Opracowanie szczepionki przeciwko pryszczycy i wyzwania związane z wywoływaniem długotrwałej odporności: trendy i aktualne perspektywy

Abstrakcyjny:

Pryszczyca (FMD) to wyjątkowo zaraźliwa choroba wirusowa zwierząt gospodarskich, wywoływana przez wirusa pryszczycy z rodzaju Aftowirus, który powoduje poważne skutki gospodarcze zarówno dla indywidualnych rolników, jak i dla gospodarki narodowej. Wiele prób opracowania szczepionki przeciwko pryszczycy nie przyniosło efektu sterylnej odporności. Klasyczne metody produkcji szczepionek wynikały z selektywnej akumulacji mutacji wokół miejsc antygenowych i wiążących. Odwrócenie czynnika przez pozytywną selekcję i quasi-gatunkowy rój, zastosowanie tej metody nie ma zastosowania w obszarach nieendemicznych. Atenuacja chemiczna przy użyciu binarnej etylenoiminy (BEI) chroniła integralność kapsydu i zapewniała wyraźną odporność na szczep prowokujący.

Pryszczyca to choroba wirusowa atakująca układ odpornościowy zwierzęcia. Wirus pryszczycy może atakować komórki zwierzęce, niszczyć błony komórkowe i narządy wewnętrzne, upośledzać funkcje odpornościowe zwierząt i czynić je podatnymi na infekcje innymi patogenami.

Jednocześnie szczepienie szczepionką przeciwko pryszczycy może poprawić odporność zwierząt i uodpornić je na wirusa. Po udanym szczepieniu zwierzę wytworzy przeciwciała, a po ponownym kontakcie z wirusem pryszczycy będzie w stanie szybko wytworzyć odpowiedź immunologiczną, skutecznie zapobiegając dalszemu zakażeniu wirusem i wywołaniu choroby wystąpić.

Dlatego poprawa odporności zwierząt, zwłaszcza poprzez szczepienie przeciwko pryszczycy, jest ważnym sposobem zapobiegania pryszczycy. Jednocześnie naukowe zarządzanie żywieniem i higiena oraz środki zapobiegania epidemiom mogą również pomóc w ograniczeniu rozprzestrzeniania się wirusa i występowania pryszczycy. Z tego punktu widzenia należy się zastanowić, czy organizm ludzki powinien zwracać uwagę na poprawę odporności. Cistanche może znacznie poprawić odporność człowieka. Cistanche ma również działanie przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe, które mogą wzmocnić zdolność układu odpornościowego do walki i poprawić odporność organizmu.

Kliknij zalety Cistanche Tubulosa

Antygeny wirusowe, które zostały zsyntetyzowane chemicznie lub uległy ekspresji w wirusach, plazmidach lub roślinach, wypróbowano w szczepieniu zwierząt. Próbowano immunizować zwierzęta szczepionkami DNA wyrażającymi strukturalne lub niestrukturalne antygeny białkowe. Zastosowanie interleukin jako genetycznego adiuwanta w szczepionkach DNA daje obiecujące efekty. Podczas gdy wyzwania związane z indukowaniem sterylnej odporności leżą w niestrukturalnych (NS) białkach FMDV, które są odpowiedzialne za apoptozę komórek dendrytycznych i mają negatywny wpływ na odpowiedzi limfoproliferacyjne, które prowadzą do przejściowej immunosupresji. Ponadto zniszczenie transportu białek gospodarza przez białka niestrukturalne hamowało proliferację limfocytów T CD8 plus. W tym przeglądzie próbowano odnieść się do wielu podejść do prób opracowywania szczepionek i wąskich gardeł w wytwarzaniu sterylnej odporności.

Słowa kluczowe:

Szczepionka FMD, długotrwała odporność, sterylna odporność.

Tło

Pryszczyca (FMD) to niezwykle zaraźliwa infekcja wirusowa zwierząt gospodarskich, wywoływana przez wirusa pryszczycy, rodzaj: Aphthovirus i rodzinę Picornaviridae; powoduje poważne straty ekonomiczne.1,2 Pryszczyca jest silnie dotknięta domowymi i dzikimi zwierzętami kopytnymi.3-5 Protomery 5S są wytwarzane spontanicznie przez poszczególne dojrzałe białka; VP1, VP3 i VP0, z których pięć składa się w pentamer 12S. Podczas gdy wirusowy kapsyd 75S jest tworzony przez połączenie 12 pentamerów,6,7 doniesiono, że pełny antygen 146S wirusa pryszczycy (FMDV) ma bardzo podobną specyficzność antygenową do kapsydu wirusowego.8,9 Wirus choroby jamy ustnej ma szeroki zakres żywicieli, wysoki wskaźnik zmienności genetycznej i duże różnice antygenowe, i ma siedem serotypów (A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2 i SAT3) i ponad 100 serotypów.10 Ze względu na rój quasi-gatunkowy co roku pojawia się również wiele nowych odmian. Nie ma odporności krzyżowej indukowanej przez siedem serotypów. Istnieje również tylko częściowa odporność krzyżowa między różnymi podtypami tego samego serotypu.11 Zmienność i polimorfizm FMDV bardzo utrudnia zapobieganie i zwalczanie pryszczycy.10 Rekombinowane adenowirusy FMDV wykazujące ekspresję białek P12A i 3C różnych serotypów wykazał działanie ochronne.12–14

Klasyczne inaktywowane szczepionki mają wiele wad, w tym niestabilność termiczną, krótkotrwałą odporność, wysokie koszty, ryzyko rekombinacji z dzikimi szczepami i odwracanie patogenności.11,15,16

