Inhibitor farnezylotransferazy LNK-754 osłabia dystrofię aksonów i zmniejsza patologię amyloidu u myszy Część 3

Wyniki

Zmniejszone obciążenie płytkami amyloidowymi i hiperfosforylacja tau w mózgach myszy LNK-754-przewlekle leczonych 5XFAD

LNK-754 i lonafarnib to drobnocząsteczkowe FTI, które były wcześniej testowane na ludziach w badaniach klinicznych nad nowotworami i wiadomo, że przenikają przez barierę krew-mózg [8, 9, 41, 42]. -synukleina [8] i inkluzje tau [9] są redukowane odpowiednio przez LNK-754 i lonafarnib, ale nie zostały one jeszcze ocenione pod kątem fenotypu amyloidu w AD. W tym badaniu zbadaliśmy ich wpływ na patologię amyloidu w mysim modelu 5XFAD. U myszy 5XFAD rozwijają się złogi A począwszy od 2 miesiąca życia [36, 37], a dystroficzne neuryty obserwuje się na najwcześniejszych etapach odkładania amyloidu [39, 43].

Bariera krew-mózg i odporność to dwie bardzo ważne części ludzkiego ciała, które są ze sobą nierozerwalnie powiązane. Bariera krew-mózg to bariera ochronna pomiędzy mózgiem a krwią, która chroni mózg przed szkodliwymi substancjami z zewnątrz. Odporność jest ważnym mechanizmem umożliwiającym organizmowi ludzkiemu przeciwstawienie się chorobom. Jaki jest zatem konkretny związek pomiędzy barierą krew-mózg a odpornością?

Po pierwsze, bariera krew-mózg może zapobiegać przedostawaniu się niektórych szkodliwych bakterii i wirusów do mózgu, chroniąc w ten sposób mózg przed uszkodzeniem. Ponadto bariera krew-mózg może również kontrolować przepuszczalność niektórych substancji, umożliwiając im przedostawanie się do mózgu tylko w ograniczonym stopniu. Ma to kluczowe znaczenie dla ochrony zdrowia układu nerwowego, ponieważ zbyt duża ilość niektórych substancji wewnętrznych przedostających się do mózgu może spowodować uszkodzenie komórek nerwowych.

Jednocześnie odporność może również odgrywać rolę w ochronie mózgu. Układ odpornościowy człowieka potrafi rozpoznać patogeny i szkodliwe substancje, a następnie wytworzyć odpowiednie przeciwciała, które przeciwstawią się ich inwazji, chroniąc w ten sposób organizm przed chorobami. Jednakże, gdy określone patogeny lub substancje przekraczają barierę krew-mózg i dostają się do mózgu, układ odpornościowy reaguje szybko i wytwarza przeciwciała, które atakują i eliminują je.

Dlatego bariera krew-mózg i odporność odgrywają bardzo ważną rolę w utrzymaniu zdrowia człowieka. Bariera krew-mózg zapobiega przedostawaniu się szkodliwych substancji do mózgu, natomiast odporność usuwa patogeny i inne szkodliwe substancje, które omijają barierę krew-mózg i dostają się do mózgu. Obydwa współpracują ze sobą, aby zapewnić zdrowe funkcjonowanie mózgu.

Podsumowując, bariera krew-mózg i odporność współdziałają poprzez swoje odpowiednie mechanizmy, odgrywając ważną rolę w zdrowiu człowieka. Powinniśmy skupić się na ochronie ich zdrowia, aby zapewnić ogólny stan zdrowia organizmu. Widać, że musimy poprawić naszą pamięć. Cistanche desericola może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola to tradycyjny chiński materiał leczniczy o wielu unikalnych efektach, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność mięsa mielonego wynika z wielu zawartych w nim składników aktywnych, w tym kwasów, polisacharydów, flawonoidów itp. Składniki te mogą na różne sposoby promować zdrowie mózgu.

