Jak zapobiegać i zmniejszać tworzenie się kamienia nerkowego?

więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Część Ⅰ Ⅱ: Ewersja fosfatydyloseryny regulowana przez scramblazę fosfolipidową aktywowaną przez sygnalizację TGF‑1/Smad we wczesnym stadium tworzenia kamieni nerkowych

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

więcej informacji:ali.ma@wecistanche.com

Wstęp

Kamica moczowa jest jedną z najczęstszych chorób dotykających człowieka i wiąże się z licznymi powikłaniami urologicznymi [1]. Szczawian wapnia (CaOx) podobno uszkadza hodowane komórki kanalików nerkowych, po czym fosfatydyloseryna (PS) błony komórkowej przeskakuje z warstwy wewnętrznej na warstwę zewnętrzną in vitro, aby odgrywać ważną rolę wkamień nerkowyformacja [2]. Podobne wyniki zostały odnotowane w różnych badaniach [3-6]prowadzonych na poziomie komórkowym. Jednak mechanizm leżący u podstaw eksternalizacji PS w komórkach kanalików nerkowych spowodowany uszkodzeniem za pośrednictwem CaOx pozostaje niejasny. Wcześniejsze badania wykazały, że wysokie stężenie szczawianu wapnia prowadzi do nadprodukcji reaktywnych form tlenu (ROS)[7], co z kolei przyczynia się do eksternalizacji PS w komórkach kanalików nerkowych, powodując zarodkowanie i wzrost kryształów CaOx [8]. ROS i peroksydacja lipidów silnie aktywują scramblazę fosfolipidów (PLSCR)[9], natomiast ekspozycja na zmiatacze ROS, takie jak glutation, koenzym Q10 czy idebenon (syntetyczny homolog koenzymu Q10), zmniejsza aktywację PLSCR w chorobie policystycznych nerek [10]. . PLSCR, który jest zakotwiczony w błonie komórkowej [11], działa jako jeden z trzech enzymów przerzucających fosfolipidy, zdolnych do katalizowania szybkiego dwukierunkowego ruchu PS po obu stronach błony zgodnie z gradientem stężenia [12]. W warunkach fizjologicznych błona komórkowa jest asymetryczna, a PLSCR nie ma wpływu na błonę [13]. Jednak po uszkodzeniu komórek eukariotycznych, PLSCR jest aktywowany i przesuwa PS z warstwy wewnętrznej na zewnętrzną[14,15]. Dodatkowo, nadekspresja PLSCRin komórek K1 jajnika chomika chińskiego stymuluje podobno eksternalizację PS, wzmagając ruch PS na zewnątrz do powierzchni komórki podczas apoptozy [16]. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że PLSCR jest również zaangażowany w eksternalizację PS w błonie komórkowej kanalików nerkowych poprzez aktywację ROS.

Potencjalny mechanizm molekularny produkcji ROS indukowanej szczawianem zachodzi poprzez indukcję sygnalizacji TGF- 1/Smad, która może odgrywać rolę w produkcji ROS [17,18]. Rzeczywiście, sygnalizacja TGF- 1/Smad jest podobno zaangażowana w niezliczone choroby nerek, takie jak zapalenie kłębuszków nerkowych, zwłóknienie śródmiąższowe nerek i kamica nerkowa [19]. Co więcej, komórki jednojądrzaste traktowane TGF- 1 wykazują PSeksternalizację w błonie komórkowej, powodując przerzucanie PS z warstwy wewnętrznej do zewnętrznej [20]. Jednak według naszej wiedzy związek między sygnalizacją TGF- 1/Smad a PSewersją w błonach komórkowych kanalików nerkowych pozostaje nieznany. Postawiliśmy hipotezę, że TGF- 1 uczestniczy w wywracaniu PS w błonach komórkowych kanalików nerkowych poprzez aktywację PLSCR we wczesnym stadium szczurakamień nerkowyformacja za pośrednictwem ROS.

Dlatego zbadaliśmy, czy sygnalizacja TGF- 1/Smad stymuluje eksternalizację PS poprzez aktywację ROS i czy TGF aktywuje PLSCR w błonie komórkowej kanalików nerkowych we wczesnym stadiumkamień nerkowyrozwój in vitro i in vivo, kładąc w ten sposób teoretyczne podstawy dla etiologiikamień nerkowytworzenie.

Kliknij, aby przejść do Cistanche DHT na chorobę nerek

Materiały i metody

Szczurzy model wczesnego stadium powstawania kamienia nerkowego CaOx

Sześćdziesiąt czystych 3-miesięcznych samców szczurów Wistar o wadze 200±20 g dostarczyło Centrum Doświadczalne Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Harbin i trzymano je w temperaturze pokojowej (22 stopnie ±2 stopnie) i przy 50-70 procentach wilgotności. Po 3 dniach hodowli adaptacyjnej podzielono je losowo na trzy grupy (20 szczurów/grupę) – kontrolę,kamień nerkowy, orazkamień nerkowyplus SB431542 (inhibitor szlaku sygnałowego TGF- 1/Smad).