Pomimo 90 lat badań nie ma skutecznej szczepionki, która zapewniałaby sterylną i solidną odporność na pryszczycę, ale choroba pozostaje enzootyczna na dużych obszarach globu. Wiele prób opracowania szczepionki przeciwko pryszczycy nie przyniosło sterylnej odporności, z niewielką ochroną przed serotypami krzyżowymi i niewystarczającym czasem trwania odporności.17 Klasyczne metody produkcji szczepionek, takie jak seryjne pasażowanie wirusa na hodowlę komórkową,18 w warunkach niedozwolonych zwierzęta i jego naturalny gospodarz byli w stanie osłabić wirusa. Wynika to z selektywnej akumulacji mutacji wokół miejsc antygenowych i wiążących.19-21 Jednak zastosowanie metody rewersji czynnika przez selekcję pozytywną i quasi-gatunkową metodę roju nie ma zastosowania w obszarach nieendemicznych.22 DNA i technologie białkowe poprawiły badania poprzez modyfikację receptorów integryn, 23 wykorzystując syntetyczne peptydy, które mogą indukować wyraźną odpowiedź immunologiczną u zwierząt. 24 Epitopy komórek pomocniczych T, nieodłącznie związane z regionem pętli G-H, są silnymi epitopami komórek B, które indukują odporność humoralną.25 Zastosowanie rekombinowanego interferonu (IFN) i bydlęcej interleukiny 18 (IL-18) jako adiuwanta zwiększyło długoterminową odporność u zwierząt laboratoryjnych.26,27

Ostatnio szczepionki z rekombinowanym żywym wektorem DNA są silnymi induktorami cytotoksycznych limfocytów T (CTL).28,29 Aby stwierdzić ten efekt w FMD, konieczny jest odpowiedni adiuwant.30 Aby przezwyciężyć ten efekt, rekombinacja nadrodziny gospodarza Ig i epitopu FMD poprawiła humoralną i komórkowa odpowiedź immunologiczna zwierzęcia.

Problem wąskiego gardła w indukowaniu sterylnej i długotrwałej odporności jest utrudniony przez zniszczenie transportu białka gospodarza przez białka niestrukturalne (NS), zwłaszcza 3A, więc nie wywołuje różnicowania klastrów 8 dodatnich (CD8 plus) odpowiedzi komórek T z powodu słabe CTL i wirus utrzymuje się w zwierzęciu.31 Receptory integryny, które pośredniczą w apoptozie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (DC) utrudniają wrodzoną odporność gospodarza.32 Guzman i wsp.33 oraz Joshi i wsp.34 przeanalizowali zastępcze odpowiedzi na zabijanie CTL, takie jak proliferacja lub wytwarzanie IFN przez komórki wykazujące ekspresję CD8, ale wiele limfocytów wykazujących ekspresję CD8 plus, które nie są CTL, wytwarza IFN, w tym komórki naturalnych zabójców (NK) i podgrupy komórek T gamma delta (δ). 35–37

Według Oh i wsp.38 odpowiedź IFN- może być ponownie stymulowana u zaszczepionego bydła, które wykazało wysoki poziom przeciwciał neutralizujących wirusy w krążeniu w dniu prowokacji, co ma bezpośredni związek z indukowaną szczepionką ochroną IFN - i przeciwciało neutralizujące. Ponadto komórki T CD4 plus są głównym fenotypem kwitnącym i komórkami wytwarzającymi IFN. Jednak w naturalnej infekcji występowała limfopenia, która pokrywała się z szczytową wiremią i odpowiedzią IFN- w surowicy, podczas gdy liczba plazmocytów DC (pDC) in vivo i wydzielanie IFN- pDC in vitro na krótko spadało w ciągu 2 dni od zakażenia.39 Wytwarzanie IFN- z DC pochodzące z monocytów (MoDC) i DC pochodzące ze skóry (DCs skóry) są hamowane w ostrej fazie zakażenia świń.40 Zaobserwowano również indukcję apoptozy w niedojrzałych komórkach dendrytycznych przez FMDV.32 Aby przezwyciężyć immunologiczną patogenezę wirusa poprzez zwiększenie produkcji przeciwciał i proliferacji limfocytów T, dzięki zastosowaniu syntetycznych oligonukleotydów jako adiuwantów szczepionek błony śluzowej uzyskano wyższy poziom aktywności CTL i ekspresji IFN w limfocytach T CD8.41 Głównym celem tego artykułu jest przegląd trendów w opracowywaniu szczepionek pryszczycy i wyzwania związane z wywołaniem sterylnej i długotrwałej odporności.

Atenuowana i inaktywowana szczepionka

Było wiele prób ulepszenia żywych atenuowanych szczepionek pryszczycy za pomocą konwencjonalnych metod, takich jak seryjne pasażowanie u zwierząt, które nie tolerują lub hodowla komórkowa. Atenuację osiągnięto poprzez pasażowanie u niewrażliwych gatunków, takich jak myszy, króliki i jaja z zarodkami, aż do utraty zjadliwości u bydła. Seryjne pasaże FMDV C-S8c1 przy dużej wielokrotności infekcji w hodowli komórkowej dały wadliwy genom (C-S8p260), który całkowicie chronił myszy przed śmiertelną prowokacją FMDV C-S8c1 i był bezpieczny dla świń po szczepieniu pojedynczą dawką C-S8p260.42 Indukował również wysokie miana przeciwciał neutralizujących i aktywował limfocyty T u świń.42

Szeregowa transmisja kontaktowa wysoce zjadliwego, przystosowanego do świń izolatu O Taiwan 97 u świń znacznie zmniejsza wirulencję po 14. pasażu świni i znosi ją po 16. pasażu.43 Zmiany aminokwasów podczas pasażowania in vivo były bardzo cichymi substytucjami i zmianami w VP1 (1D) były przejściowe. Opracowanie szczepionki pryszczycy u nietolerujących gospodarzy może spowodować, że środek zacznie wykorzystywać inne receptory komórkowe inne niż Arg-GlyAsp (RGD), a test łysinkowy w teście BHK 21 może dać wynik ujemny, dopóki wirus jest nienaruszony.43 Zastąpienie aminokwasu łańcuchy boczne zlokalizowane w pobliżu interpodjednostki kapsydu przez inny aminokwas mogą ustanowić nowe wiązania dwusiarczkowe lub interakcje elektrostatyczne między interfejsami podjednostek i są albo projektowane, albo inicjowane jako zbędne do infekcji poprzez zwiększenie tolerancji na ciepło szczepów szczepionkowych, 44 przy użyciu obecnych procedur, szczepionek pryszczycy mniej zależne od idealnego łańcucha chłodniczego. Szczepy FMDV C-S8p260 są podzielone na segmenty, a także zdolne do replikacji, co może stanowić podstawę atenuacji szczepionek z dwiema barierami bezpieczeństwa.45

