Klonowanie genów, identyfikacja funkcjonalna, analiza strukturalna i ekspresyjna syntazy sacharozy z Cistanche Tubulosa

Abstrakcyjny:Syntaza sacharozy odgrywa kluczową rolę w szlaku metabolizmu cukrów roślinnych, katalizując wytwarzanie difosforanu urydyny (UDP)-glukozy, która służy jako bioaktywny donor glikozylu w różnych procesach metabolicznych. W tym badaniu sklonowano gen syntazy sacharozy o nazwie CtSusCistanche tubulosa, tradycyjna medycyna chińska znana z bogactwazawartość różnorodnych glikozydówna podstawie wyników analizy transkryptomu. Otwarta ramka odczytu CtSus miała długość 2 418 bp i kodowała 805 aminokwasów. Analiza sekwencji ujawniła konserwatywne domeny powiązane z rodziną roślinnej syntazy sacharozy zarówno w N-końcowych, jak i C-końcowych regionach białka CtSus. Analiza filogenetyczna wykazała, że ​​CtSus ma ścisły związek ewolucyjny zsyntazy sacharozyod innych roślin w tej samej kolejności. Funkcjonalną identyfikację CtSus przeprowadzono poprzez katalizę pełnokomórkową, sprzęgając z UGT71BD1, scharakteryzowanym enzymem glikozylotransferazą. Wyniki wykazały, że wprowadzenie CtSus znacząco zwiększyło stopień konwersji glikozylacji katalizowanej przez UGT71BD1. Rozpuszczalną ekspresję CtSus w Escherichia coli uzyskano dodatkowo stosując wektor ekspresyjny pCold™ TF. Test enzymatyczny in vitro wykazał aktywność CtSus w zakresie katalizowania tworzenia UDP-glukozy w obecności sacharozy i UDP. Wyniki ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym wykazały, że wzorce ekspresji genu CtSus w różnych częściach C. tubulosa i zawiesinowych hodowlach komórkowych C. tubulosa pod wpływem stresu suszy korelowały z wzorcami akumulacji obserwowanymi odpowiednio dla glikozydów fenyloetanolowych. Ponadto zbadano kluczowe aminokwasy i ich interakcje między enzymem a substratem w oparciu o przewidywanie struktury białek i wyniki dokowania molekularnego. Ogólnie rzecz biorąc, nasze odkrycia identyfikują syntazę sacharozy CtSus odpowiedzialną za dostarczanie aktywnego donora glikozylu UDP-glukozy podczas biosyntezy produktów glikozydowych w C. tubulosa, a także dostarczyły elementu genu, który można wykorzystać w konstrukcji szczepu inżynieryjnego do produkcji produktów glikozydowych.

Słowa kluczowe: Cistanche tubulosa; syntaza sacharozy; glikozydy; UDP-glukoza; kataliza enzymatyczna

DICHEN CISTANCHE UPRAWIA BAZY W YUTIAN, HOTAN, XINJIANG

Wsparcie dla Wecistanche – największego eksportera Cistanche w Chinach:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wightto wieloletnia zielna roślina pasożytnicza z rodzaju Cistanche z rodziny Orobanchaceae. Jest to tradycyjny, rzadki i cenny chiński materiał leczniczy, pochodzący z Xinjiangu i Mongolii Wewnętrznej. Ma charakter słodki, słony i ciepły i posiada funkcje:tonizujący Yang nerek, korzystna esencja i krewi nawilżanie jelit iłagodzący zaparcia. Jest znany jako „pustynny żeń-szeń[1]. Współczesne badania to wykazałyCistanche tubulosazawieraróżnorodne składniki chemicznejak na przykładglikozydy fenyloetanoidowe, irydoidowe terpeny eterowei ich glikozydy, lignany i ich glikozydy, estry oligosacharydów, polisacharydy, poliole, oligosacharydy, sterole i ich glikozydy, glikozydy monoterpenoidowe, cukry, aminokwasy i olejki lotne [2,3]Najważniejszymi składnikami aktywnymi są związki glikozydowe. Wśród nich związki glikozydowe fenyloetanoidowe charakteryzują się najwyższą zawartością w oryginalnym materiale leczniczym i wykazują szeroki zakres działania farmakologicznego, takiego jak neuroprotekcja i działanie przeciwstarzeniowe [4]. Biosynteza wyżej wymienionych związków glikozydowych obejmuje wiele etapów reakcji glikozylacji, które są katalizowane przezglikozylotransferazy w roślinach, orazdostarczanie aktywnych dawców glikozylujest niezbędna w tym procesie. Typowymi donorami aktywnego cukru w ​​organizmach są difosforan urydyny (UDP), difosforan tymidyny (TDP) i difosforan guanozyny (GDP). Wśród nich UDP-glukoza jest najpowszechniejszym aktywnym donorem glikozylu w roślinach. Może być nie tylko bezpośrednio rozpoznawany przez glukozylotransferazę w celu katalizowania reakcji przeniesienia glukozylu, ale także może być stosowany jako prekursor do udziału w syntezie innych typów donorów glikozylu. Na przykład UDP-glukozę można zastosować jako substrat do wytworzenia UDP-ramnozy w wyniku katalizy 4,6-dehydratazy, 3,5-izomerazy i 4-reduktazy[5]; UDP-glukozę można stosować jako substrat do katalizowania syntezy UDP-ksylozy poprzez dehydrogenazę UDP-glukozy i syntazę UDP-ksylozy; UDP-ksyloza może być dalej katalizowana przez epimerazę UDP-ksylozy w celu wytworzenia UDP-arabinozy [6]; UDP-glukoza i UDP-galaktoza są diastereoizomerami i mogą ulegać wzajemnemu przekształceniu poprzez epimerazę [7,8]. Dlatego synteza UDP-glukozy ma istotny wpływ na zaopatrzenie roślin w aktywne donory glikozylu i modyfikację glikozylacji metabolitów wtórnych.

