Graham-2023-Nauka tworzy unikalny transkrypt

Abstrakcyjny:
Uczenie się może wywoływać plastyczność neurofizjologiczną w korze słuchowej w wielu skalach czasowych. Trwałe zmiany w funkcjonowaniu kory słuchowej, które utrzymują się przez kilka dni, tygodni, a nawet przez całe życie, wymagają ekspresji genów wywołanej uczeniem się. Rzeczywiście, transkrypcja de novo jest molekularnym wyznacznikiem tego, czy przejściowe doświadczenia przekształcają się w długotrwałe wspomnienia mające trwały wpływ na zachowanie.

Wraz z ciągłym rozwojem nauki i techniki w życiu człowieka pojawiło się wiele magicznych zjawisk życiowych, wśród których najcenniejszym dla badań jest pamięć. Pamięć jest ważną częścią zaawansowanej aktywności neuronalnej człowieka, a także zapisem i nagromadzeniem różnych wydarzeń, które miały miejsce od ewolucji człowieka. Czy istnieje zatem związek między ekspresją genów a pamięcią? Odpowiedź brzmi tak.

Po pierwsze, wpływ genów na pamięć jest oczywisty. Może regulować ekspresję różnych cząsteczek i białek związanych z pamięcią poprzez polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) i inne metody. Może to wpływać na efektywność komunikacji między neuronami, wpływając w ten sposób na cechy poznawcze, koncepcyjne, emocjonalne i inne danej osoby, wskazując na jakość pamięci.

Po drugie, pamięć może również mieć pewien wpływ na ekspresję genów. W procesie naszego uczenia się, zapamiętywania i myślenia chodzi nie tylko o zmiany w aktywności neuronowej mózgu, ale także o regulację i interwencję wielu genów i cząsteczek. Regulacja tych genów i cząsteczek spowoduje zapisanie śladów odpowiadających uczuciom i doświadczeniom istniejącym w naszej pamięci długotrwałej i ostatecznie zostaną zapisane w genach.

Wreszcie istnieje współzależność pomiędzy pozytywnym nastawieniem a zdolnością pamięci długotrwałej. Radosny nastrój może pomóc nam w większym skupieniu i koncentracji podczas procesu uczenia się i myślenia, pomagając w ten sposób poprawić zdolność pamięci. Długoterminowa pamięć celowa może również sprzyjać tworzeniu nowych połączeń i struktur neuronalnych w mózgu, co jest również bardzo pomocne w przyszłym uczeniu się i zapamiętywaniu.

Możemy zatem stwierdzić, że istnieje korelacja między ekspresją genów a pamięcią. Możemy promować i ulepszać naszą zdolność pamięci poprzez przemyślaną pamięć, optymizm i pozytywne myślenie, co może również pomóc nam osiągnąć lepsze zdrowie fizyczne i psychiczne. Tylko w ten sposób możemy lepiej służyć społeczeństwu i rozwojowi ludzkiemu. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche desericola może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche desericola to tradycyjny chiński materiał leczniczy, który ma wiele unikalnych efektów, z których jednym jest poprawa pamięci. Skuteczność mięsa mielonego wynika z różnych zawartych w nim składników aktywnych, w tym kwasów, polisacharydów, flawonoidów itp. Składniki te mogą na różne sposoby promować zdrowie mózgu.

Kliknij Poznaj suplementy poprawiające pamięć

Jednak geny kory słuchowej, które wspierają uczenie się słuchowe, pamięć i nabyte zachowania specyficzne dla dźwięku, są w dużej mierze nieznane. Raport ten jako pierwszy zidentyfikował obejmujące cały genom zmiany w ekspresji genów wywołanej uczeniem się w korze słuchowej, które uważa się za leżące u podstaw powstawania pamięci słuchowej. Analizy bioinformatyczne dotyczące profili wzbogacania genów na podstawie sekwencjonowania RNA pozwoliły zidentyfikować szlaki biologiczne obejmujące synapsy cholinergiczne i interakcje z receptorami neuroaktywnymi.

Odkrycia charakteryzują kluczowych kandydatów na efektory leżące u podstaw zmian w funkcjonowaniu kory mózgowej, które wspierają tworzenie długoterminowej pamięci słuchowej w mózgu dorosłego człowieka. Zidentyfikowane cząsteczki i mechanizmy stanowią potencjalne cele terapeutyczne ułatwiające długoterminowe i specyficzne dla dźwięku zmiany w funkcjach słuchowych w wieku dorosłym i są obecnie głównym przedmiotem przyszłych badań ukierunkowanych na geny.

Rękopis:

Dobrze przyjętą koncepcją w dziedzinie uczenia się i pamięci jest to, że wspomnienia są przechowywane tam, gdzie są przetwarzane (Nadel i Hardt, 2011). Zdarzenia biologiczne zwane konsolidacją pamięci mogą stabilizować przejściowe reprezentacje neuronowe wywołane doświadczeniem zmysłowym (Lechner, Squire i Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Podstawowymi i konserwatywnymi ewolucyjnie mechanizmami inicjującymi konsolidację pamięci są transkrypcja i translacja, definiowane odpowiednio jako aktywna ekspresja genów i ich kolejnych produktów białkowych (Alberini i Kandel, 2014; Costa-Mattioli i in., 2009).