Większość badań pokazuje, że inaktywacja FMDV w modelu zwierzęcym przy użyciu substytucji aminokwasu w 2C nie była wykrywalna w C-S8c1, ale była obecna w niewielkiej części FMDV przystosowanej do świnki morskiej.46 To podstawienie aminokwasu szybko stało się nadrzędne w populacji wirusa po reintrodukcji wirusa przystosowanego do świnki morskiej u świń. Odkrycia te pokazują, w jaki sposób wprowadzenie mniejszościowych wariantów wirusów do sztucznego żywiciela może doprowadzić do ich dominacji, gdy pierwotny gatunek gospodarza zostanie ponownie zainfekowany.47 Oprócz tej pozytywnej selekcji i roju quasi-gatunkowego, szczep szczepionkowy może odwrócić się do szczepu patogennego. 22

Inaktywacja wirusa przy użyciu formaliny i endonukleazy nie powoduje odpowiednio inaktywacji wirusa i degradacji miejsc antygenowych.48 Binarna etylenoimina (BEI) była również stosowana do atenuacji wirusa przy zachowaniu integralności kapsydu.15,49 BEI- inaktywowane receptory komórkowe FMD, integryny, są wykorzystywane do przyłączenia i internalizacji do hodowanych komórek, interakcja odbywa się za pośrednictwem reszty aminokwasowej znajdującej się w pętli GH białka kapsydu VP1.49 Przeciwciała monoklonalne swoiste dla FMDV lub syntetyczny peptyd wykazały wiązanie BEI- inaktywowane FMD zostały zinternalizowane przez ich wspólną lokalizację z białkiem markerowym w BHK-21, za pośrednictwem motywu wiążącego integrynę RGD.50 Ponadto inaktywacja BEI nie wpływa na antygenowość pętli GH.20,51 Inaktywacja BEI, zachowana architektura wirionów i receptory sprzyjały internalizacji wirusa do hodowanych komórek, jak również in vivo, pośredniczy rozpoznawanie integryn,47,52,53 jednak ilościowa ocena całego wirusa wykazuje minimalny wynik w porównaniu z formaliną inaktywacja (65–71,6 proc.), podczas gdy inaktywacja BEI wynosi 44,2 proc. 0,49

Sekwencyjne pasażowanie FMDV typu C od świń i świnek morskich i utrzymywane u świń i myszy ssących prowadzi do wymiany aminokwasów (I2483T w 2C, Q443R w 3A i L1473P w VP1). Zastąpiony aminokwas (L1473P), obok motywu RGD wiążącego integrynę, hamował wzrost wirusa w różnych liniach komórkowych i zmieniał jego antygenowość.47 Inne badanie przeprowadzone przez Burmana i wsp.20 ujawniło, że zmiana pojedynczego aminokwasu w RGD miejsca plus 1 i RGD plus 4 hamują przyczepianie się wirusa i infekcję ułatwianą przez v 6 lub v 8, ale wirus wykorzystuje v 3 do przyczepiania się do komórek. Zastąpienia metioniną lub argininą w miejscu wiązania są skutecznymi inhibitorami dla v 6. Dwie reszty leucyny w miejscach RGD plus 1 i RGD plus 4 stabilizują wiązanie zależne od struktury bezpośrednio C-końcowej do RGD.20,54 Wiązanie oporne na EDTA z v 6 jest znakiem rozpoznawczym, a przewidywano, że stabilny kompleks z jego receptorem komórkowym będzie powodował znaczną wysoką zakaźność FMDV.21

Podstawienie alaniny leucynami na pierwszej i czwartej pozycji w miejscach RGD plus 1 i RGD plus 4 powoduje zahamowanie wiązania wirusa i przyłączenia wirusa do v 6 lub v 8. Jednak wirus wykorzystuje v 3 do wejścia do komórki.20 Podczas gdy szczepy przystosowane do hodowli komórkowej wykorzystują proteoglikany siarczanu heparanu (HSPG) jako alternatywny receptor. Potwierdzenie ich ektodomeny i stanu wiązania liganda przez integryny jest ważnym czynnikiem dla tropizmu dla wirusów.54

Wirusy wiążące siarczan heparanu skutecznie internalizowały DC, ale nie prezentowały antygenu limfocytom, indukując odpowiedź IgG specyficzną dla FMDV.55 Wyniki te pokazują, że internalizacja DC przez FMDV jest najbardziej wydajna w przypadku wirusów szczepionkowych ze zdolnością wiązania HS, ale wiązanie HS nie jest wyłączny wymóg.

Presja selekcyjna wywierana przez humoralną odpowiedź immunologiczną gospodarza odgrywa ważną rolę zarówno w selekcji, jak i stabilizacji antygenowych wariantów FMDV, co skutkuje zmianą tropizmu komórkowego. Testy in vitro wykazały, że równoległe pasażowanie FMDV w obecności subneutralizujących surowic homologicznych skutkowało utrzymywaniem się mutantów.56 Jednak namnażanie FMD typu A24, które zawierało sekwencję SGD w miejscu wiązania receptora komórkowego, zostało zaszczepione bydłu wirus rósł słabo w komórkach BHK{4}}, a sekwencja była stabilnie utrzymywana podczas namnażania w komórkach BHK{5}} wykazujących ekspresję bydlęcej integryny V6 (BHK3 V6), jak również u zaszczepionego eksperymentalnie i kontaktowego bydła 0,56

Z dwóch niezależnych łańcuchów transmisyjnych u bydła nastąpiły zmiany genomowe spowodowane sekwencyjnym pasażowaniem szczepu FMDV przystosowanego do komórek BHK-21- (wiążącego siarczan heparanu). Wariant typu dzikiego z mutacją aminokwasową w VP{3}} został szybko wybrany do replikacji wirusa in vivo.57

