Gao-Zi-Yao poprawia funkcje uczenia się i pamięci u starych szczurów ze spontanicznym nadciśnieniem tętniczym, część 2

Zwierzęta doświadczalne

Dwunastomiesięczne i ośmiotygodniowe samce szczurów ze spontanicznym nadciśnieniem (SHR) zakupiono w Centrum Modeli Zwierzęcych w Nanjing.

Istnieje silny związek pomiędzy 8-tygodniowymi samcami a pamięcią. W tym okresie mózg samca rozwija się błyskawicznie, a połączenia między jego neuronami stopniowo się zwiększają, co z kolei wpływa na rozwój jego pamięci.

Badania pokazują, że pamięć samców poprawia się wraz z wiekiem. Ma to nie tylko istotny wpływ na ich przetrwanie i reprodukcję, ale także pomaga im lepiej przystosować się do środowiska i radzić sobie z nowymi wyzwaniami.

Dlatego powinniśmy aktywnie zachęcać młodych mężczyzn do udziału w różnorodnych pożytecznych zajęciach, takich jak rozwiązywanie zagadek, zdobywanie nowych umiejętności i odkrywanie nowych obszarów. Zajęcia te stymulują ich mózgi, pozwalając im na szybszy rozwój i poprawę zdolności zapamiętywania.

Jednocześnie powinniśmy zapewnić odpowiednie środowisko i atmosferę młodym samcom. Sprawienie, że poczują się bezpiecznie i blisko, może sprzyjać rozwojowi ich mózgu i poprawiać pamięć.

Krótko mówiąc, powinniśmy zrobić wszystko, co w naszej mocy, aby pomóc młodym mężczyznom poprawić ich pamięć, dzięki czemu staną się mądrzejszymi, pewniejszymi siebie i zdolnymi stworzeniami. Sprzyja to nie tylko ich rozwojowi osobistemu, ale także dobrobytowi i przetrwaniu całego gatunku. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche desericola może znacząco poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola ma działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwstarzeniowe, co może pomóc w zmniejszeniu reakcji oksydacyjnych i zapalnych w mózgu, chroniąc w ten sposób zdrowie układu nerwowego. Ponadto Cistanche Deserticola może również promować wzrost i naprawę komórek nerwowych, poprawiając w ten sposób łączność i funkcjonowanie sieci neuronowych. Efekty te mogą pomóc poprawić pamięć, uczenie się i szybkość myślenia, a także mogą zapobiegać rozwojowi dysfunkcji poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych.

Kliknij Poznaj suplementy, aby zwiększyć pamięć

W tym modelu nadciśnienie zaczyna rozwijać się w wieku 4 miesięcy, a zmiany związane z nadciśnieniem w mikrokrążeniu mózgu pojawiają się w wieku 6 miesięcy [37].

Szczury trzymano w nieoptymalnych warunkach, przy zachowaniu standardowej higieny, utrzymywano w temperaturze 25 stopni w cyklu światło/ciemność 12/12 i karmiono standardową karmą dla szczurów i wodą do woli.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt ustalonymi przez Uniwersytet Soochow, co jest zgodne z naszym poprzednim raportem[35].

Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (NIH, numer publikacji 85–23, poprawiona w 1996 r.). Wyniki niniejszego badania opisano w wytycznych ARRIVE.

Do kontroli starzenia zastosowano ośmiotygodniowe SHR (SHR-Young, n=10). Dwunastomiesięczne szczury leczono Gao-Zi-Yao lub bez niego w postaci wody destylowanej (Stare SHR-C, n=10), małej dawki (Stare SHR-L, n=10), średniej dawki (Stary SHR-M, n=10), duża dawka (Stary SHR-H, n=10) przez karmienie żołądkowe.

Dawki niskiego, średniego i wysokiego Gao-Zi-Yao równe 1/2-, 1-, trzykrotności dawek do stosowania u pacjentów klinicznych, obliczonych według powierzchni ciała. Gao-Zi-Yao przed aplikacją rozpuszczono w 5 ml wody destylowanej i podawano jednorazowy nabiał przez 4 tygodnie.

Ciśnienie krwi i tętno monitorowano co tydzień metodą mankietu ogonowego, a także co tydzień monitorowano masę ciała, zgodnie z wcześniejszą obserwacją [35].