Syntezę UDP-glukozy w roślinach można osiągnąć szlakiem syntazy, szlakiem fosforylazy i szlakiem kinazy. Wśród nich syntaza sacharozy może bezpośrednio katalizować reakcję pomiędzy UDP i sacharozą, tworząc UDP-glukozę i fruktozę, a także reakcję odwrotną [9]. W szerokim znaczeniu syntaza sacharozy należy do podrodziny glikozylotransferaz-4, która obejmuje różnorodne glikozylotransferazy, takie jak fosfataza syntezy sacharozy, syntaza trehalozy i fosforylaza trehalozy [10]. Syntazę sacharozy po raz pierwszy zidentyfikowano w kiełkach pszenicy [11]. Od tego czasu badacze zidentyfikowali setki genów syntazy sacharozy z różnych roślin, takich jak fasola mung (Vigna radiata), ryż (Oryza sativa), kukurydza (Zea mays), soja (Glycine max) i brzoskwinia (Amygdalus persica). Biorą udział w wielu procesach metabolicznych w roślinach, w tym w transporcie i dystrybucji sacharozy, syntezie skrobi, syntezie celulozy i składzie ścian komórkowych, stresie biotycznym i abiotycznym itp., a także odgrywają kluczową rolę regulacyjną w alokacji źródeł węgla w roślinach [12]. Dodatkowo, opierając się na badaniu funkcji fizjologicznych, badacze wykorzystali otrzymaną syntazę sacharozy również jako element genu do enzymatycznej syntezy związków glikozydowych i uzyskali idealne wyniki. Na przykład Masada i in. [13] dokonali jednoczesnej ekspresji genu syntazy sacharozy AtSus-1 z Arabidopsis thaliana i genu glikozylotransferazy CaUGT2 z Catharanthus Roseus in vitro i wykorzystali jednonaczyniowy podwójny układ enzymatyczny do katalizowania reakcji glikozylacji kurkuminy, co zwiększyło wydajność glikozydu kurkuminy 7-krotnie. Jednocześnie zastosowana ilość donora UDP-glukozy stanowiła tylko jedną dziesiątą początkowej ilości.

Bungaruang i in. [14] skonstruowali sprzężony układ katalityczny wykorzystujący syntazę sacharozy GmSuSy z soi i glikozylotransferazę OsUGT z ryżu. Osiągnęli modyfikację glikozylacji nothofaginy poprzez dodanie jedynie niewielkiej ilości UDP (1,0 mmol·L-1) i sacharozy. W porównaniu z katalizą pojedynczego enzymu OsUGT, wytwarzanie produktów glikozylacji wzrosło o trzy rzędy wielkości, z μmol·L-1 do mol·L-1.