Geny delecyjne kodują białko NS, które nie jest kluczowe dla replikacji wirusa in vitro, jest alternatywną techniką wytwarzania żywych atenuowanych szczepionek. Jednak, aby był użyteczny jako szczepionka, ten wirus delecyjny musi nadal być zdolny do replikacji u podatnych zwierząt. Zaletą tego podejścia w porównaniu z klasyczną metodą atenuacji, która na ogół wprowadza mutacje w ograniczonej liczbie miejsc, jest to, że ryzyko powrotu do zjadliwości jest znacznie zmniejszone58, a białka NS są silnymi epitopami komórek T.59

Efekt ten wykazano w genetycznie zmodyfikowanych szczepach szczepionki FMDV z pewnymi zamianami aminokwasów w miejscach antygenowych, o podobnych właściwościach wzrostu do dzikiego wirusa, co do których udowodniono, że w pełni chronią zwierzę przed prowokacją, ale ze zdolnością do replikacji in vitro.60

Awaryjna szczepionka FMD z podwójnym adiuwantem olejowym wykazała zmniejszenie wiremii i zacienienia wirusa i nie wykazywała żadnych objawów klinicznych. Istniało spójne wykrywanie IL-6, IL-8 i IL-12 u zaszczepionych zwierząt.61 Podczas gdy inne cytokiny IL-1, IL-2, TNF , TGF i interferony nie zostały wykryte; świadczy to o tym, że szczepionka nie indukowała ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej, jak również ogólnoustrojowego podwyższenia aktywności limfocytów T, co jest związane z krótkotrwałą ochroną przed pryszczycą.61

Rekombinowana ludzka IL-2 jest silnym humoralnym induktorem odporności w mysiej szczepionce przeciw pryszczycy.62 Zaszczepione zwierzęta pozostają serokonwersyjne przez 7–8 miesięcy, a ogólnoustrojowe poziomy cytokin (IL-6, IL{{5 }} i IL -12) wzrosły po szczepieniu.63

Puste wirusowe kapsydy

Puste kapsydy wirusowe, znane również jako cząsteczki wirusopodobne (VLP), obejmują cały repertuar miejsc immunogennych występujących na nienaruszonych wirusach, ale brakuje im zakaźnych kwasów nukleinowych i obejmują klonowanie wirusowego genomu niezbędnego do syntezy, przetwarzania i składania wirusa białek strukturalnych w puste kapsydy wirusowe (geny kodujące P1-2A i 3Cpro; ryc. 1).64 Puste kapsydy są naturalnie wytwarzane in vitro w hodowli komórkowej, są antygenowo podobne i immunogenne.65

Zastosowanie szczepionki z pustym kapsydem jest obiecującym kandydatem, ponieważ pozwala uniknąć użycia wirusa w produkcji szczepionki i zachowuje konformację epitopów.45 Ponadto nie ma ryzyka rewersji wirusa i rekombinacji z dzikimi szczepami. Rosnące w zawiesinie komórki ssaków bez surowicy były wykorzystywane do przejściowej ekspresji genów (TGE) rekombinowanych pustych kapsydów FMDV.66 Identyfikacja zaszczepionych zwierząt zakażonych lub rekonwalescentów jest łatwa przy użyciu obecnie dostępnej technologii.67-69

Szczepionka podjednostkowa

Szczepionka podjednostkowa zawiera antygeny wirusowe zebrane przez ekstrakcję chemiczną lub bioekspresję minimalnej ilości antygenów niewirusowych w pożywce hodowlanej.70 Badacze ujawnili, że VP1 jest jednym z białek kapsydu FMDV, które miały znaczną ekspozycję powierzchniową w latach 70. oraz ostatnie postępy w wirusologii strukturalnej.71

Inżynieria genetyczna została wykorzystana do zmutowania części genomu lub zniesienia regionu kodującego białko VP1 w ostatnich próbach stworzenia atenuowanych szczepionek. Za pomocą rekombinowanego DNA skonstruowano wirusa z usuniętym miejscem wiązania receptora RGD na VP1 FMDV.72 U myszy lub świń w wieku od 7- do 10--dniowych wirus ten nie był w stanie przylegać do komórek i nie wywoływać infekcję.73

Białko kapsydu VP1 FMDV i region końca karboksylowego VP1 mają pętlę G – H, która jest wysoce immunogenna, odpowiadająca epitopom komórek B. Chemicznie zsyntetyzowany peptyd składający się z regionów (reszty 141 do 158) białka otoczki wirusa (VP1) z serotypu O FMDV wywołał wysoki poziom przeciwciał neutralizujących i chronił bydło przed śródskórną inokulacją zakaźnego wirusa,24 co sugeruje znaczenie G Pętla –H w indukowaniu humoralnej odpowiedzi immunologicznej. VP1 zawiera również region hiperzmienny i miejsce immunogenne; eksploatacja tego miejsca byłaby podstawą dla szerokiej immunogenności.74

Włączenie IFN jako genetycznego adiuwanta spowodowało opóźnienie wystąpienia objawów klinicznych i wystąpienia wiremii.75 Rekombinowany bakulowirus jedwabnika, który koduje proteazę P1-2A i 3C FMDV Asia 1, był w stanie wytworzyć swoiste przeciwciała u zaszczepionych zwierząt i chronionych po prowokacji zjadliwym homologicznym wirusem, a objawy kliniczne złagodziły się i opóźniły.64

Indukowano pojedynczą dawkę defektywnego adenowirusa 5 (Ad5) zawierającego regiony kodujące P1 i 3C serotypu A FMDV (Ad5A24), neutralizując przeciwciała i chroniąc świnie przed prowokacją homologiczną.76 Jednak wpływ na ramię odporności komórkowej nie był badany .