Kliknij Poznaj suplementy poprawiające pamięć

Dlatego też, aby zbiegać się z rozwojem patologii amyloidu u myszy 5XFAD, leczyliśmy myszy przewlekle przez 3 miesiące nośnikiem, LNK-754 i lonafarnibem, począwszy od 2 miesiąca życia. LNK-754 i lonafarnib rozpuszczano w nośniku zawierającym 0,5% karboksymetylocelulozy sodowej i wstrzykiwano ip codziennie w dawce 1 mg/kg [8, 44].

Najpierw staraliśmy się określić wpływ przewlekłego leczenia LNK-754 i lonafarnibem na obciążenie płytkami A u myszy 5XFAD za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej dla A 42, która wykrywa zarówno rozproszony, jak i zagregowany amyloid oraz czerwień tiazynowa (TR), która wykrywa tylko blaszki włókniste rdzenie (rys. 1A; rys. S1). Stwierdziliśmy znaczące zmniejszenie pokrycia obszaru w korowych obszarach mózgu myszy leczonych LNK754- w porównaniu z grupą kontrolną, której podawano nośnik (ryc. 1B). W hipokampie obszar pokryty był znacząco zmniejszony u myszy leczonych LNK-754- w porównaniu z myszami leczonymi lonafarnibem i występowała tendencja do zmniejszania się liczby myszy leczonych LNK-754 w porównaniu z myszami leczonymi podłożem (ryc. 1C).

Obszar pokryty 42 u myszy leczonych lonafarnibem nie różnił się znacząco od myszy leczonych nośnikiem ani w korze, ani w hipokampie (ryc. 1A, B). W wyniku leczenia LNK-754 w porównaniu z leczeniem nośnikiem zmniejszono wielkość płytek w obszarach korowych i hipokampowych mózgu; różnica ta była istotna statystycznie w hipokampie (ryc. 1D, E; ryc. S2A, B). Istotną różnicę w wielkości płytek pomiędzy leczeniem lonafarnibem a leczeniem LNK-754 zaobserwowano także w hipokampie (ryc. 1D, E; ryc. S2A, B).

Rozmiar łysinek nie zmienił się u myszy leczonych lonafarnibem w porównaniu z myszami leczonymi nośnikiem w obszarach kory mózgowej lub hipokampa (ryc. 1D, E; ryc. S2A, B). Wysiew łysinek oceniano ilościowo poprzez analizę liczby łysinek metodą barwienia TR. Liczba płytek znacząco spadła w korze, ale nie w hipokampie, LNK-754 w porównaniu z myszami leczonymi nośnikiem (ryc. S2C, D). Zmniejszone obciążenie płytkami potwierdzono przez pomiar A42 metodą ELISA w PBS i homogenatach półmózgowia rozpuszczalnych w guanidynie (ryc. 1F, G). Podobnie jak w przypadku naszych wyników mikroskopii immunofluorescencyjnej, zaobserwowano tendencję w kierunku mniejszej ilości A 42 we frakcjach guanidyny i PBS u myszy leczonych lonafarnibem, podczas gdy znacznie niższy poziom A 42 we frakcjach guanidyny uzyskano po leczeniu LNK-754 (ryc. 1. F, G).

Ponieważ w mysim modelu 5XFAD donoszono o wpływie płci na poziomy APP w stanie stacjonarnym i obciążenie płytkami nazębnymi [45, 46], przeprowadziliśmy immunobloty samców i samic myszy leczonych oddzielnie nośnikiem, LNK-754 lub lonafarnibem dla ekspresji transgenicznego APP (ryc. S3A). Poziomy transgenicznego APP mierzono za pomocą immunoblotu z przeciwciałem APP 6E10, które rozpoznaje tylko ludzki APP, i pozostały niezmienione u samców i samic myszy leczonych LNK-754, lonafarnibem lub podłożem (ryc. S3B-D). Drugą cechą charakterystyczną AD jest obecność hiperfosforylowanych wtrąceń tau w mózgu i wraz z odkładaniem się blaszek, endogenne mysie tau ulega hiperfosforylacji u myszy 5XFAD [47, 48].