Postawiliśmy hipotezę, że uczenie się dyskryminacji dźwiękowej indukuje ekspresję genów de novo w korze słuchowej. Wysoce specyficzne reprezentacje sygnałów dźwiękowych mogą przetrwać ulotność doświadczenia (sekundy i minuty), konsolidując się w pamięci długotrwałej (godziny lub dni), która później kieruje zachowaniem pod wpływem wskazówek dźwiękowych. Chociaż uważa się, że za konsolidację pamięci odpowiadają charakterystyczne regionalne profile transkryptomiczne (Katzman i in., 2021), zdarzenia transkrypcyjne wywołane uczeniem się, które wspierają tworzenie pamięci w centralnym układzie słuchowym, są znacznie niedostatecznie opisane.

Natomiast kora słuchowa została wyjątkowo dobrze opisana w badaniach uczenia się i pamięci słuchowej na poziomie zmian neurofizjologicznych, szczególnie w polach recepcyjnych i mapach tonotopowych (Schreiner i Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pieńkowski i Eggermont, 2011), kora słuchowa łączność korowo-korowo-fugalna (Souffi i in., 2021; Lesicko i Geffen, 2022; Schreiner i Polley, 2014; Liu i in., 2011; Xiong, Znamenskiy i Zador, 2015), w tym w wielu skalach czasowych (Froemke i Martins , 2011; Froemke i Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David i Shamma, 2007; Tchernichovski i Margoliash, 2013). Co więcej, zmiany neurofizjologiczne są powiązane z zachowaniem, np. z działaniem kierowanym na bodźce (Letzkus, Wolff i Lüthi, 2015), uwagą (Fritz i in., 2007; Elhilali i in., 2007) oraz pamięcią sygnałów dźwiękowych (Bieszczad i Weinberger 2010; Grosso i in., 2015; Aschauer i Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso i Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh i Zador, 2021).

Dziesięciolecia dowodów na neurofizjologiczną plastyczność kory słuchowej wywołaną uczeniem się wykazały wspólne cechy behawioralne pamięci słuchowej (Weinberger 2007a; 2007b), co czyni ją głównym obszarem kandydującym do konsolidacji pamięci słuchowej. Badając bioinformatycznie korę słuchową, wykorzystujemy również bezstronną możliwość odkrycia wspólnych lub odrębnych biologicznych strażników neuroplastyczności leżących u podstaw adaptacyjnej funkcji słuchowej w całym mózgu. Z szerszej perspektywy regionalne profilowanie transkryptomiczne może prowadzić do pełniejszego zrozumienia, w jaki sposób system sensoryczny jest modyfikowany przez doświadczenie w służbie pamięci.

Profile transkryptomiczne wywołane uczeniem się, zidentyfikowane w korze słuchowej, mogą potwierdzić, rozszerzyć lub prowadzić do nowych biologicznych modeli procesów, które wspierają lub upośledzają adaptacyjne przetwarzanie słuchowe. Konsolidacja pamięci słuchowej jest prawdopodobnie wynikiem zależnych od doświadczenia zmian w ekspresji genów, które wpływają na funkcje komórkowe w korze słuchowej, co z kolei sprzyja trwałym zmianom w neurofizjologicznej reakcji wywołanej dźwiękiem, która zmienia zachowania pod wpływem dźwięku.

Aby zidentyfikować transkrypty wywołane uczeniem się, przeprowadzono analizę profilowania ekspresji przy użyciu sekwencjonowania RNA (RNAseq) na próbkach anatomicznie określonej kory słuchowej (Bregma -3.10 mm, Interaural 6,90 mm; Paxinos i Watson, 2007 ) od dorosłych szczurów z ograniczonym dostępem do wody, przeszkolonych w wyciskaniu prętów do czystych tonów w celu uzyskania nagrody w postaci wody. Odpowiedzi na docelową częstotliwość czystego tonu (5,0 kHz; 65 dB SPL) skutkowały nagrodą, podczas gdy odpowiedzi na inną niż docelowa częstotliwość (11,5 kHz; 65 dB SPL) nie były nagradzane i inicjowały okres przerwy, który wydłużał czas do następnej próby.

To zadanie rozróżniania dwutonowego (2TD) nie jest trudne percepcyjnie; częstotliwości akustyczne są oddalone od siebie o ponad oktawę i są łatwo rozróżnialne przez gryzonie (Talwar i Gerstein, 1998). Wyzwanie behawioralne miało raczej charakter asocjacyjny: wydajność 2TD wymaga pamięci, w przypadku której ton jest powiązany z nagrodą (w porównaniu z brakiem nagrody). Wytrenowane szczury (N=8) uśmiercono po trzech kolejnych codziennych 45-minutowych sesjach treningowych 2TD i porównano z grupą dźwiękowo naiwnych szczurów (N=4). Jest to moment na początku szkolenia, kiedy zwierzęta wciąż opanowują zadanie 2TD. Celem wczesnej akwizycji zadań było uchwycenie początkowych zdarzeń transkrypcyjnych wywołanych uczeniem się, które przygotowały grunt pod późniejszy wzrost wydajności 2TD obserwowany w zachowaniu podczas tygodni szkolenia.