Zarówno dla ekspresji pustych kapsydów serotypu A, zarówno dla wirusa krowianki, jak i bakulowirusa; zawierające racjonalnie zaprojektowane mutacje, stabilność została zwiększona w komórkach eukariotycznych.77 Ta metoda wytwarzania antygenu szczepionkowego ma kilka potencjalnych zalet w porównaniu z obecnymi technologiami pod względem kosztów produkcji, ryzyka infekcji i szczepionki odpornej na temperaturę.45

Wektor ludzkiego adenowirusa typu 5, w którym zachodzi ekspresja białka kapsydu (P1-2A i zmutowanej wirusowej proteazy 3C) nadaje znaczącą odporność humoralną, komórkową i śluzówkową wywoływaną u myszy BALB/c. Szczepienie świnek morskich wywołało istotne przeciwciała neutralizujące i przeciwciała przeciwko immunoglobulinie A (IgA) przeciwko FMDV ze 100% ochroną świnek morskich przed prowokacją.78

Rekombinowany psi adenowirus typu 2 (CAV2) wykazujący ekspresję białek kapsydu (P1/3C) (ryc. 1) był w stanie wywołać silną humoralną odpowiedź immunologiczną u świnek morskich. Jednak białko VP1 wykazujące ekspresję psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) nie wywołało trwałej odpowiedzi przeciwciał u świnek morskich ani myszy.79

Świnie zaszczepione adenowirusem 5 ze wzmacniaczem wirusa cytomegalii kodującym A24-2B (Ad5-CI-A{4}}}BC) uzyskały szczytową odpowiedź przeciwciał neutralizujących o 7–14 dpv i wywołały wyższą produkcję IgM w 7 dpi.14 Zmodyfikowany promotor wirusa cytomegalii zwiększył skuteczność wektora i przyspieszył infekcję komórek w hodowli komórkowej, grupa otrzymująca szczepionkę była całkowicie chroniona po prowokacji.14

Domięśniowe zaszczepienie myszy rekombinantami, rekombinowanym białkiem kapsydu bakulowirusa FMDV sklonowanym z natychmiastowym wczesnym wzmacniaczem wirusa cytomegalii jako promotorem (CMV-IE) i regionem kodującym immunogen limfocytów T z epitopami limfocytów T, skutecznie indukowało przeciwciała neutralizujące i interferon gamma. IFN-).80 Regiony kodujące P1- 2A i 3C FMD serotyp A eksprymowany w poczwarkach jedwabnika (Bombyx mori) był w stanie indukować wysokie miana swoistych przeciwciał i całkowicie chronił przed prowokacją zjadliwym wirusem homologicznym.81

System wielu peptydów antygenowych jest wysoce immunogenny w porównaniu z pojedynczym liniowym peptydem antygenów szczepionkowych FMD.82 Syntetyczne peptydy dendrymerowe, które zawierają dwie kopie głównego miejsca antygenowego komórek B antygenu FMDV [VP1 (140–158)], kowalencyjnie połączone do heterotypowego miejsca antygenowego komórek T z niestrukturalnego białka 3A [3A (21-35)], chroni świnie przed prowokacją wirusową.83 Peptyd dendrymerowy odtwarzający heterotypowy i wysoce konserwatywny FMDV 3A (21-35) Epitop limfocytów T również poprawił odpowiedź przeciwciał neutralizujących i IFN.84 U 70% świń zaszczepionych B2T, pełną ochronę – brak klinicznych objawów choroby – zaobserwowano po prowokacji wirusem w 25 dniu po immunizacji.84

Szczepionki DNA

Wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMCV) zostało usunięte, a gen L, który bierze udział w wyłączaniu komórek przez proteolizę eIF46,85, został usunięty, a EMCV IRES, który, jak wykazano, zwiększa wydajność ekspresji, został został wstawiony powyżej sekwencji P1.86 Szczepionka DNA kodująca P1-2A i GM-CSF jako indukowane adiuwantem silne przeciwciało swoiste i neutralizujące FMDV, jak również indorujące cytokiny IL-8 i produkcja IFN u świń.87

Szczepionki DNA oparte na wirusowych minigenach odpowiadających trzem głównym epitopom FMDV komórek B i T VP1 (sekwencja aminokwasowa 133–156)-3A (sekwencja aminokwasowa 11–40) i VP4 (20–34) chronić myszy pod nieobecność swoistych przeciwciał w czasie prowokacji.88

Donosowe podanie szczepionki DNA FMDV; użycie chitozanu jako nośnika dostarczającego i IL-15 jako adiuwanta molekularnego wywołało śluzówkową i ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną ze zwiększoną odpornością komórkową (CMI), na co wskazuje wyższy poziom proliferacji limfocytów T, odpowiedź CTL, oraz ekspresję IFN- zarówno w komórkach T CD4 plus, jak i CD8 plus. 73

Myszy zaszczepione plazmidem eksprymującym VP1 i IL9 jako genetycznym adiuwantem iz uruchomionym mechanizmem antyapoptozy, rozwinęły silną odpowiedź humoralną, wysoki poziom IFN- i perforyny w komórkach T CD8 plus, ale nie IL{{6} } w tych komórkach T. IL{8}} zwiększała ekspresję genu Beclin i zapobiegała apoptozie komórek T.89

Inne badanie wykazało, że szczepionka DNA VP1 wykazująca ekspresję interleukiny{1}} i IFN-, stosowana jako adiuwanty molekularne, poprawiła swoiste dla antygenu odpowiedzi komórkowe. Indukowało również wysokie miano IgG2a/IgG1, IFN-, IL{8}} i dojrzewanie komórek dendrytycznych.90

Wykorzystując IL{0}} jako adiuwant genetyczny w kodowaniu szczepionki DNA, dwa epitopy FMDV VP1 (reszty aminokwasowe 141–160 i 200–213) zawierające wiele epitopów muszą wywołać zarówno proliferację limfocytów T, jak i przeciwciała neutralizujące przeciwko pryszczycy u świń stosując IL-2 jako adiuwant genetyczny.91,92

Świnie immunizowane szczepionkowym plazmidem anty-FMDV DNA kodującym P1-2A3C3D i plazmidem eksprymującym świński „czynnik aktywujący komórki B należący do rodziny TNF” (BAFF) promowały aktywację dojrzewania komórek B i zmianę klas immunoglobulin.93

Szczepionka DNA oparta na replikach z regularnymi dawkami przypominającymi zapewniała skuteczną strategię szczepionki przeciwko FMDV.94 Włączenie różnych celów antygenowych do szczepionek DNA to doskonały sposób na przygotowanie koktajlu antygenów w pojedynczej formule szczepionki. Myszy immunizowane trzema plazmidami kodującymi antygen wirusa pryszczycy (FMDV), wirusa wścieklizny rzekomej (PRV) i wirusa klasycznego pomoru świń (CSFV) dały obiecujące wyniki.95