Aby określić, czy leczenie FTI w mysim modelu amyloidu wpływa na hiperfosforylację tau, przeprowadzono analizę immunoblot dla fosfo-tau w serynie 404 (ryc. 1H; ryc. S3E), epitopie, o którym wiadomo, że jest hiperfosforylowany w mózgach AD i myszach 5XFAD [ 47, 49]. Tutaj stwierdziliśmy obniżony poziom fosfo-tau ser404 w mózgach myszy leczonych lonafarnibem i LNK-754 (ryc. 1I), podczas gdy całkowity poziom tau pozostał niezmieniony (ryc. 1J; ryc. S3F). W sumie nasze wyniki pokazują, że obciążenie płytkami amyloidowymi i patogenna fosforylacja tau są zmniejszone w mysim modelu 5XFAD w wyniku leczenia farmakologicznego FTI, chociaż leczenie LNK-754 było znacznie skuteczniejsze niż lonafarnibem.

Przewlekłe leczenie LNK‑754 hamuje farnezylację białek w mózgach myszy 5XFAD

Aby potwierdzić, że celowanie w FTazę za pomocą LNK-754 i lonafarnibu przez wstrzyknięcie ip hamuje farnezylację białek w mózgach myszy 5XFAD, oceniliśmy różne substraty FTazy i dalsze markery hamowania FTazy w homogenatach półmózgowia myszy 5XFAD przewlekle leczonych nośnikiem LNK -754 lub lonafarnib metodą immunoblotu. Najpierw przeanalizowaliśmy prelaminę A, która gromadzi się, gdy FTase jest hamowana [50]. Zaobserwowano wzrost poziomu prelaminy A w mózgach myszy leczonych LNK-754 w porównaniu z podłożem, podczas gdy u myszy leczonych lonafarnibem nie wystąpiły żadne zmiany (ryc. S4A, D). Następnie przyjrzeliśmy się HDJ-2, białku opiekuńczemu, które ulega przesunięciu mobilności w górę po leczeniu FTI i jest powszechnie stosowane jako marker hamowania FTazy [50]. Podobnie jak w przypadku prelaminy A, wolniej migrująca forma HDJ-2 była obecna u myszy leczonych LNK-754-, ale nie u myszy leczonych lonafarnibem (ryc. S4B, E). Znaczący wzrost liczby wolniej migrujących gatunków HDJ-2 stwierdzono u myszy LNK754 w porównaniu z myszami leczonymi nośnikiem lub lonafarnibem (ryc. S4E).

Ponadto farnezylacja aktywuje Ras, dlatego zmierzyliśmy także fosforylację jej dalszej cząsteczki efektorowej ERK1 (P44/P42) (ryc. S4C). Podczas gdy HDJ-2 i prelamina A pozostały niezmienione podczas leczenia lonafarnibem, zaobserwowano tendencję w kierunku zmniejszonego pERK1 (ryc. S4F). pERK1 był również obniżony u myszy leczonych LNK-754 (ryc. S4F). Nasze wyniki sugerują, że 1 mg/ kg LNK-754 hamowało FTazę w mózgu, jednakże lonafarnib był mniej skuteczny. Może to być spowodowane niższą siłą działania i IC50 lonafarnibu, jak wykazano wcześniej [41, 51], lub prawdopodobnie zmniejszoną ekspozycją mózgu.

Zmniejszona akumulacja LAMP1 w neurytach dystroficznych u myszy LNK-754 leczonych przewlekle 5XFAD

W zdrowych neuronach składniki lizosomalne są dostarczane do endosomów i organelli autofagicznych w dystalnych neurytach, które ulegają zakwaszeniu i dojrzewaniu podczas wstecznego przemieszczania się w kierunku somy neuronalnej [52, 53]. Płytki amyloidowe zakłócają ten proces, powodując dystroficzne neuryty, które zatrzymują dysfunkcyjne organelle autofagiczne i endolizosomalne.