Na przykład średnia wydajność była powyżej przypadku, ale tylko 66±7,81% po 3 dniach, w porównaniu do większej lub równej 90% po dłuższym treningu (Shang, Bylipudi i Bieszczad, 2019). Aby wykorzystać okazję do zidentyfikowania ekspresji genów istotnych dla skutecznej pamięci asocjacyjnej specyficznej dla dźwięku, wykorzystaliśmy inhibitor HDAC, którego celem jest sepigenetyczna regulacja ekspresji genów zależnej od aktywności w uczeniu się i tworzeniu pamięci (McQuown i in., 2011; Kwapis i in. in., 2017; Malvaez i in., 2012). Co ważne, dekada prac wykazała, że ​​hamowanie HDAC może ułatwiać neurofizjologiczną plastyczność wywołaną uczeniem się w wywołanych dźwiękiem reakcjach kory słuchowej (w odniesieniu do pojazdu) i wzmacniać słuchowe zachowania dyskryminacyjne (Bieszczad i in., 2015; Phan i in., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo i Bieszczad, 2020; Rotondo i Bieszczad 2021a; 2021b), w tym nieludzi (Gervain i in., 2013).

Połowę wyszkolonych zwierząt leczono inhibitorem HDAC, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, nr kat.A8803; wstrzyknięcie podskórne) , podczas gdy druga połowa była identycznie przeszkolona, ​​ale podano roztwór nośnika (N=4; dopasowana objętość, wstrzyknięcie sub. cu.; Ryc. 1a). W momencie gromadzenia danych mózgowych nie było różnic w wynikach 2TD pomiędzy grupami (RGFP966: 61±5,0% w porównaniu z pojazdem: 71±7,0%; t(5,9166)=-1.21, p=0.272 ;test t Welcha). Mózgi natychmiast pobrano i szybko zamrożono w punkcie czasowym odpowiadającym maksymalnemu stężeniu inhibitora w korze słuchowej, godzinę po wstrzyknięciu po sesji inhibitora HDAC lub nośnika (Bieszczad i in., 2015).

Przedstawione tu odkrycia są pierwszymi, które identyfikują profil transkryptomiczny uczenia się skojarzeniowego w korze słuchowej. Uczenie się w zadaniu dyskryminacji dwutonowej wywołało zmiany w poziomach transkrypcji setek genów (w porównaniu do naiwnych dźwiękowo) (ryc. 1b). Algorytm grupowania hierarchicznego wykazał, że geny podlegają wyjątkowej regulacji w górę lub w dół, ujawniając złożoną sieć zdarzeń związanych z ekspresją genów w korze mózgowej indukowanych przez uczenie się słuchowe (ryc. 2a).

Analizy wzbogacania (iPathwayGuideTM; metoda analizy wpływu) zidentyfikowały synapsę cholinergiczną (geny o zróżnicowanej ekspresji (DEG) / wszystkie geny (ALL): 22/101; p=0.004, korekcja Bonferroniona) jako główny szlak biologiczny (Tabela 1) . Wynik ten jest zgodny z badaniami prowadzonymi od lat 90. XX wieku, które podkreślały wystarczalność sygnalizacji cholinergicznej w korze słuchowej dla plastyczności neurofizjologicznej i powiązanych zachowań słuchowych (Froemke i Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin i Weinberger, 1996; Kilgard i Merzenich, 1998). Poziomy transkryptu indukowane przez uczenie się pod hamowaniem HDAC zostały albo wzmocnione w tym samym kierunku (przez dalszy wzrost lub dalsze zmniejszenie poziomów unikalnych transkryptów genów) (ryc. 2b) lub stępione w porównaniu z samym uczeniem się (ryc. 2c). Jedną z głównych ścieżek biologicznych w tych warunkach była interakcja neuroaktywny ligand-receptor (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; tabela 1), która obejmowała efektory kluczowe dla aktywacji neuronów.

Innym najważniejszym szlakiem była interakcja receptor macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM-receptor) (DEG/ALL: 14/69; p=0,04; Tabela 1). Składniki ECM mają kluczowe znaczenie dla plastyczności kory i konsolidacji pamięci (Happel i in., 2014; Banerjee i in., 2017; El-Tabbal i in., 2021; Sonntag i in., 2015). Ścieżki te oferują potencjalne alternatywy, być może uzupełniające, dla sygnalizacji cholinergicznej, które mogą ułatwić trwałe, zależne od doświadczenia zmiany w funkcji słuchowej (Ji, Gao i Suga, 2001; Luo i Yan, 2013; Metherate, 2011). Inne geny, których ekspresja zmieniała się wraz z uczeniem się słuchowym, ale nie dalej w wyniku hamowania HDAC, były prawdopodobnie związane z warunkami proceduralnymi zadania, a nie z pamięcią skojarzeniową specyficzną dla dźwięku. Zidentyfikowano na przykład szlak sygnalizacyjny apeliny (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), który jest ważny w mózgu dla homeostatycznej regulacji spożycia wody (Hu i in., 2021). Bezpośrednie porównanie poziomów transkryptów pomiędzy dwiema grupami wyszkolonych szczurów (uczących się z hamowaniem HDAC lub bez) wykazało bardzo niewiele genów o unikalnej, zróżnicowanej ekspresji (DEG).