Po 4 tygodniach przeprowadzono eksperyment z labiryntem wodnym Morrisa i szczury uśmiercono w znieczuleniu za pomocą pentobarbitalu sodu (50 mg/kg ip), po czym pobrano tkankę hipokampa do dalszej analizy. Wszystkie protokoły eksperymentów zostały zatwierdzone przez komisję ds. licencji etycznych Uniwersytetu Soochow.

Eksperyment z labiryntem wodnym Morrisa

Eksperyment z labiryntem wodnym Morrisa (BW-MWM101, Shanghai Bio-will Co., Ltd., Szanghaj, Chiny) przeprowadzono w sposób opisany wcześniej z pewnymi modyfikacjami [38]. Test zaplanowano na 6 dni, dni od 1 do 5 obejmowały okres szkoleniowy, a dzień 6 dotyczył wyników testowania.

Szczury trenowano przez 2 minuty na mleku, rejestrując czas wejścia na platformę jako czas utajenia. W dniu 6 platformę usunięto. Szczury umieszczono w najdalszym kwadrancie odległości i rejestrowano trajektorię pływania przez 2 minuty.

Parametry uczenia się i funkcji pamięci zostały obliczone przez oprogramowanie.

Pomiar poziomu NO i czynników zapalnych w surowicy metodą ELISA

Poziomy NO w surowicy (Nr katalogowy: S0023), IL-1 (Numer katalogowy: A301BH80153), IL-2 (Numer katalogowy: A31038348), IL-6 (Numer katalogowy: A30681042), i TNF- (numer katalogowy: A38280855) mierzono przy użyciu dostępnych w handlu zestawów ELISA (BiotechnologyCo., Ltd. Shanghai enzymatyczne badania. Szanghaj, Chiny). Wszystkie etapy przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta.

Barwienie Nissla

Wyizolowano tkankę hipokampa szczura, utrwalono, zatopiono w parafinie, a następnie inkubowano w 1% roztworze barwiącym błękitem toluidynowym przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Dziesięć skrawków przepłukano wodą destylowaną, namoczono w 95% etanolu przez 5–30 min i odwodniono w 100% etanolu.

Po odwodnieniu plasterek umieszczono w ksylenie i nakryto szkiełkiem nakrywkowym za pomocą żywicy. Liczbę neuronów w obszarach CA1, CA2 i zakrętu zębatego (DG) hipokampa obserwowano i analizowano przy użyciu programu analitycznego ImageJ.

Western blot dla białek związanych z uczeniem się i pamięcią

Western blot dla białek związanych z uczeniem się i pamięcią przeprowadzono zgodnie z opisem w naszym poprzednim raporcie, z pewnymi modyfikacjami [39].

Tkanki hipokampa homogenizowano za pomocą buforu RIPA (50 mmTris, 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, pH 7,0) zawierającego fluorek fenylomentanosulfonylu (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA). Homogenaty wirowano przy 12,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni.

Białka komórkowe rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeniesiono na błony PVDF (Hybond TM-ECL; AmershamPharmacia Biotech, Inc.). Błony blokowano w 5% odtłuszczonym mleku w PBS i 0,1% Tween-20w temperaturze pokojowej.

Bloty inkubowano następnie z przeciwciałami pierwszorzędowymi: przeciw receptorowi glutaminianu 1 (1:1000, Abcam, Inc., nr katalogowy: ab183797), przeciwciałem antyNMDAR2B (1:1000, Abcam, Inc., nr katalogowy: ab28373), anty-fosfo -Przeciwciało CaMKII (1:1000, Abcam, Inc., nr katalogowy: ab171095), przeciwciało Antifosfo-CREB (1:1000, Abcam, Inc., nr katalogowy: 32096) lub anty-GAPDH (Santa Cruz Biotech, Inc., Numer katalogowy: sc-47724).

Następnie błony inkubowano przez 1 godzinę z przeciwciałem wtórnym (przeciwciało przeciwkrólicze Ig-G skoniugowane z HRP, 1:2000, Abcam, Inc. Numer katalogowy: ab205718). Błony następnie trzykrotnie przemywano przez 15 minut przy użyciu TBS-T w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał przed inkubacją przez 1 minutę z odczynnikami chemiluminescencyjnymi (ECL, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA).

Ponadto, immunoreaktywne prążki wykryto za pomocą systemu analizy w żelu do elektroforezy (GL2200 Pro, Crestream Inc. USA). Intensywność prążków analizowano za pomocą oprogramowania Image J. Ilość białek docelowych normalizowano za pomocą ekspresji GAPDH [39].