Neuryty dystroficzne blokują transport aksonalny BACE1, co prowadzi do generacji A w neurytach dystroficznych i odkładania się blaszek zewnątrzkomórkowych [16–18]. Wiadomo, że FTI poprawiają funkcję lizosomów i stabilność mikrotubul, dlatego w celu dalszego zbadania, w jaki sposób FTI zmniejszają obciążenie płytkami nazębnymi, skupiliśmy się szczególnie na neurytach dystroficznych u myszy 5XFAD.

Aby określić ilościowo akumulację dystroficznych neurytów wokół płytek, oceniliśmy białko błonowe związane z lizosomami 1 (LAMP1), marker heterogennych organelli endolizosomalnych i autofagicznych. Tkanki mózgu hipokampa i kory mózgowej myszy 5XFAD leczonych nośnikiem, LNK-754 i lonafarnibem barwiono wspólnie pod kątem LAMP1 i A 42 i przeprowadzono konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną (ryc. 2A, B).
Ustalono próg umożliwiający eliminację sygnałów fluorescencji LAMP1 z pęcherzyków w zdrowych neurytach i somach w celu szczegółowej analizy neurytów dystroficznych. Obszar pokryty LAMP1 był znacząco zmniejszony w obszarach korowych i hipokampowych mózgu myszy leczonych LNK-754 (ryc. 2C, D), podczas gdy nie zaobserwowano żadnej różnicy u myszy leczonych lonafarnibem w porównaniu z myszami leczonymi nośnikiem (ryc. 2C, D). . Odkładanie się płytek amyloidowych inicjuje rozwój dystrofii w pobliskich neuronach, głównie aksonach i zakończeniach presynaptycznych.

Odpowiednio wpływ LNK-754 i lonafarnibu na neuryty dystroficzne jest zgodny z ich wpływem na obciążenie płytkami nazębnymi (ryc. 1). Dodatkową analizę wpływu leczenia FTI na neuryty dystroficzne przeprowadzono poprzez ilościowe określenie stosunku obszaru pokrytego LAMP1 do obszaru A42 w celu ustalenia, czy FTI ograniczają wielkość dystrofii wokół płytek. Zaobserwowano zmniejszenie stosunku LAMP1: A 42 u myszy leczonych LNK-754 w porównaniu z myszami otrzymującymi nośnik, a leczenie LNK-754 i lonafarnibem różniło się istotnie (ryc. 2E, F), co wskazuje, że LNK -754 myszy z mniejszą liczbą neurytów dystroficznych.
Podwyższone poziomy LAMP1 stwierdzono w homogenatach półmózgowia myszy leczonych LNK-754 lub lonafarnibem (ryc. S5A, B), co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że lonafarnib i LNK-754 zwiększają liczbę autolizosomów i poziom białek błonowych lizosomów i hydrolaz [8, 9]. Zgodnie z wynikami analizy immunoblot dla LAMP1 (ryc. S5A, B), średnia intensywność fluorescencji całkowitego barwienia immunologicznego LAMP1 była znacząco zwiększona w mózgach myszy leczonych LNK-754 i lonafarnibem w porównaniu z myszami leczonymi nośnikiem (ryc. S5C, D).

W przeciwieństwie do całkowitego poziomu fluorescencji LAMP1, średnia intensywność fluorescencji LAMP1 w neurytach dystroficznych pozostała niezmieniona pomiędzy myszami leczonymi nośnikiem, LNK-754 i lonafarnibem (ryc. S5E, F). W korze myszy leczonych LNK-754 intensywność fluorescencji LAMP1 w dystrofiach i obciążeniu płytkami nazębnymi była silnie skorelowana, podczas gdy nie stwierdzono korelacji między intensywnością LAMP1 w dystrofiach i obciążeniem płytkami nazębnymi u myszy leczonych lonafarnibem lub podłożem (ryc. 2G, H), ujawniając związek między akumulacją dystroficznych neurytów LAMP1 a obciążeniem płytkami nazębnymi u myszy LNK-754. W hipokampie zaobserwowano tendencję w kierunku korelacji między intensywnością LAMP1 w dystrofiach a obciążeniem płytkami. Łącznie nasze wyniki pokazują, że leczenie LNK-754 zwiększa całkowity poziom LAMP1, a jednocześnie osłabia patologiczną akumulację LAMP1 w neurytach dystroficznych, które zwykle występują u myszy 5XFAD.