Próg znacząco zastosowany do identyfikacji najbardziej prawdopodobnych DEG (p =0.05) wykazał, że tylko Adamts13, U6, Rexo4 i Cabin1 uległy zróżnicowanej ekspresji (ryc. 2d). Zatem wydaje się, że główny efekt hamowania HDAC modulować ekspresję genów indukowaną przez uczenie się słuchowe w normalnych warunkach, zamiast rekrutować na nowo unikalne geny w celu zachowania pamięci specyficznej dla dźwięku. Łącznie odkrycia te pokazują, że zmiany transkryptomiczne na dużą skalę zachodzą w korze słuchowej na początku szkolenia, gdy dorosłe zwierzęta uczą się rozróżniać relacje skojarzeniowe między sygnałami dźwiękowymi. Wraz z ustalonymi raportami neurofizjologicznymi i behawioralnymi dotyczącymi hamowania HDAC w celu promowania funkcji słuchowych, odkrycia te potwierdzają taktykę stosowania inhibitora HDAC w celu rozróżnienia genów, których ekspresja determinuje powodzenie tworzenia pamięci słuchowej.

Z analiz wzbogacania szlaków biologicznych wybrano kilka interesujących genów (GOI) w celu walidacji sekwencjonowania całego genomu przy zastosowaniu podejścia ukierunkowanego na geny. Próbki pobrano z oddzielnych kohort, które replikowały dwie grupy wytrenowanych i leczonych zwierząt na tym samym początku. punkt czasowy szkolenia (tj. jedna godzina po trzeciej sesji szkoleniowej 2TD) do wykorzystania w analizie ekspresji genów z wykorzystaniem ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Nie stwierdzono różnic w wynikach 2TD w kohortach z powtórzonymi replikami (RGFP9661: 61±5,0% vs. RGFP9662: 67±6,0%; t(8,441)=-0.834, p {{20}}.4274; i pojazd 1:71±6,0% w porównaniu z pojazdem2: 74±3,0%; t(4,0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; test t Welcha).

Pierwszym GOI był Egr1, dobrze zbadany, zależny od aktywności „gen natychmiastowo-wczesny”, o którym wiadomo, że osiąga szczyt w pierwszych godzinach uczenia się i ma kluczowe znaczenie dla tworzenia pamięci (Duclot i Kabbaj, 2017). Był to gen wywołany toplearningiem z potwierdzoną zwiększoną ekspresją, który został również amplifikowany poprzez hamowanie HDAC w oddzielnej kohorcie zwierząt w badaniu ukierunkowanym na geny (ryc. 3). To samo dotyczyło Per2, genu zaangażowanego w regulację rytmów dobowych i szlaków serotoninergicznych w mózgu (Bae i in., 2001; Albrecht i in., 2001; Cuesta i in., 2009; Reh i in. ,2020). Per2 należy do rodziny „genów zegarowych”, która została powiązana z modulacją HDAC w innych obszarach mózgu (Kwapis i in., 2018) i może również odgrywać rolę w funkcjonowaniu słuchowym (Reh i in., 2020). Natomiast w przypadku niektórych rządów Indii zidentyfikowanych w całym genomie potwierdzono jedynie częściowo.

Chrna7 koduje podjednostkę dynamicznego nikotynowego receptora acetylocholiny (nAChR), która, jak stwierdzono, ulega obniżeniu wraz z uczeniem się słuchowym, zgodnie z dowodami neurofizjologicznymi (Takesian i in., 2018; Kuchibhotla i in., 2017). Zatem spodziewaliśmy się, że badanie ukierunkowane na geny potwierdzi regulację w dół Chrna7 u wszystkich zwierząt wytrenowanych 2TD, ale regulacja w dół była widoczna tylko u zwierząt leczonych w nośniku, które nauczyły się 2TD bez hamowania HDAC. Dodatkowe wybrane GOI pochodziły z rodziny sierocych receptorów jądrowych Nr4a, Nr4a1 i Nr4a2, które według doniesień są bezpośrednio wczesnymi genami niezbędnymi do rozprzestrzeniania dalszych skutków selektywnego celu HDAC RGFP966 w innych obszarach mózgu (McQuown i in., 2011; Kwapis i in. ., 2019).

Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami na temat zależnych od zadań różnic regionalnych w ekspresji genów rodziny Nr4a (McNulty i in., 2012), ekspresja Nr4a1, ale nie Nr4a2, uległa zwiększeniu w korze słuchowej po uczeniu się słuchowym. Inne DEG, Htr1a lub Adamts13, nie zostały potwierdzone w badaniu ukierunkowanym na geny, prawdopodobnie z powodu różnic w znanych wariantach transkryptu niewykrytych przez nasze specjalnie zaprojektowane sondy nakierowane na geny lub z powodu błędu typu I lub subtelnych różnic w zachowaniu pomiędzy wyszkolonymi kohortami zwierząt, które nie został wykryty w pomiarach wydajności 2TD. Zbadaliśmy także Lynx1, gen o długiej historii funkcji ponownego otwierania plastyczności podobnej do „okresu krytycznego” w korze czuciowej (Morishita i in., 2010), prawdopodobnie poprzez jego działanie na modulację cholinergiczną i serotoninergiczną (Takesian i in. , 2018). Jednak zgodnie z wcześniejszymi raportami dotyczącymi całego genomu, w których nie udało się wykryć (Kalish i in., 2020), nie wykryto go ani w naszym zestawie danych RNAseq, ani w badaniu ukierunkowanym na geny.

