Drobny pył zawieszony 2,5 reguluje w górę melanogenezę w ludzkich komórkach czerniaka A375
Jul 19, 2023
Do redaktora: Badania epidemiologiczne wykazały, że ekspozycja na drobne cząstki stałe 2,5 (PM2,5) zwiększa ryzyko przebarwień skóry.[1] Niedawne badanie wykazało, że PM2.5 może indukować melanogenezę poprzez regulację ekspresji tyrozynazy (TYR) i białka związanego z tyrozynazą 1 (TYRP1) i 2 (TYRP2) poprzez aktywację sygnalizacji receptora węglowodorów arylowych (AhR) / aktywowanej mitogenem kinazy białkowej. 2] AhR jest szeroko rozpowszechniony w komórkach skóry, a jego ligacja kontroluje utlenianie/antyutlenianie, funkcję bariery naskórkowej, odpowiedź fotoindukowaną, wrodzoną odporność i melanogenezę. Może być aktywowany przez dioksyny i wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (składniki PM2,5), a jego aktywacja indukuje transkrypcję genów kodujących enzymy metabolizmu ksenobiotyków fazy I i II (cytochromy P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 i CYP1B1). [3,4] BaP i niebezpieczne dioksyny aktywują AhR z silną generacją reaktywnych form tlenu (ROS), w której przynajmniej częściowo pośredniczy CYP1A1. Ponadto stres oksydacyjny, w którym pośredniczy CYP1A{30}}jest odpowiedzialny za produkcję cytokin prozapalnych, takich jak interleukina (IL)-1, IL-6 i IL-8 w środowisku ludzkich keratynocytów poddanych działaniu zanieczyszczeń.[3,5] Istnieje jednak bardzo niewiele badań dotyczących toksycznego wpływu PM2,5 na komórki melanogenetyczne. Tutaj potraktowaliśmy ludzkie komórki czerniaka A375 różnymi stężeniami PM2,5, aby zbadać, czy PM2,5 może promować melanogenezę i jego związek z sygnalizacją AhR, stresem oksydacyjnym i odpowiedzią zapalną.
Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniem DNA spowodowanym przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silne zdolności wymiatania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA oraz mają pewien wpływ ochronny na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność wychwytywania wolnych rodników DPPH i ma zdolność wychwytywania reaktywnych form tlenu i zapobiegania degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ naprawczy na uszkodzenia anionowe wolnych rodników tyminy.
Kliknij Suplement Cistanche Tubulosa
【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
PM2,5 zbierano zimą (od grudnia do stycznia) w Pekinie. Inteligentny próbnik cząstek zawieszonych (TSP) HY -1000 o dużym przepływie (opcjonalny przecinak PM2,5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Chiny) został użyty do pobierania próbek z filtra kwarcowego. Membranę kwarcową zanurzono w 75% etanolu, a następnie wytrząsano ultradźwiękami. Do przygotowania roztworu podstawowego o wysokim stężeniu użyto sterylnej wody. Ludzkie komórki czerniaka A375 hodowano w 5% CO2 w 37 stopniach w zwykłej pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, USA) zawierającej płodową surowicę bydlęcą (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Komórki A375 traktowano różnymi stężeniami PM2,5 (0, 100, 200 i 400 ug/ml) przez 24 godziny, a komórki wykorzystano do dalszych badań. Do analizy statystycznej wykorzystano test t-Studenta dla niesparowanych par i jednoczynnikową analizę wariancji, a P <0,05 uznano za statystycznie istotne.
Aby zbadać wpływ PM2.5 na komórki A375, wykrywano proliferację komórek za pomocą zestawu CCK -8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), a apoptozę komórek wykrywano za pomocą izotiocyjanianu fluoresceiny aneksyny V/ jodek propidyny (FITC/PI) do apoptozy zestaw (Multisciences, USA), w oparciu o instrukcje producenta. Wyniki wskazują, że PM2,5 wykazywał zależną od stężenia cytotoksyczność wobec komórek A375, ale nie wpływał na apoptozę [Rysunek dodatkowy 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
Do oznaczenia zawartości melaniny zastosowano metodę NaOH. Komórki A375 traktowane 5-PM2 przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i poddano lizie wodą. Lizaty wirowano przy 12, 000 obr./min przez 5 minut, przemyto 10% kwasem trichlorooctowym (500 ml) (Sigma, St. Louis , MO, USA) i 75% etanolu (500 ml), a następnie ponownie sklarowano. Następnie do peletek dodawano 50 ml 1 mol/l NaOH zawierającego 10 procent sulfotlenku dimetylu na 1 godzinę w temperaturze 80°C. Absorbancję przy 490 nm (OD 490) mierzono stosując czytnik mikropłytek. Ponieważ TYR jest najważniejszym enzymem melanogennym, następnie wykryliśmy aktywność TYR za pomocą testu lewodopy (L-DOPA). Płytki sześciostudzienkowe (Corning, USA) wysiano komórkami A375 przy gęstości 3 x 105 komórek/studzienkę. Komórki następnie przemyto PBS i poddano lizie 0,5% dezoksycholanem sodu (Sigma). Lizat podzielono na trzy grupy i do każdej próbki dodano 0,1% L-DOPA (Sigma). Po 5 minutach zmierzono OD490 i jako wzorzec zastosowano 0,1% L-DOPA. Zmierzyliśmy również poziomy ekspresji mRNA i białka TYR. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu minizestawu RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu zestawu ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japonia). Następnie przeprowadzono ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) na Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japonia). Startery firmy Invitrogen przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1, http://links. lww.com/CM9/A917, a poziom ekspresji każdego mRNA obliczono metodą 2*DDCT. Poziomy ekspresji białka analizowano metodą Western blotting. Komórki przemyto PBS i poddano lizie w buforze RIPA (Beyotime, Chiny) zawierającym fluorek fenylometylosulfonylu (mieszanka inhibitorów proteazy, 20:1, Sigma-Aldrich). Stężenia białka mierzono przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA (Beyotime, Chiny). Całkowite białko gotowano w temperaturze 70 stopni przez 10 minut, rozdzielano w 4-12-procentowym żelu przy 200 V przez 40 minut, przenoszono na membranę w temperaturze 4 stopni przy użyciu 120 mA przez 75-100 minut, a następnie inkubowano z 5-procentowym mleko beztłuszczowe przez 1 godzinę. Błony następnie sondowano przeciwciałami anty-TYR, anty-AhR, anty-CYP1A1 i anty-CYP1B1 (Abcam) przez noc w temperaturze 4°C. Przeciwciało anty-mysie IgG skoniugowane z peroksydazą chrzanową (Proteintech, USA) zastosowano jako przeciwciało drugorzędowe. Wyniki wskazują, że PM2,5 zwiększa zawartość melaniny i aktywność TYR w sposób zależny od dawki. Zarówno poziomy ekspresji mRNA, jak i białka TYR były regulowane w górę [Uzupełniający rysunek 2 A – D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2,5 może zwiększać aktywność TYR poprzez aktywację szlaku AhR. Aby ustalić, czy PM2,5 wpływa na sygnalizację AhR, wykryliśmy poziomy transkrypcji AhR i jego klasycznych genów CYP1A1 i CYP1B1 za pomocą qRT-PCR i western blotting. Wyniki pokazały, że PM2.5 zwiększył poziom ekspresji mRNA AhR i CYP1A1, jak również ekspresję białka CYP1A1 [Uzupełniający Ryc. 2 E-G, http://links.lww.com/CM9/A917].
Aktywacja AhR powoduje wytwarzanie ROS, które mogą również zwiększać aktywność TYR.[5] W związku z tym oceniliśmy wytwarzanie ROS przy użyciu dioctanu 20,{2}}dichlorofluoresceiny (DCFHDA) i cytometrii przepływowej. Po 24 godzinach traktowania PM2,5 komórki A375 inkubowano z DCFH-DA (5 mmol/l) przez 30 minut w temperaturze 37 stopni w ciemności. Komórki przemyto dwukrotnie w PBS i zmierzono fluorescencję za pomocą cytometru przepływowego. Średnią intensywność fluorescencji określono ilościowo przy użyciu oprogramowania FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, Nowy Jork, NY, USA). Uważa się, że za odpowiedź zapalną odpowiada wytwarzanie ROS wywołane przez CYP1A{14}},[5] poziomy ekspresji mRNA cytokin prozapalnych (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} i czynnik martwicy nowotworu [TNF]-a). Stwierdzono, że PM2,5 zwiększa produkcję ROS, a także poziomy mRNA IL-1a, IL-6 i IL-8 w komórkach A375 [Rysunek uzupełniający 2 H i I, http ://spinki do mankietów. www.com/CM9/A917].
Wyniki tego badania wskazują, że PM2,5 promuje melanogenezę i zwiększa zarówno aktywność, jak i ekspresję TYR w komórkach A375. Ponadto PM2,5 może aktywować sygnalizację AhR i indukować stres oksydacyjny i odpowiedź zapalną, co może być melanogenną kaskadą sygnalizacyjną odpowiedzialną za przebarwienia.
Podziękowanie
Wyrażamy naszą szczerą wdzięczność następującym osobom: prof. dr Masutaka Furue i prof. dr Tsuji Gaku ze Szpitala Uniwersyteckiego Kyushu, którzy poprawili manuskrypt i pomogli w uzyskaniu informacji związanych z AhR. Jesteśmy również wdzięczni za angielską edycję zapewnioną przez prof. dr Roberta Schwartza z Rutgers New Jersey Medical School.
Finansowanie
Badanie to zostało sfinansowane z grantu Chińskiej Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (nr 2101000271).
Konflikt interesów
Nic.
Bibliografia
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Narażenie na drobne cząstki stałe związane z soczewicą starczą u chińskich kobiet: badanie przekrojowe. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q i in. Cząstki stałe sprzyjają hiperpigmentacji poprzez aktywację sygnalizacji AhR/MAPK oraz poprzez zwiększenie poziomów parakrynowych a-MSH w keratynocytach. Zanieczyszczenie środowiska 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Potencjalna rola PM2,5 w melanogenezie. Środowisko międzynarodowe 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Arylowy receptor węglowodorowy (AhR) możliwy cel w leczeniu chorób skóry. Hipotezy medyczne 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Wpływ pyłu zawieszonego w powietrzu na skórę: systematyczny przegląd od epidemiologii do badań in vitro. Część Fiber Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
