionki nanocząstkowe oparte na domenie wiążącej receptor (RBD) i powtórzeniach heptadowych (HR) wirusa SARS-CoV-2 wywołują silną ochronną odpowiedź immunologiczną. Immunitet 2020, 53, 1315–1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]

25. Benedictus, L.; Bell, CR Ryzyko stosowania allogenicznych linii komórkowych do produkcji szczepionek: przykład noworodkowej pancytopenii bydła. Ekspert ks. Szczepionki 2017, 16, 65–71. [Odniesienie]

26. Pecora, A.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, MR; Odeon, A.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Filippi, JL; Dus Santos, MJ; i in. Bezpieczeństwo i skuteczność szczepionki z podjednostkami glikoproteiny E2 wytwarzanej w komórkach ssaków w celu zapobiegania eksperymentalnemu zakażeniu bydła wirusem wirusowej biegunki bydła u bydła. Weterynarz. Rozdzielczość komuna. 2012, 36, 157–164. [Odniesienie]

27. Thomas, C.; Młody, New Jersey; Heaney, J.; Collins, ja; Brownlie, J. Ocena skuteczności kandydatów na szczepionki z podjednostkami E2 ssaków i bakulowirusów przeciwko wirusowi wirusowej biegunki bydła. Szczepionka 2009, 27, 2387–2393. [Odniesienie]

28. Arena, Tajlandia; Szkody, PD; Wong, AW Wysokoprzepustowa transfekcja komórek HEK293 w celu przejściowej produkcji białka. Metody Mol. Biol. 2018, 1850, 179–187.

29. Venereo-Sanchez, A.; Gilberta, R.; Simoneau, M.; Caron, A.; Chahal, P.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, X.; Henryk, O.; Kamen, A. Hemaglutynina i neuraminidaza zawierające cząstki wirusopodobne wytwarzane w hodowli zawiesinowej HEK-293: skuteczny kandydat na szczepionkę przeciw grypie. Szczepionka 2016, 34, 3371–3380. [Odniesienie]

30. Yan, Y.; Li, X.; Wang, A.; Zhang, G. Klonowanie molekularne i identyfikacja pełnej długości cDNA kodującego receptor Fc o wysokim powinowactwie dla bydlęcej IgG (Fc gamma RI). Weterynarz. Immunol. Immunopatol. 2000, 75, 151–159. [Odniesienie]

31. Zhao, Z.; Chen, X.; Chen, Y.; Li, H.; Kieł, K.; Chen, H.; Li, X.; Qian, P. Samoorganizująca się nanoplatforma ferrytynowa do projektowania klasycznej szczepionki przeciw pomorowi świń: wytwarzanie silnego przeciwciała neutralizującego. Szczepionki 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Chen, MÓJ; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, Kolorado; i in. Szczepienie donosowe samym rekombinowanym antygenem i białkiem fuzyjnym FLIPr indukuje długotrwałą ogólnoustrojową odpowiedź przeciwciał i szeroką odpowiedź komórek T. Przód. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Acosta, M.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. Nowatorska szczepionka podjednostkowa BVDV ukierunkowana na MHC-II indukuje neutralizującą odpowiedź immunologiczną u świnek morskich i bydła. Transgraniczny. Pojawienie się. Dis. 2021, 68, 3474–3481. [CrossRef] [PubMed]

34. Ma, H.; Li, X.; Li, J.; Zhao, Z.; Zhang, H.; Hao, G.; Chen, H.; Qian, P. Szczepienie rekombinowaną fuzją zmodyfikowanego wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń GP5 i ferrytyną wywołuje zwiększoną odporność ochronną u świń. Wirusologia 2021, 552, 112–120. [CrossRef] [PubMed]

35. Nyon, poseł; Du, L.; Tseng, CK; Seid, Kalifornia; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Tai, W.; i in. Zaprojektowanie stabilnej linii komórkowej CHO do ekspresji antygenu szczepionkowego wirusa MERS. Szczepionka 2018, 36, 1853–1862. [Odniesienie]

36. Bellini, M.; Riva, B.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Kolombo, M.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; i in. Zaprojektowane nanocząsteczki ferrytyny do śledzenia bioluminescencji dostarczania nanoleków w leczeniu raka. Mały 2020, 16, e2001450. [Odniesienie]

37. Zhang, H.; Li, X.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. Glikoproteina E2 wirusa klasycznego pomoru świń wyrażana przez bakulowirusa indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną u królików. Szczepionka 2014, 32, 6607–6613. [Odniesienie]

38. Yuan, L.; Wen, K.; Azevedo, MS; Gonzalez, AM; Zhang, W.; Saif, LJ Specyficzna dla wirusa odpowiedź jelitowych komórek T wytwarzających IFN-gamma indukowana zakażeniem ludzkim rotawirusem i szczepionkami jest powiązana z ochroną przed biegunką rotawirusową u świń gnotobiotycznych. Szczepionka 2008, 26, 3322–3331. [Odniesienie]

39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, J.B.; Li, SB; Huang, Los Angeles; Liu, CM Wzmocniona ochronna odpowiedź immunologiczna na szczepionkę podjednostkową PCV2 poprzez jednoczesne podawanie myszom rekombinowanego świńskiego IFN-gamma. Szczepionka 2013, 31, 833–838. [Odniesienie]