Choć wyzwaniem pozostaje ustalenie, czy rozbieżności można wyjaśnić rzeczywistą zmiennością biologiczną lub indywidualną między zwierzętami, czy też zmiennością techniczną związaną z niską liczebnością lub transkryptami wykazującymi ekspresję specyficzną dla typu komórki, przedstawiamy wyjątkowo spójne wyniki w przypadku niektórych rządów Indii. Ponieważ wywołana uczeniem się ekspresja Chrna7, Egr1 i Per2 jest spójna w podejściu ukierunkowanym na geny i w podejściu obejmującym cały genom oraz pomiędzy różnymi kohortami wyszkolonych zwierząt, oczywiste jest, że geny te mogą odgrywać kluczową rolę w trwałych zmianach w organizmie. funkcji słuchowych i pamięci i są obecnie głównym przedmiotem przyszłych badań.

Łącznie odkrycia ujawniają dynamiczny krajobraz transkrypcyjny w korze słuchowej dorosłego, który może wspierać pojawiające się funkcje słuchowe w neurofizjologii i zachowaniu. Biorąc pod uwagę rosnącą liczbę dowodów na epigenetyczną kontrolę funkcji układu sensorycznego (por. Shang i Bieszczad, 2022), ekscytujące jest rozważenie jak mechanizmy epigenetyczne odgrywają rolę w równoważeniu stabilności z zależną od doświadczenia plastycznością słuchowych obwodów korowych. Na przykład w bieżącym zestawie danych obejmującym cały genom zidentyfikowano również wywołane uczeniem się zmniejszenie ekspresji arepresyjnej deacetylazy histonowej, Hdac9, której nie było w przypadku hamowania HDAC.

Kuszące jest porównanie efektu zmniejszonej ekspresji HDAC9 z efektem farmakologicznego hamowania HDAC w celu promowania transkrypcji indukowanej uczeniem się. Inna ważna klasa regulatorów epigenetycznych zmienia raczej DNA niż histony. Przykładami są Tet1 i Gadd45b, które wpływają na metylację DNA (Bayraktar i Kreutz, 2018) i stwierdzono, że ulegają odpowiednio obniżeniu i zwiększeniu wraz z uczeniem się pod wpływem hamowania HDAC. Co więcej, klasa mikroRNA okazała się najważniejszym szlakiem biologicznym indukowanym przez uczenie się z hamowaniem HDAC (patrz tabela 1), które zyskały popularność w terenie jako kluczowe epigenetyczne regulatory kontroli transkrypcji nerwowej (Saab i Mansuy, 2014). Prawdopodobne są również interakcje molekularne wyższego rzędu między graczami epigenetycznymi a produktami białkowymi genów ulegających ekspresji. Na przykład zidentyfikowany, regulowany w górę Egr1 może rekrutować Tet1 w celu usunięcia represyjnych śladów metylacji w celu aktywacji dalszych genów (Sun i in., 2019). Konieczne będą dalsze badania molekularne, aby określić znaczenie interakcji między regulatorami epigenetycznymi w układzie słuchowym podczas uczenia się. Co więcej, raport ten stwarza bezpośrednią okazję do ustalenia powiązań między wybranymi genami kory słuchowej a ich dalszymi efektorami.

Wypełnienie luki pomiędzy tymi genami i cząsteczkami, mającymi wpływ na ich wpływ na zdarzenia neurofizjologiczne wywołane dźwiękiem, jest niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób układ słuchowy osoby dorosłej dostosowuje się pod wpływem doświadczenia do zmiany zachowania. Rzeczywiście, tłumaczenie transkrypcji de novo jest wymagane w przypadku długoterminowych zmian funkcji behawioralnych, ponieważ powodują one trwałe zmiany w funkcjach komórkowych. Na przykład kluczowe docelowe efektory procesów transkrypcyjnych wywołanych uczeniem się mogą zmieniać dostępność kanałów lub receptorów (Metherate, Intskirveli i Kawai, 2012; Brown i Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao i Tzounopoulos, 2023) w obwodach, które determinują dźwięk- próg wywołany, responsywność i architektura pola recepcyjnego w układzie słuchowym. Rozsądnie jest założyć, że różne zadania słuchowe rekrutowałyby unikalne sieci genów dla szlaków biologicznych istotnych dla poszczególnych funkcji komórkowych, które wspierałyby uczenie się w zakresie cechy dźwiękowej lub struktury zadania istotnej dla zadania.

Ogólnie rzecz biorąc, raport ten służy jako punkt wyjścia do udostępnienia zbiorów danych RNAseq z kory uczącej się, osoby dorosłej i kory słuchowej (patrz Repozytorium danych). Próba zmniejszenia luki w wiedzy pogłębionej przez poważny brak badań skupiających się na molekularnych procesach genetycznych w korze słuchowej dorosłych jest obecnie mile widziana. Zachęcamy do badań wykraczających poza czasoprzestrzenne ograniczenia masowego sekwencjonowania RNA, którego czułość jest technicznie ograniczona również głębokością odczytu (Li& Wang, 2021), zwłaszcza że nowoczesne technologie omiczne szybko ewoluują i ulepszają.