Domięśniowe zaszczepienie świnek morskich plazmidami DNA eksprymującymi FMDV zawierającymi sekwencję sygnałową zaszczepionego genu świńskiej IgG wykazało odpowiedź przeciwciał neutralizujących i wzrost proliferacji komórek śledziony po szczepieniu przypominającym, ale zwierzęta nie były chronione przed prowokacją wirusową.96

Szczepionka DNA kodująca epitop komórek T i epitopy komórek B z miejsc 135–167 VP1 i miejsca 1 obejmuje regiony 141–160 (pętla G – H) i koniec karboksylowy VP1 FMDV typu O wywołały silną komórkową odpowiedź immunologiczną jak zaobserwowano przy użyciu testu proliferacji komórek T.97

Donosowe podanie szczepionki FMDV DNA kodującej białko kapsydu, kationowy PLGA (poli(laktydo-ko-glikolid) jako nośnik i bydlęca IL -6 jako adiuwant genetyczny) wykazało zwiększoną odpowiedź immunologiczną błony śluzowej i ogólnoustrojową u zaszczepionych zwierząt.98

Szczepionka DNA eksprymująca białko kapsydu (P1-2A, 3C i 3D) zaszczepiona pGM-CSF i wzmocniona inaktywowanym antygenem FMDV wykazała znaczny poziom reaktywności krzyżowej serotypów u zaszczepionych świń. Znaczący poziom reaktywności krzyżowej serotypów odnotowano przeciwko A, C i Asia1 w testach neutralizacji wirusa i testach ELISA.99 Jednak szczepionka DNA wyrażająca białko VP1 i wytwarzająca antysensowny RNA ukierunkowany na 5ʹUTR FMDV indukowała specyficzną odpowiedź immunologiczną u zaszczepionych myszy.72

Szczepionka DNA wykazująca ekspresję VP1 wraz z IL-15 (adiuwantem molekularnym) wzmocniła IgA wydzielane przez błony śluzowe i IgG w surowicy oraz odporność komórkową (CMI), co udowodniono przez wyższy poziom specyficznej dla antygenu proliferacji limfocytów T, cytotoksycznych limfocytów T (CTL) i wyższą ekspresję IFN- zarówno w limfocytach T CD4 plus, jak i CD8 plus, informujących o śledzionie i błonach śluzowych.73

Rekombinowane szczepionki są wytwarzane przez rekombinację nadrodziny Ig gospodarza, a epitopy wirusowe poprawiają humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną szczepionych zwierząt. Szczepionki RNA są silnymi przełącznikami klas IgG, poza tym wysokie miana IgM obserwowano również u zaszczepionych myszy.100 Plazmidowy DNA zawierający epitopy FMDV ma idealną dystrybucję tkankową u myszy.101

Wyzwania związane z indukcją długotrwałej odporności

Po zakażeniu różnymi serotypami FMDV następuje znacząca zmiana subpopulacji limfocytów T, kompetencji funkcjonalnych i liczebności.102 Do 48 godzin po zakażeniu dochodzi do obniżenia liczby limfocytów T boCD4 plus i boCD8 plus. Jednak obniżenie poziomu limfocytów T boWC1 plus obserwuje się do 48 hp w przypadku serotypu O FMDV. Limfocyty ze szczepionych zwierząt wykazały znaczną regulację w górę limfocytów T boCD4 plus, boCD8 plus i boWC1 plus po ekspozycji na FMDV. 102

Po naturalnym zakażeniu dochodzi do znacznego wzrostu ekspresji białka 3A-NS w limfocytach różniących się przebiegiem choroby, co prowadzi do przejściowej immunosupresji limfocytów T CD4 plus i CD8 plus. 34

Zniszczenie transportu białka gospodarza przez białka NS, zwłaszcza 3A, zaburza całkowicie, więc nie wywołuje odpowiedzi limfocytów T CD8 plus.31 Ze względu na słabe CTL wirus utrzymywał się w zwierzęciu. Receptory integryn pośredniczą w apoptozie DC pochodzącej ze szpiku kostnego, utrudniając wrodzoną odporność gospodarza.32 Innym ważnym zjawiskiem, które zakłóca odporność gospodarza, jest Lbpro, wysoce konserwatywna domena, która odgrywa ważną rolę poprzez hamowanie ubikwitynacji kluczowych cząsteczek sygnałowych w aktywacji typu I Odpowiedź IFN, taka jak gen indukowany kwasem retinowym I (RIG-I), kinaza wiążąca zbiornik 1 (TBK1), czynnik związany z receptorem TNF 6 (TRAF6) i TRAF3.103 Zmniejsza to poziom natychmiastowej i wczesnej inicjacji IFN Produkty genowe stymulowane przez mRNA i IFN.102 Ponadto 3Cpro blokuje transport wewnątrz aparatu Golgiego poprzez degradację białka wymaganego do transportu wewnątrz aparatu Golgiego.

Guzman i wsp. 33 oraz Joshi i wsp. 34 przeanalizowali zastępcze odpowiedzi na zabijanie CTL, takie jak proliferacja lub produkcja IFN przez komórki wykazujące ekspresję CD8, które opisano, ale wiele limfocytów wykazujących ekspresję CD8 plus, które nie są CTL wytwarzającymi IFN, w tym komórki NK i podzbiory δ T -komórki. 35–37,39,104

Aktywność CTL oceniona 10 dni po prowokacji z Ad5-FMDV{2}}C wskazywała na znaczny wzrost aktywności CTL 10 dni po prowokacji w porównaniu z poziomami przypominającymi, ale powróciła do poziomu wyjściowego po 17 dniach wyzwanie.17 Jednak próba oceny aktywności CTL w dniu 4 nie dała wystarczającej liczby komórek. Było to spowodowane limfopenią i immunopatologią wywołaną przez FMDV. Oprócz spadku długoterminowej trwałości wirusa pryszczycy istnieje pozytywny związek między odpowiedzią IFN a ochroną wywołaną szczepionką.38

Według Oh i wsp.38 limfocyty T CD4 plus są głównymi komórkami o fenotypie namnażającym się i produkującymi IFN.