Bogactwo i różnorodność związków glikozydowych w Cistanche tubulosa sugeruje, że powinna ona zawierać silną syntazę sacharozy związaną z modyfikacją glikozylacji metabolitów wtórnych, jednak enzym ten nie został dotychczas opisany w roślinach z rodzaju Cistanche. W niniejszej pracy jako materiał wykorzystano Cistanche tubulosa, materiał leczniczy objęty farmakopeą. Poprzez analizę transkryptomu i analizę porównawczą transkryptomu różnych części wykorzystano techniki biologii molekularnej do wydobycia i zidentyfikowania genu syntazy sacharozy CtSus. W celu zbadania funkcji CtSus i jego korelacji z suszą przeprowadzono analizę bioinformatyczną, biotransformację całych komórek, ekspresję i oczyszczanie prokariotów, analizę aktywności katalitycznej enzymów in vitro i analizę ekspresji genów w różnych częściach Cistanche tubulosa i systemach hodowli tkanek roślinnych pod wpływem stresu suszy. biosynteza związków glikozydowych u Cistanche tubulosa, kładąc podwaliny pod badania szlaku biosyntezy związków glikozydowych u Cistanche tubulosa.

Materiały i metody

Materiały Świeże rośliny Cistanche tubulosa zebrano z Hotan City w Xinjiang w Chinach, a identyfikację biologiczną przeprowadził profesor Tu Pengfei z Uniwersytetu w Pekinie; system hodowli komórek w zawiesinie Cistanche tubulosa został opracowany przez naszą grupę badawczą na wczesnym etapie [15]; E. coliFast-T1 zakupiono od Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.; E. coli BL21 (DE3) zakupiono od Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; Wektory pCold™ I i pCold™ TF zakupiono od Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.; Kontrolę UDP-glukozy zakupiono od Xi'an Qiyue Biotechnology Co., Ltd., a substraty eskuliny i resweratrolu zakupiono od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

DICHEN CISTANCHE UPRAWIA BAZY W HOTAN W XINJIANG

Ekstrakcja RNA i synteza cDNA RNA ekstrahowano zgodnie z instrukcjami zestawu OMEGA RNA Plant Kit (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). Do wykrywania czystości, stężenia i integralności RNA zastosowano elektroforezę w żelu agarozowym i spektrofotometr Nanodrop 2000. Kwalifikowane próbki RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji TransScript® OneStep gDNA Removal i cDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) w celu syntezy pierwszego łańcucha cDNA.

Wydobywanie genów syntazy sacharozy i klonowanie genów CtSus Jako matrycę wykorzystano sekwencję aminokwasową funkcjonalnie zidentyfikowanej syntazy sacharozy Arabidopsis thaliana AtSus1 (numer dostępu GenBank: AED92894.1)[16]. Geny syntazy sacharozy przeszukano na podstawie danych transkryptomu C. tubulosa poprzez lokalne dopasowanie sekwencji Blastp, w połączeniu z adnotacją genu transkryptomu, analizą FPKM (obfitość ekspresji genów) i porównawczą analizą danych transkryptomu. Specyficzne startery zaprojektowano w oparciu o informacje o sekwencji genu kandydata dostarczone przez dane transkryptomu drugiej generacji C. tubulosa (Tabela 1). Jako matrycę zastosowano cDNA C. tubulosa i przeprowadzono amplifikację PCR docelowego genu przy użyciu enzymu PCR o wysokiej wierności (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). Produkt amplifikacji PCR oczyszczono przy użyciu zestawu FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.), a następnie sklonowano zgodnie z zestawem do szybkiego klonowania (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) połączono z wektorem do klonowania pCE2 TA/Blunt-Zero zgodnie z instrukcją obsługi, przeniesiono do kompetentnych komórek Fast-T1 i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Plazmid wyekstrahowano i przesłano do Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. w celu identyfikacji sekwencjonowania.

Tabela 1. Sekwencja nukleotydowa starterów zastosowanych w tym badaniu. qPCR: ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym

Analiza bioinformatyczna syntazy sacharozy CtSus z Cistanche tubulosa

Do analizy właściwości fizykochemicznych białka wykorzystano oprogramowanie internetowe ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/). do przewidywania struktury transbłonowej białka wykorzystano oprogramowanie internetowe TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}}.0/); do przewidzieć drugorzędową strukturę białka; do przewidywania konserwatywnej domeny sekwencji aminokwasowej białka wykorzystano oprogramowanie internetowe SMART (http://smart.embl.de/); do porównania sekwencji aminokwasowych CtSus z sekwencjami syntaz sacharozy innych gatunków wykorzystano oprogramowanie DANMAN; Drzewo filogenetyczne skonstruowano poprzez analizę skupień, stosując metodę łączenia sąsiadów przy użyciu oprogramowania MEGA11, z powtórzeniem ładowania początkowego 1,000 razy.