Chociaż badania nad korą słuchową poczyniły pewne wstępne postępy w genetyce molekularnej, które zidentyfikowały niezbędne kaskady molekularne (Schicknick i in., 2008), permisywne profile IEG (Mello, Velho i Pinaud, 2006; de Hoz i in., 2018 ; Peter i in., 2011), a nawet dynamiki chromatyny (Peter i in., 2021), istnieje precedens na peryferiach słuchowych, gdzie pięknie bada się dynamikę transkrypcji (Kwan, 2016; Barta i in., 2018; Li i in. in., 2020; Ebeid i in., 2017). Istniejące narzędzia molekularne, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (RNA-Seq) i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ małych cząsteczek (smFISH), będą przydatne do zapewnienia wglądu w zależne od doświadczenia zmienności między komórkami oraz interakcje molekularne w komórkach i obwodach kory słuchowej. W przeciwieństwie do masowego RNAseq, metody te uwzględniają głęboką różnorodność komórkową i organizację wyższego rzędu w korze słuchowej, taką jak mikroobwody specyficzne dla warstw i topografia lemniskalna.
Sprytne podejście do znakowania i sekwencjonowania transkryptów tylko z niedawno aktywnych komórek kory słuchowej (Cho, Huang i Gray, 2016) może zwiększyć czułość na tyle, aby uzyskać najbardziej funkcjonalnie istotne zestawy genów z najbardziej funkcjonalnie istotnych typów komórek i populacji. Podobne podejścia można zastosować również w obszarze podkorowym, aby uchwycić i porównać zależne od aktywności regionalne profile transkryptomiczne w korze, które honorują niesamowitą integrację funkcji korowej z podkorową układu słuchowego w różnych warunkach słuchania lub wymaganiach behawioralnych. Pełne scharakteryzowanie komórkowych i regionalnych różnic w mechanizmach genetycznych i molekularnych leżących u podstaw uczenia się słuchowego w mózgu dorosłego człowieka ma ogromne znaczenie dla opracowania precyzyjnych terapii selektywnych miejscowo i molekuł, które umożliwią solidne i trwałe zmiany funkcjonalne w celu wspierania określonych zdolności słyszenia i słuchania przez cały okres życia.

Metody

Uczestnicy: W sumie 24 dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (250–300 g w chwili przybycia; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) wykorzystano w eksperymentach behawioralnych i molekularnych. Wszystkie zwierzęta trzymano indywidualnie w pomieszczeniu kolonijnym o kontrolowanej temperaturze (24˚C) z cyklem światło/ciemność wynoszącym 12-godzinę. Przed treningiem behawioralnym badani mieli swobodny dostęp do pożywienia i wody. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Rutgers, State University of New Jersey (Protokół nr: 999900026 (KMB)).

Aparat behawioralny i bodźce dźwiękowe: Wszystkie sesje behawioralne przeprowadzono w dwóch identycznych komorach do kondycjonowania instrumentalnego (H{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) w wygłuszonym pudełku. Codzienne sesje szkoleniowe były zrównoważone, aby zapewnić równą ekspozycję na obie komory. Każda komora (12" szer. x 10" gł. x 12" wys.; podłoga z siatki drucianej była wyposażona w dźwignię reakcji (H21-03R), oświetlenie domu (H11-01R), głośnik (H{ {8}}R) i system dostarczania wody (H14-05R). Podczas faz treningu zwierzęta mogły wcisnąć dźwignię reakcji („barpress”), co powodowało podanie kubka z wodą (~0,02 cm3). w porcie nagrody (1,25" szer. x 1,625" wys.). Podczas wczesnej sesji użyto przełącznika ręcznego (H21-01), aby ukształtować reakcję zwierzęcia na naciśnięcie drążka, aby wywołać prezentację kubka z wodą, co umożliwiło dostęp do nagroda wodna.Reakcje behawioralne rejestrowano przy użyciu oprogramowania Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) do analizy offline.

Wszystkie bodźce słuchowe wygenerowano przy użyciu oprogramowania Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, Floryda) i RPvdsEx i zaprezentowano za pośrednictwem głośnika montowanego na ścianie komory operacyjnej. Biały szum (podczas treningu proceduralnego; rys. 1a) był prezentowany przez 7 lub 9 s (75 dB SPL). Czyste tony (podczas treningu rozróżniania dwutonowego; rys. 1a) były zawsze prezentowane przez 8 s (70 dB SPL). Poziomy dźwięku kalibrowano codziennie przy użyciu cyfrowego miernika dźwięku (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Trening behawioralny i farmakologiczne hamowanie HDAC3: Po jednym dniu aklimatyzacji w wiwarium szczury trzymano codziennie przez co najmniej 3 dni. Przed rozpoczęciem treningu behawioralnego szczury otrzymywały ograniczoną ilość wody aż do osiągnięcia 85% nieograniczonej masy zwierząt kontrolnych w tym samym wieku. Następnie szczury z ograniczoną ilością wody ukształtowano w komorach tłumiących dźwięk, aby tłoczyły się w celu uzyskania nagrody w postaci wody (ryc. 1a). Kształtowanie barpressa i późniejszy trening dźwiękowy przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (Shang, Bylipudi i Bieszczad, 2019). W skrócie, wszystkie zwierzęta przez 5 dni kształtowano tak, aby barpress był wykonywany, a następnie trenowano je w ramach zadania proceduralnego, aby nauczyć się wyciskania barpressa w rytm dźwięku, co w tej fazie był szerokopasmowym bodźcem w postaci szumu Gaussa (1-12,5 kHz biały szum filtrowany środkowoprzepustowo; 75 dB SPL), w celu uzyskania nagrody wodnej. Wszystkie zwierzęta z powodzeniem nauczyły się kojarzyć ten dźwięk z nagrodą przed przejściem do następnej fazy szkolenia. Szkolenie proceduralne wykazało indywidualną zmienność szybkości, z jaką zwierzęta mogły nauczyć się zadania, aż do osiągnięcia wysokiego poziomu wydajności. Niemniej jednak wszystkie zwierzęta były w stanie osiągnąć poziom wydajności większy lub równy 90% przez dwa kolejne dni (średnia=92,85%, sem =0,01%) po średnio 12,67 dniach ( SD=2.85 dni). Wydajność obliczono przy użyciu 100%.