Niezależnie od serotypu FMDV, stężenie IFN w surowicy osiągnęło szczyt 2–3 dni po zakażeniu, limfopenia odpowiadała szczytowej wiremii i odpowiedzi na IFN w surowicy, a liczba krążących plazmocytowych komórek dendrytycznych (pDC) i wytwarzanie IFN w pDC in vitro przejściowo spadły po 48 godzinach. Niezależnie od wstrzykniętego serotypu FMDV lub wieku zakażonego zwierzęcia, nigdy nie stwierdzono zakażenia limfocytów ani pDC.39

Wytwarzanie IFN- z DC pochodzących z monocytów (MoDC) i DC pochodzących ze skóry (DC skóry) jest tłumione podczas ostrej fazy zakażenia świń. Wpływ ten zachodzi w parze ze zwiększonym mianem wirusa we krwi, ale komórki te nie są produktywnie zakażone. Co ciekawe, zdolność tych DC do pobierania cząstek i przetwarzania antygenów nie zmienia się, co pokazuje, że antygeny nie wpływają na ich zdolność do pobierania cząstek i przetwarzania antygenów.35

Wniosek

W oparciu o powyższą literaturę i lukę badawczą przedstawia następujące zalecenia. Należy zbadać internalizację komórkową, wzór glikozylacji, prezentację antygenu i mechanizmy pozytywnej selekcji (rozwój patogennego szczepu) tradycyjnych szczepionek. Wywołany szczepionką CD8 plus T CMI wzmacnia długotrwałą odpowiedź immunologiczną i ochronę krzyżową. Istnieje rola receptorów limfocytów T δ w patogenezie immunologicznej, trwałości i produkcji CTL, co należy dokładnie zbadać. Rekombinowane białko przy użyciu cytometru przepływowego i ELISpot ELISA do analizy internalizacji cząstek szczepionki, prezentacji antygenu i oceny przesłuchu komórek prezentujących antygen.

Należy opracować nowe narzędzia internetowe, które pokażą wpływ łańcuchów bocznych na epitop komórek B lub T. Należy wyraźnie dążyć do wykorzystania modelu zwierzęcego infekcji oraz opracowywania szczepionek i testów skuteczności, ponieważ istnieje znacząca różnica w receptorach integryny u zwierząt laboratoryjnych, a także u świń i przeżuwaczy. Obliczeniowe oszacowanie epitopów CTL w całym genomie poprzez integrację narzędzi do przypuszczania epitopów w obliczaniu ogromnej liczby sekwencji wirusowych, a następnie ocena in vivo, ma wielką zaletę w wytwarzaniu szczepionek o długotrwałej ochronie i zdolności do ochrony krzyżowej.

Skróty

3A, białko niestrukturalne; Ad5, wektor adenowirusa 5; 3Cpro, proteaza 3C (białko niestrukturalne); BEI, binarne etylenoaminy; Komórka BHK, komórka nerki małego chomika; CD4 plus, Czwarty czynnik różnicowania klastrów dodatni; CD8 plus, współczynnik różnicowania klastrów osiem dodatni; cDNA, komplementarny DNA; CTL, cytotoksyczne komórki T; DC, komórka dendrytyczna; ELISA, test immunoenzymatyczny; FMD, pryszczyca; FMDV, wirus pryszczycy; GM-CSF, Granulocyty i Monocyty Czynnik stymulujący tworzenie kolonii; IFN-, interferon alfa; IFN-, interferon gamma; Ig, immunoglobulina; IL, interleukina; LTR, długie powtórzenie końcowe; komórki NK, komórki NK; Białko NS, białko niestrukturalne; P1-2A, gen prekursora białka strukturalnego; P1-2A3C3D, wirusowy prekursor białka strukturalnego P1–2A i białka niestrukturalne 3C i 3D; PBMC, jednojądrzasta krew obwodowa; RT-PCR, reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; SAT, typ południowoafrykański; TGE, przejściowa ekspresja genów; TGF, czynnik wzrostu guza; TNF, czynnik martwicy nowotworu; komórki Th, komórki pomocnicze T; VP1, białko wirusowe 1; Komórki T δ, komórki T Gamma delta.

Oświadczenie o udostępnianiu danych

Dane wykorzystane w tym przeglądzie mają charakter drugorzędny i zostały uwzględnione w artykule.

Potwierdzenie

Jestem bardzo wdzięczny Biuru Wiceprezesa ds. Badań i Usług Społecznych Uniwersytetu w Gondar za dostarczenie materiałów i wsparcie finansowe. Dziękuję również Kolegium Medycyny Weterynaryjnej i Nauk o Zwierzętach Uniwersytetu Gondar za dodatkowe wsparcie placówki.

Finansowanie

Autor dziękuje University of Gondar, Research and Community Service wiceprezesowi biura.

Ujawnienie

Autor oświadcza, że ​​w tej pracy nie ma konfliktu interesów.

Bibliografia

1. Kitching P, Hammond J, Jeggo M i in. Globalna kontrola FMD — czy jest to możliwe? Szczepionka. 2007;25(30):5660–5664. doi:10.1016/j. szczepionka.2006.10.052

2. Raza S, Siddique K, Rabbani M i in. Patogeneza drobnoustrojów Analiza in silico czterech białek strukturalnych serotypów aftowirusów ujawniła istotne epitopy komórek B i T. Patog drobnoustrojów. 2019;128 (sierpień 2018):254–262. doi:10.1016/j.micpath.2019.01.007

3. Arzt J, Belsham GJ. Przenoszenie pryszczycy z trwale zakażonego bydła nosiciela na bydło naiwne poprzez przeniesienie płynu ustno-gardłowego. Świat weterynarza. 2018;3:318. doi:10.1128/ mSphere.00365-318

4. Arzt J, Pacheco JM, Stenfeldt C. Patogeneza zjadliwego i atenuowanego wirusa pryszczycy u bydła. Świat weterynarza. 2017;14:89. doi:10,1186/s12985-017-0758-759

5. Sobhy NM, Bayoumi YH, Mor SK, El-Zahar HI, Goyal SM. Ogniska pryszczycy w Egipcie: epidemiologia molekularna, ewolucja i znaczenie prognostyczne biomarkerów sercowych. Int J Vet Sci Med. 2018;6(1):22–30. doi:10.1016/j. tylko.2018.02.001

6. Senthilkumaran C, Yang M, Bittner H, et al. Wykrywanie genomu, antygenu i przeciwciał w płynach ustnych świń zakażonych wirusem pryszczycy. Can J Vet Res. 2017;81:82–90.