Analiza ekspresji CtSus w różnych częściach Cistanche tubulosa i pod wpływem stresu suszy

Fluorescencyjne startery ilościowe PCR w czasie rzeczywistym dla CtSus i wewnętrznego genu referencyjnego DNAj zaprojektowano przy użyciu oprogramowania DNAMAN [17] (Tabela 1). Względny poziom ekspresji genu CtSus w komórkach zawiesinowych Cistanche tubulosa w różnych częściach Cistanche tubulosa i pod wpływem stresu suszy analizowano metodą ilościowej PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym. Ilościową analizę fluorescencji PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu zestawu TransStart® Top Green qPCR SuperMix Kit (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). W programie amplifikacji przyjęto metodę dwuetapową: 94 stopnie przez 30 s; 94 stopnie przez 5 s, 60 stopni przez 30 s, powtarzane przez 40 cykli; przeprowadzono go w systemie detekcji PCR w czasie rzeczywistym Bio-Rad CFX Connect™ (Bio-Rad Laboratory, Hercules, Kalifornia, USA). Do analizy względnej ekspresji genu CtSus w różnych grupach doświadczalnych wykorzystano metodę 2–ΔΔCT. Do analizy istotności i wykreślenia wykresu słupkowego wykorzystano program GraphPadPrism 9.

Konstrukcja prokariotycznego wektora ekspresyjnego i heterologiczna ekspresja genu CtSus Na podstawie wyników sekwencjonowania genów zaprojektowano specyficzne startery zawierające ramiona homologii wektora i miejsca restrykcyjne (Tabela 1) do amplifikacji PCR. Gen docelowy CtSus skonstruowano w wektorach ekspresyjnych pET-28a, pET-24b, pCold™ I i pCold™ TF przy użyciu technologii bezproblemowego klonowania przy użyciu zestawu do klonowania ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01 , Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.). Plazmidy pomyślnie skonstruowanych rekombinowanych wektorów ekspresyjnych ekstrahowano i transformowano do kompetentnych komórek ekspresyjnych Escherichia coli Transetta (DE3). Komórki hodowano w płynnej pożywce LB zawierającej 50 µg·mL-1 siarczanu kanamycyny (z pET-28a i pET-24b jako wektorami ekspresyjnymi) lub 1{{ 22}}0 µg·mL-1 ampicyliny (z pCold™ I i pCold™ TF jako wektorami ekspresyjnymi) i 50 ug·mL-1 chloramfenikolu, odpowiednio, w temperaturze 37 stopni i 200 obr./min{{ 15}}, wytrząsając, aż wartość A600 roztworu bakterii osiągnie 0.4-0.6. Dodać izopropylo-beta-Dtiogalaktopiranozyd (IPTG) w końcowym stężeniu 0,5 mmol·L-1 w celu indukcji ekspresji białka. Inkubować na wytrząsarce o stałej temperaturze w temperaturze 23 stopni (z pET-28a i pET-24b jako wektorami ekspresyjnymi) lub 15 stopni (z pCold™ I i pCold™ TF jako wektorami ekspresyjnymi), 180 r· min-1 przez 16 godzin (z pET28a i pET-24b jako wektorami ekspresyjnymi) lub 24 godziny (z pCold™ I i pCold™ TF jako wektorami ekspresyjnymi), następnie zebrać bakterie przez wirowanie.

Bufor do lizy (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0,5 mol·L-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} } imidazol, 3% glicerol, 100 mmol·L-1fluorek fenylometylosulfonylu, 1 mg·mL-1 lizozym, pH 7,4), komórki łamano przez 8 minut i odwirowywano. Pobrano odpowiednio supernatant i osad. Supernatant adsorbowano na kolumnie powinowactwa HisTrap FF (nr kat. 17531901, Cytiva) wypełnionej wypełniaczem Ni Sepharose 6 Fast Flow w celu adsorbowania docelowego białka zawierającego znacznik His. Po elucji imidazolem o różnych stężeniach, każdą frakcję wzięto do wykrywania SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu). Frakcje zawierające docelowe białko połączono, zatężono przez odwirowanie i odsolono w probówce ultrafiltracyjnej (Millipore) i przechowywano w buforze [zawierającym 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mol·L{{ 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 ditiotreitol, 3% glicerol] do kolejnych reakcji katalizy enzymatycznej in vitro.