Kolejną fazą szkolenia było zadanie dyskryminacji dwutonowej (2TD) (ryc. 1a), podczas którego szczury szkolono w zakresie rozróżniania dwóch widmowo różnych częstotliwości dźwięku. Naciśnięcia taktu do tonu S+ (5,0 kHz; 70 dB SPL) skutkowałyby prezentacją nagrody wodnej, podczas gdy naciśnięcia taktu do kamienia (11,5 kHz; 70 dB SPL) skutkowałyby sygnałem błędu (miganie domu światło) i „time-out” (dodatkowe 6 s oczekiwania na rozpoczęcie kolejnej próby). Próby S+ i S-S były randomizowane i trwały 8 s. Odstępy między próbami (ITI) trwały średnio 15 s (zakres: 5-25 s, randomizowane). Naciski barowe podczas cichego ITI były nieistotne (brak przekroczenia limitu czasu, brak sygnału błędu lub nagroda w postaci wody). Codzienne sesje trwały 45 minut. Wszystkie zwierzęta wykonywały zadanie 2TD łącznie przez trzy kolejne dni. Szczury zostały sparowane przez przeszkolonego obserwatora, tak aby zwierzętom o podobnym wskaźniku wykonywania zadań proceduralnych przydzielono różne warunki leczenia w fazie 2TD. Pary o dobranych parametrach otrzymywały ogólnoustrojowe zastrzyki inhibitora HDAC3 klasy I farmakologicznej RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12) lub roztworu nośnika (N=9) bezpośrednio po każdym Sesja 2TD. Wydajność zadania 2TD obliczono w sposób opisany wcześniej: 100% (Shang, Bylipudi i Bieszczad, 20).

Pobieranie tkanek i izolacja RNA: Godzinę po tym, jak zwierzęta otrzymały trzecią i ostatnią iniekcję RGFP966 po trzeciej sesji 2TD, mózgi szybko wypreparowano i szybko zamrożono w zlewce z 2-metylobutanem umieszczonej na suchym lodzie. Zamrożone mózgi następnie przechowywano w temperaturze -80˚ C do przyszłego przetwarzania. Aby przygotować mózgi do kriosekcji, mózgi otaczano związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowywano w temperaturze -20˚ C przez 12-24 godzin, aby mieć pewność, że tkanka mózgowa osiągnie -20˚ C do cięcia. Mózgi zamknięte w OCT następnie pocięto poziomo w kriostacie (Leica CM 3050S) o grubości 250 µm. Za pomocą mikronakłucia tkanki okrągłej o średnicy 1 mm pobrano 2 mm3 tkanki kory słuchowej z każdej półkuli (połączonej w jedną próbkę, w sumie 4 mm3 na obszar mózgu) w celu ekstrakcji RNA. Lokalizacja kory słuchowej została zidentyfikowana przy użyciu pracy Paxinosa i Watsona The Rat Brain in Stereotaxic Cooperatives (wydanie 6) jako odniesienia (w przybliżeniu A/P=-3,6 do -5,8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4,2 do -5,8 mm oraz hipokamp jako punkt orientacyjny