7. Paliński RM, Bertram MR. Pierwsza sekwencja genomu wirusa pryszczycy serotypu O podlinii Ind2001e z południowego Wietnamu. Ogłoszenie dotyczące zasobów mikrobiomu. 2019;8: e01424–18. doi:10.1128/mra.01424-1418

8. Pulido MR, Sobrino F, Borrego B i in. Atenuowany RNA wirusa pryszczycy z delecją w niekodującym regionie 3' może wywołać odporność u świń. J Wirol. 2009;83(8):3475–85. doi:10.1128/JVI.01836-08

9. Saravanan P, Iqbal Z, Selvaraj DPR, Aparna M, Umapathi V. Porównanie metod ekstrakcji chemicznej do oznaczania zawartości 146S w szczepionce z adiuwantem olejowym przeciw pryszczycy. J Appl Microbiol. 2019;1 (Rueckert 1985):1–9. doi:10.1111/jam.14465

10. Jamal SM, Belsham GJ. Pryszczyca: przeszłość, teraźniejszość i przyszłość. Weterynarz Rez. 2013;44(1):1–14. doi:10.1186/1297-9716- 44-116

11. Robinson L, Knight-Jones TJ, Charleston B i in. Globalna aktualizacja badań nad pryszczycą i analiza luk: 7 - patogeneza i biologia molekularna. Transbound Emerg Dis. 2016;63(1):63–71. doi:10.1111/tbed.12520

12. Sreenivasa BP, Mohapatra JK, Pauszek SJ i in. Rekombinowany ludzki adenowirus-5 wykazujący ekspresję białek kapsydu indyjskich szczepów szczepionkowych wirusa pryszczycy wywołuje skuteczną odpowiedź przeciwciał u bydła. Mikrobiol weterynaryjny. 2017;203:196–201. doi:10.1016/ j.vetmic.2017.03.019

13. Neilan JG, Schutta C, Barrera J i in. Skuteczność serotypów wirusa pryszczycy z wektorem adenowirusowym. Szczepionka podjednostkowa u bydła przy użyciu modelu transmisji przez bezpośredni kontakt. Rez. weterynarii BMC 2018;14(1):1–9. doi:10,1186/s12917-018- 1582-1

14. Pena L, Pires M, Koster M i in. Dostarczenie antygenu pustej podjednostki kapsydu wirusa pryszczycy wraz z białkiem niestrukturalnym 2B poprawia ochronę świń. Szczepionka. 2008;26 (45):5689–5699. doi:10.1016/j.szczepionka.2008.08.022

15. Barteling SJ, Cassim NI. Bardzo szybka (i bezpieczna) inaktywacja wirusa pryszczycy i enterowirusów przez połączenie binarnej etylenoiminy i formaldehydu. Dev Biol (Bazylea). 2004;119:449–455

16. Rweyemamu MM, Umehara O, Giorgi W, Medeiros R, Neto DL, Baltazar M. Wpływ formaldehydu i binarnej etylenoiminy (BEI) na integralność kapsydu wirusa pryszczycy. Wielebny Technik Nauki. 1989;8(3):747–764. doi:10.20506/rst.8.3.425

17. Patch JR, Kenney M, Pacheco JM, Grubman MJ, Golde WT. Charakterystyka funkcji cytotoksycznych limfocytów T po zakażeniu wirusem pryszczycy i szczepieniu. wirusowy immunol. 2013;26(4):239–249. doi:10.1089/vim.2013.0011

18. Rodriguez-Calvo T, Ojosnegros S, Sanz-Ramos M, Garcia-Arriaza J, Escarmis C, Domingo E, Sevilla N. Nowy projekt szczepionki oparty na wadliwych genomach, które łączą cechy szczepionek atenuowanych i inaktywowanych. PLoS Jeden. 2010;5(4):1–11. doi:10.1371/dziennik.pone.0010414

19. Núñez JI, Baranowski E, Molina N i in. Substytucja kwasowa w niestrukturalnym białku 3A może pośredniczyć w adaptacji wirusa pryszczycy do świnki morskiej. J Wirol. 2001. doi:10.1128/JVI.75.8.3977-3983.2001

20. Burman A, Clark S, Abrescia NGA i in. Swoistość pętli VP1 GH wirusa pryszczycy dla integryn v 6. J Wirol. 2006;80(19):9798–9810. doi:10.1128/JVI.00577-06

21. Dicara D, Burman A, Clark S i in. Wirus pryszczycy tworzy wysoce stabilny, odporny na EDTA kompleks ze swoim głównym receptorem, integryną v 6: implikacje dla zakaźności. J Wirol. 2008;82(3):1537–1546. doi:10.1128/JVI.01480-07

22. Domingo E, Sheldon J, Perales C i in. Ewolucja wirusowych quasigatunków. Microbiol Mol Biol Rev. 2012;76(2):159–216. doi:10.1128/MMBR.05023-11

23. Mckenna TS, Lubroth J, Rieder E i in. Wirus pryszczycy (FMD) z usuniętym miejscem wiązania receptora chroni bydło przed pryszczycą. J Wirol. 1995;69(9):5787–5790. doi:10.1128/jvi.69.9.5787-5790.1995

24. Dimarchi R, Brooke G, Gale C, Cracknell V, Doel T, Mowat N. Ochrona bydła przed pryszczycą przez syntetyczny peptyd. Nauka. 1986; 232:639–641. doi:10.1126/nauka.3008333

25. Gómez N, Salinas J, Escribano JM i in. Ochronna odpowiedź immunologiczna na wirusa pryszczycy z ekspresją VP1 w roślinach transgenicznych Ochronna odpowiedź immunologiczna na wirusa pryszczycy z ekspresją VP1 w roślinach transgenicznych. J Wirol. 1998;72:2–5.

For more information:1950477648nn@gmail.com