Kataliza całokomórkowa CtSus Plazmid pCold™ I-CtSus i plazmid ekspresyjny pET-28a-UGT71BD1[18] glikozylotransferazy UGT71BD1, które zostały wcześniej zidentyfikowane przez grupę badawczą, zostały jednocześnie przekształcone w kompetentną ekspresję E. coli Transetta (DE3). Wyselekcjonowano pozytywne rekombinowane bakterie zawierające zarówno geny CtSus, jak i UGT71BD1 i zaszczepiono je do pożywki LB (pożywki wzrostowej) zawierającej 50 ug·mL-1 siarczanu kanamycyny, 100 ug ·mL-1 ampicyliny i 50 ug·mL-1 chloramfenikolu w stosunku 1:100 (V/V). Hodowlę hodowano w temperaturze 37 stopni, aż wartość A600 roztworu bakterii wyniosła 0,4-0,6, a następnie dodano IPTG w końcowym stężeniu 1 mmol·L-1. Hodowlę kontynuowano w temperaturze 15 stopni i 180 obr./min-1 przez 24 godziny. Hodowlę odwirowano przy 4 stopniach i 4 000 obr./min-1. Zbierz komórki. Zaszczepić zebrane komórki do pożywki M9 (pożywki fermentacyjnej) w proporcji 40 ml pożywki hodowlanej na gram bakterii i dodać 75 μmol·L-1 sacharozy i 25 μmol·L-1 eskuletyny (1) lub resweratrol (2) do grup reakcyjnych. Kontynuować wytrząsanie hodowli przez 24 h, wirować przy 4000 x g, 4 stopnie przez 30 min, dodać metanol w celu ultradźwiękowego rozbicia osadu, dodać 2-krotną objętość metanolu do supernatantu, wirować przy 4000 x g, 4 stopnie przez 30 min, pobrać supernatant i połączyć, odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, ponownie rozpuścić w metanolu, przesączyć przez membranę filtra 0,22 µm i wykryć produkt reakcji za pomocą wysokosprawnego chromatografu cieczowego Agilent 1260. Jako kolumnę analityczną zastosowano CAPCELL PAK C18 COLUMN (250 mm×4,6 mm, 5 µm), jako fazę ruchomą zastosowano 0,1% wodę kwasu mrówkowego (A) i metanol (B), a gradient elucji wynosił: {{61 }} min, 30%-90% B; 25-27 min, 90%-100% B; 27-33 min, 100% B. Parametry spektrometrii mas obejmowały tryb jonów dodatnich i ujemnych oraz automatyczne, wieloetapowe pełne skany MS1, MS2 i MS3.

Wykrywanie aktywności katalitycznej enzymu CtSus in vitro Rekombinowane białko otrzymane za pomocą wyżej wymienionej chromatografii powinowactwa na kolumnie HisTrap FF poddano końcowemu usunięciu znacznika przy użyciu czynnika Xa. System trawienia enzymatycznego był następujący: stężenie rekombinowanego białka doprowadzono do 1 mg·mL-1 i dodano 1 µl czynnika Xa do 50 µl rekombinowanego białka w buforze 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8,0), 100 mmol·L-1 NaCl i 2 mmol·L-1

CaCl2 w 23 stopniach przez 6 godzin. Układ reakcyjny zawierał 100 µl. Produkt układu trawienia enzymatycznego poddano wtórnemu rozdziałowi białek za pomocą chromatografii powinowactwa HisTrap FF w celu uzyskania docelowego białka z usunięciem znacznika do kolejnych reakcji katalizy enzymatycznej in vitro. Układ reakcji enzymatycznej był następujący: 10 mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 sacharoza, 50 mmol·L-1 MgCl2, 60 ug białka CtSus, Tris-HCl (pH 7.0) uzupełniony do 100 µl, poddano reakcji w łaźni wodnej w temperaturze 30 stopni przez 6 godzin, a metody obróbki końcowej i analizy HPLC przeprowadzono zgodnie z opisem w publikacji [19].

Do przewidywania trójwymiarowej struktury białka CtSus wykorzystano trójwymiarową analizę dokowania białka CtSus AlphaFold2 [20]. Cząsteczkę liganda uwodorniono i naładowano przy użyciu oprogramowania AutoDock Tools 1.5.6. Kieszeń wiążącą substrat uzyskano przez dopasowanie z białkiem matrycowym AtSus1 (PDBID 3S28). Łańcuchy boczne reszt aminokwasowych wokół wnęki ustawiono jako elastyczne.

Ramka siatki została ustawiona na 40 × 40 × 40 Å3, a odstępy siatki wynosiły 0,375 Å. Dokowanie molekularne przeprowadzono w programie AutoDock Vina [21]. Do wizualizacji modelu o największym powinowactwie wykorzystano program PyMOL 2.0 (kcat·mol-1

).

Analiza statystyczna Do analizy statystycznej wykorzystano program GraphPad Prism 9. Dane eksperymentalne wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe. Do porównania między dwiema grupami zastosowano test t, a do porównania między wieloma grupami zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji. Różnicę uznawano za istotną statystycznie, gdy P < 0,05.