Całkowity RNA z każdej próbki wyizolowano przy użyciu zestawu PureLinkTM RNA Mini Kit (ThermoFisher) zgodnie z protokołem producenta. Próbki RNA następnie oczyszczono za pomocą zestawu RNA Clean andConcentratorTM -25 (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8) biblioteki do sekwencjonowania wygenerowano przy użyciu zestawu Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit zgodnie z protokołami zalecanymi przez producenta. Biblioteki połączono i sekwencjonowano na Illumina NovaSeq 6000 z SBSchemistry o sparowanych końcach o długości 100 bp. Odczyty przetwarzano za pomocą potoku informatycznego typu open source „bcbio-nextgen.py”, opracowanego głównie w Harvard Chan Bioinformatics (wersja 1.2.4) działającego w oparciu o Argon HPCresource na Uniwersytecie Iowa. Ten rurociąg obejmuje podejścia „najlepszych praktyk” w zakresie kontroli jakości odczytu, wyrównania odczytu i oznaczania ilościowego. Potok „bcbio-nextgen.py” został uruchomiony w trybie „RNA-seq” z kluczem „rn6” jako wybraną kompilacją genomu (wewnętrznie odwołującą się do złożenia Ensembl i genebuildu „Rnor_6.0”). Dopasowany potok dokonuje odczytu genomu Rnor_6.0 przy użyciu ultraszybkiego algorytmu wyrównywania hisat2 (2.2.1) obsługującego sploty i jednocześnie dokonuje ilościowego odczytu transkryptomu przy użyciu algorytmu wyrównywania „łososiowego” (1.4.0). Do sprawdzenia odczytanych danych w celu kontroli jakości wykorzystano Qualimap (2.2.2), narzędzie obliczeniowe sprawdzające pliki wyrównania BAM hisat2. Wyniki jakości sekwencji przeszły podstawowe kontrole, a współczynniki duplikacji sekwencji mieściły się w dopuszczalnych parametrach. Wszystkie próbki przeszły kontrolę jakości w celu dopasowania odczytu do regionów eksonowych. Oznaczenia ilościowe transkryptów pochodzących z łososia (TPM lub „transkrypty na milion”) zostały zaimportowane i podsumowane do szacunkowych zliczeń na poziomie genu przy użyciu tximport (1.12.3) w Rstudio, jak opisano w najlepszym- praktykuje winietę DESeq2 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Geny z liczbą szacunkową mniejszą niż 5 we wszystkich próbkach zostały wstępnie odfiltrowane z dalszej analizy, zgodnie z zalecaną procedurą. Analizę zróżnicowanej ekspresji genów przeprowadzono za pomocą DESeq2 (wersja 1.24.0) na szacunkowych zliczeniach na poziomie genów. FDR 5% i X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Walidacja danych dotyczących sekwencji RNA za pomocą qRT-PCR: Dane dotyczące sekwencji RNA zostały potwierdzone za pomocą qRT-PCR na mRNA wyekstrahowanym z odrębnych kohort szczurów. Z listy nowych DEG znalezionych wzbogaconych w każdym regionie na początku badania wybrano pięć transkryptów. Trzy z tych genów oparto na hipotezach w oparciu o literaturę fizjologiczną i behawioralną kory słuchowej, podczas gdy kolejne trzy geny to nowe geny zidentyfikowane na poziomie genów i analizach DEG w ramach porównania grup leków i nośników. Wszystkie sekwencje starterów wybrano albo z wcześniejszej literatury na temat tkanki mózgowej szczurów (sekwencje podane w tabeli poniżej) albo zaprojektowano przy użyciu NCBI Primer Blast i zweryfikowano specyficzność względem celu poprzez ocenę krzywych topnienia i sekwencjonowania produktu amplikonu PCR. Analizy qRT-PCR przeprowadzono w QuantStudio 3 (Applied Biosystems) z SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Dla każdej próbki amplifikowano 500 ng cDNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA iScript™ (Bio-Rad).

Podziękowanie

Autorzy chcieliby podziękować dr Andrei Shang, Seanowi Tsaurowi i Soorazowi Bylipudi za pomoc w procedurach i analizie behawioralnej; dr Mimi L. Phan za pomoc w protokołach ekstrakcji RNA i pobierania próbek; dr Troyowi A. Roepke, Ali Yasrebi i Christopherowi O'Brienowi za pomoc w analizie oczyszczania próbek RNA; i Alisa Ray za pomoc techniczną. Chcielibyśmy podziękować wszystkim obecnym i byłym pracownikom CLEF Lab za pomoc i wsparcie.

Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia, Narodowy Instytut Głuchoty i Zaburzeń Komunikacyjnych [R01-DC014753 do KMB]; Szkoła Sztuki i Nauki na Uniwersytecie Rutgers; Fundacja Aresty na Uniwersytecie Rutgers, finansowająca niewielkie granty na badania licencjackie; oraz program Project SUPER na Uniwersytecie Rutgers z niewielkimi grantami na badania licencjackie.

Bibliografia:

Alberini, CM i Kandel, ER (2014). Regulacja transkrypcji w konsolidacji pamięci. Perspektywy ColdSpring Harbor w biologii, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z. i Lee, C. (2001). MPer1 i mper2 są niezbędne do normalnego resetowania zegara dobowego. J Biol Rytmy, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D. i Rumpel, S. (2016). Sensoryczna kora nowa i pamięć skojarzeniowa. Neuronauka behawioralna uczenia się i pamięci, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM i Weaver, DR (2001). Funkcje różniczkowe mPer1, mPer2 i mPer3 w zegarze dobowym SCN. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS i Weinberger, NM (1996). Indukcja pamięci fizjologicznej w korze mózgowej poprzez stymulację jądra podstawnego. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC i Ressler, KJ (2017). Sieci krocza w korze czuciowej dorosłych są niezbędne do uczenia się przez strach. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . On, DZ (2018). Analiza transkryptomikanazy RNA-seq komórek włoskowatych ucha wewnętrznego dorosłego danio pręgowanego. Dane naukowe, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G. i Kreutz, MR (2018). Rola zależnej od aktywności demetylacji DNA w zaburzeniach mózgu dorosłych i neurologicznych. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Hamowanie deacetylazy histonowej przez RGFP966 zwalnia hamulce plastyczności kory czuciowej i specyfiki tworzenia pamięci. J. Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015

Brown, MR i Kaczmarek, LK (2011). Modulacja kanału potasowego i przetwarzanie słuchowe. Badania słuchu, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP i Lyukmanova, EN(2018). Lynx1 zapobiega długotrwałej blokadzie wzmocnienia i zmniejszeniu ekspresji neuromodulatora spowodowanej aktywacją A 1-42 i JNK. Acta Naturae, 10 ust. 3, 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com