Zmniejszona akumulacja BACE1 w neurytach dystroficznych u myszy LNK-754 leczonych przewlekle 5XFAD

LAMP1 znajduje się na błonach organelli endolizosomalnych, których celem jest aksonalny BACE1, aby dojrzałe lizosomy uległy degradacji. Dlatego FTI mogą hamować wytwarzanie A i odkładanie się płytek zewnątrzkomórkowych poprzez zmniejszenie powstawania dystrofii aksonów i akumulację BACE1 wokół płytek. Na poparcie tej hipotezy poziom dystroficznego neurytu LAMP1 i obciążenie blaszkami były silnie skorelowane w korowych obszarach mózgu myszy LNK-754.

Nasza analiza barwienia immunologicznego LAMP1 ujawniła, że ​​w porównaniu z leczeniem nośnikiem lub lonafarnibem, płytki u myszy leczonych LNK-754 5XFAD były powiązane z mniejszą liczbą neurytów dystroficznych (ryc. 2). Aby określić, czy poziom BACE1 w neurytach dystroficznych był podobnie obniżony w przeliczeniu na płytkę, przeprowadziliśmy konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną korowych i hipokampowych tkanek mózgowych myszy leczonych nośnikiem, LNK-754 i lonafarnibem pod kątem BACE1, oprócz LAMP1 i A 42 (Rys. 3A, B).

W tym przypadku obszar pokryty BACE1 był znacząco zmniejszony w korowych obszarach mózgu myszy leczonych LNK-754, a u myszy leczonych lonafarnibem zaobserwowano tendencję (ryc. 3C). Analizę obszaru objętego BACE1 w neurytach dystroficznych w hipokampie utrudniał wysoki poziom ekspresji BACE1 w zakończeniach presynaptycznych szlaku omszałych włókien hipokampa CA3 [17]. Dodatkowo przeanalizowaliśmy, czy mniej BACE1 jest zlokalizowane w endolizosomach w neurytach dystroficznych, mierząc współczynnik korelacji Pearsona dla BACE1 i LAMP1 w dystrofiach. Znaczące zmniejszenie kolokalizacji BACE1 i LAMP1 na płytkę stwierdzono w korowych obszarach mózgu u myszy leczonych LNK-754-w porównaniu z leczonymi nośnikiem (ryc. 3D).

W hipokampie stwierdzono znaczny spadek kolokalizacji BACE1 i LAMP1 na płytkę dla LNK-754 w porównaniu z lonafarnibem i zaobserwowano tendencję do zmniejszania się w przypadku leczenia LNK-754 w porównaniu z nośnikiem (ryc. 3E). Wyniki te są zgodne z naszymi odkryciami dotyczącymi obciążenia płytkami i obszaru pokrytego LAMP1 i dodatkowo potwierdzają tezę, że leczenie LNK-754 osłabia tworzenie się neurytów dystroficznych, zmniejszając gromadzenie się uszkodzonych organelli endolizosomalnych, których celem jest degradacja BACE1.

Ostre leczenie LNK‑754 zmniejsza późną akumulację endosomu i lizosomu w neurytach dystroficznych u żywych skrawków mózgu myszy 5XFAD

Następnie przetestowaliśmy ostry wpływ LNK-754 i lonafarnibu na neuryty dystroficzne, wykonując obrazowanie konfokalne żywych tkanek mózgowych. W tym eksperymencie 5-miesięcznym myszom 5XFAD codziennie przez 3 tygodnie wstrzykiwano nośnik, LNK-754 lub lonafarnib. Barwiliśmy tkanki za pomocą LysoTracker-Green (LT), sondy powszechnie stosowanej do śledzenia i selektywnej identyfikacji zakwaszonych późnych endosomów i lizosomów w żywych komórkach [53]. Wzór barwienia LT i czerwienią tiazynową był zgodny z naszymi wynikami barwienia immunologicznego dla markerów dystroficznych neurytów u myszy 5XFAD (ryc. 2A, B; ryc. 3A, B); Późne endosomy i lizosomy LT-dodatnie były silnie skoncentrowane w neurytach dystroficznych ściśle związanych z płytkami amyloidowymi w żywych tkankach mózgu (ryc. 4A).