Analiza statystyczna

Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie SPSS 18.0. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Dane grupowe analizowano przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu Studenta–Newmana–Keulsa. Jak wynika z poprzedniego raportu [35], wartość P < 0,05 uznano za statystycznie istotną.

Wyniki

Skurczowe ciśnienie krwi (SBP), częstość akcji serca i masa ciała pomiędzy młodym SHR i starym SHR

Yong SHR wykazywał niższe SBP w ciągu pierwszych dwóch tygodni w porównaniu ze starym SHR, a następnie wzrosło do zerowej różnicy między obiema grupami w późniejszych trzech tygodniach (ryc. 2A).

Wręcz przeciwnie, tętno nie różniło się między obiema grupami przez pierwsze dwa tygodnie, następnie młody SHR znacznie wzrósł w porównaniu ze starym SHR w późniejszych trzech tygodniach (ryc. 2B). Młody SHR przez cały okres obserwacji wykazywał niższą masę ciała w porównaniu ze starym SHR (ryc. 2C).

Parametry labiryntu wodnego Morrisa pomiędzy młodym SHR i starym SHR

Aby określić zdolność uczenia się i zapamiętywania zależną od hipokampa, przeprowadzono eksperyment z labiryntem wodnym Morrisa. Stary SHR wykazywał dłuższe opóźnienie ucieczki w ciągu pierwszych czterech dni w porównaniu z młodym SHR (ryc. 3A).

Czasy przekroczenia docelowego kwadrantu były krótsze u starszych SHR niż u młodych SHR (ryc. 3B).

Procent czasu spędzonego w kwadrancie platformy docelowej był krótszy w starym SHR w porównaniu z młodym SHR (ryc. 3C). Procent długości ścieżki w kwadrancie był również krótszy w starym SHR w porównaniu ze starym SHR (ryc. 3D). Wyniki te sugerują, że stary SHR ma upośledzenie funkcji poznawczych.

Liczba neuronów w hipokampie pomiędzy młodym SHR i starym SHR

Liczbę neuronów w różnych obszarach hipokampa zliczano za pomocą barwienia Nissla. Wyniki wykazały mniejszą liczbę neuronów w regionach CA1, CA2 i DG starego SHR w porównaniu z młodym SHR (ryc. 4).

Ekspresja białek związana z uczeniem się i pamięcią w hipokampie między młodym SHR i starym SHR

Wyniki analizy Western blot wykazały, że ekspresja białek związanych z uczeniem się i pamięcią (GluR1, NMDAR 2B, fosforylowany CaMK II i fosforylowany CREB) w starym hipokampie SHR była niższa niż w młodym hipokampie SHR (ryc. 5).

Wpływ Gao-Zi-Yao na SBP, tętno i masę ciała w starym SHR

Przeanalizowano wpływ Gao-Zi-Yao na SBP. Leczenie małą dawką Gao-Zi-Yao znacząco obniżyło SBP u starszych SHR od drugiego do czwartego tygodnia w porównaniu z kontrolną starszą grupą SHR, średnie i wysokie dawki Gao-Zi-Yao znacząco obniżyły SBP u starych SHR od pierwszego tygodnia do drugiego tygodnia czwarty tydzień w porównaniu z kontrolnym starym SHR (ryc. 6A). Wyniki te wskazują, że Gao-Zi-Yao wywiera działanie przeciwnadciśnieniowe w starszym SHR.

Porównaliśmy także dane dotyczące wpływu tętna i masy ciała Gao-Zi-Yaoon. Nasze dane wykazały, że przez cały okres obserwacji nie było znaczących różnic w częstości akcji serca i masie ciała pomiędzy wszystkimi grupami (ryc. 6B, C).

Wpływ Gao‑Zi‑Yao na poziomy NO, IL‑1, IL‑2 i TNF‑ w surowicy u osób w starszym wieku SHR

Leczenie średnimi i wysokimi dawkami GAO-ZIYAO zwiększyło poziomy NO w surowicy w porównaniu z poziomami w grupie kontrolnej SHR (ryc. 7A). Leczenie wszystkimi testowanymi dawkami GAO-ZI-YAO zmniejszyło poziomy IL-1, IL-2 w surowicy w porównaniu z poziomami w grupie kontrolnej SHR (ryc. 7B, C); jednak tylko wysoka dawka GAO-ZI-YAO obniżała poziom TNF- w surowicy (ryc. 7D).

Wyniki te pokazują, że GAO-ZI-YAO może regulować stres oksydacyjny i stany zapalne.

For more information:1950477648nn@gmail.com