Ostre 3-tygodniowe leczenie 5-miesięcznych myszy 5XFAD za pomocą LNK-754 lub lonafarnibu było niewystarczające, aby zmniejszyć rozmiar płytki (ryc. 4B), chociaż leczenie LNK-754 powodowało znaczny spadek stosunku LT: TR na płytkę i wielkość neurytu dystroficznego (ryc. 4C, D). Co ciekawe, w przeciwieństwie do naszych wyników dla LAMP1 lub BACE1, ostre leczenie lonafarnibem również zmniejszyło wielkość dystrofii i stosunek LT: TR na blaszkę (ryc. 4C, D). Rozmiar neurytów dystroficznych i rozmiar płytki są silnie skorelowane u myszy 5XFAD leczonych LNK-754 (ryc. 4F), a istotną korelację zaobserwowano także u myszy leczonych lonafarnibem (ryc. 4G). Nie stwierdzono korelacji u myszy leczonych nośnikiem (ryc. 4E). Nasze wyniki potwierdzają, że LNK-754 zmniejszają dystrofię aksonów i sugerują, że FTI mogą osłabiać późną akumulację endosomów i lizosomów wokół płytek, nawet po rozległym odkładaniu się płytek i zwyrodnieniu aksonów.

Poprawa deficytów uczenia się i pamięci u myszy hAPP/PS1 po krótkotrwałym leczeniu LNK‑754

LNK-754 zapobiegało gromadzeniu się LAMP1, BACE1 i LT w neurytach dystroficznych u myszy 5XFAD, co sugeruje, że leczenie LNK-754 chroni przed dysfunkcją synaptyczną związaną z A. Aby ocenić, czy leczenie LNK-754 miało korzystny wpływ na funkcje poznawcze, oceniliśmy krótkoterminową skuteczność doustnego leczenia LNK-754 w zakresie uczenia się przestrzennego i pamięci w mysim modelu hAPP/PS1 AD [40] . Jak oceniono za pomocą labiryntu wodnego Morris Water Maze (MWM), pamięć przestrzenna myszy hAPP/PS1 poprawiła się po 12 dniach doustnego leczenia LNK-754.

Podczas sesji szkoleniowych na ukrytej platformie myszy hAPP/PS1 leczone LNK-754 nauczyły się lokalizować platformę szybciej niż myszy hAPP/PS1 leczone nośnikiem, co spowodowało, że krzywa uczenia się znacznie różni się od krzywej uczenia się w przypadku hAPP traktowanych nośnikiem Myszy kontrolne /PS1 (ryc. 5A). Myszy hAPP/PS1 traktowane nośnikiem potrzebowały znacznie więcej czasu na zlokalizowanie platformy w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego, którym podano nośnik w 4. i 7. dniu prób szkoleniowych, podczas gdy nie stwierdzono znaczących różnic między hAPP/PS1 traktowanymi LNK-754 Myszy PS1 i myszy typu dzikiego traktowane nośnikiem (Fig. 5A-C).

Podczas testu sondy zwierzęta hAPP/PS1 traktowane LNK-754- wykazywały dłuższy czas spędzony w docelowym kwadrancie (ryc. 5D) i zwiększoną częstotliwość przekraczania platform (ryc. 5E), porównywalne ze zwierzętami typu dzikiego leczonymi nośnikiem . Poziomy A 42 zmierzono za pomocą testu ELISA i pozostały niezmienione w rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych homogenatach mózgu myszy hAPP/PS1 traktowanych nośnikiem lub LNK-754- (ryc. 5F, G), co sugeruje, że poprawa pamięci i uczenia się przestrzennego nie były wynik obniżonego obciążenia amyloidem u myszy hAPP/PS1 leczonych LNK-754.

For more information:1950477648nn@gmail.com