Kamień nerkowytworzenie jest inicjowane jako wczesna zmiana patologiczna po uszkodzeniu komórek kanalików nerkowych [21,22]. Aby zbadać ten proces urazu, szczurzy model wczesnego stadiumkamień nerkowyformacja została ustanowiona, ponieważ standardowe podejście nie zostało jeszcze zgłoszone. Aby zaobserwować wczesne zmiany po uszkodzeniu komórek kanalików nerkowych, zastosowaliśmy metodę opisaną przez Liet al. [23]. W skrócie, szczurom w grupie kontrolnej podawano codziennie 2 ml wody destylowanej przez zgłębnik doustny, podczas gdy szczurom w grupie kontrolnejkamień nerkowygrupie podawano codziennie 2 ml 1% roztworu glikolu etylenowego i 1% roztworu NHCl przez doustny zgłębnik. Szczury wkamień nerkowygrupie plus SB431542 wstrzykiwano dootrzewnowo współrozpuszczalnik SB431542 (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Szanghaj, Chiny) co 7 dni [24]. Jedzenie i woda były dostarczane bez ograniczeń. W dniu 14 szczury uśmiercono przez przedawkowanie środka znieczulającego (pentobarbital sodu, 200 mg/kg, poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe) i wycięto im nerki. Lewe nerki natychmiast konserwowano w ciekłym azocie w celu późniejszego wykrycia białka. Prawe nerki zostały utrwalone, a następnie odwodnione i zatopione w parafinie. Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego w Harbin (Numer zatwierdzenia: 2020005, Harbin, Chiny).

Tworzenie się kryształów w tkance nerek

Próbki tkanek barwiono metodą Pizzolato [23], a kryształy CaOx obserwowano pod mikroskopem optycznym w świetle spolaryzowanym (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Chiny). Regiony Pizzolato-dodatnie zmierzono i wyrażono jako promilowe wieku całkowitej powierzchni tkanki w przekrojach przy użyciu ImageJ 1.49v (National Institutes of Health, USA).

Wykrywanie PS w błonie komórkowej kanalików nerkowych in vivo metodą cytometrii przepływowej

Ekspozycja komórek nabłonka nerkowego na PS oceniano za pomocą testu barwienia aneksyną V znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), jak opisano wcześniej [2]. Komórki obserwowano (w każdej grupie) pod konfokalnym mikroskopem laserowym (Olympus, Tokio, Japonia). Ilość eksternalizacji PS określono jako procent komórek z aneksyną V-dodatnich. Fluorescencję aneksyny V próbek mierzono przy użyciu cytometru przepływowego (wzbudzenie 488 nm/emisja 530 nm; Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Pomiar poziomów TGF- 1 i Smad7 w błonie komórkowej kanalików nerkowych metodą western blotting

Po odzyskaniu zamrożonych próbek tkanek, białko wyekstrahowano za pomocą zestawu do ekstrakcji naturalnych białek błonowych ProteoExtract(M-PEK) (MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA), a stężenie białka określono za pomocą testu białkowego Bio-Rad zestaw (Hercules, CA, USA)zgodnie z instrukcją producenta. Następnie 40ug białka ładowano na 8-procentowy żel SDS-poliakrylamidowy (żel układający 100 V, żel rozdzielający 200 V) przez 1 godzinę przy stałym prądzie elektrody 300 mA. Białka w żelu przeniesiono na membranę nitrocelulozową (Kexing Co., Pekin, Chiny), zablokowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni w 5% odtłuszczonym mleku w proszku i inkubowano przez noc w temperaturze 4 stopni C z owczym anty-szczurzem TGF 1 ( ab208466; Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) i Smad7 (66 478; Proteintech, Wuhan, Chiny) [25]. Dodano królicze przeciwciało przeciw owcom znakowane peroksydazą chrzanową (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Pekin, Chiny) i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 1 godzinę. Sygnał wykryto przy użyciu odczynnika wzmocnionej chemiluminescencji (Abcam). Prążki dodatnie analizowano za pomocą oprogramowania do analizy gęstości optycznej żelu Gel-Pro 4.0 i mierzono skumulowaną gęstość optyczną (wartość IOD), przy czym wartość R oznaczała względną zawartość białka w następujący sposób: R=referencyjna wartość IOD PLSCR(cel)/referencyjna wartość IOD GAPDH (białko referencyjne).

Hodowla komórkowa i interferencja RNA

Linię komórek nabłonka nerek (komórki MDCK, CCL34, pasaże 53-90; ATCC, Manassas, VA, USA) hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełnionej antybiotykami (10{{1{{14} }}} U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i 10% płodowej surowicy bydlęcej (Life Technologies Co.) w temperaturze 37°C w 5% CO, atmosferze i podhodowlach z 0,25% trypsyna i 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (Life Technologies Co., CA, USA). Komórki traktowano CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) przez 2 godziny oraz 0,5 mM CaOx i 100 ug/ml neutralizującego przeciwciała anty-TGF- 1 （R&D Systems, Minneapolis , MN, USA) przez 2 godz. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

Aby określić rolę odwrócenia PLSCRin PS, komórki nabłonka kanalików nerkowych transfekowano siRNA PLSCR [26]. siRNA zostało zaprojektowane i zsyntetyzowane przez Anhui General Biological System (Anhui, Chiny; patrz Tabela 1). Do transfekcji użyto LipofectamineTM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta . Po 24 godzinach transfekcji komórki trawiono trypsyną, wirowano przy 1000 xg przez 5 minut, przemywano dwukrotnie PBS i ponownie wirowano. Supernatant odrzucono, a osad zawieszono w PBS w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczych komórek o gęstości 1 x 10° komórek/ml. Dodatnia szybkość ekspresji FAM(karboksyfluoresceiny) wynosiła 93% ± 5%, jak określono metodą cytometrii przepływowej. W celu dalszej oceny związku między TGF1 i PLSCR, komórki traktowano 0,5 mM CaOx lub 10 ng/ml TGF- 1 przez 2 godziny, a następnie transfekowano siRNA PLSCR.

Pomiar poziomu PLSCR w błonach komórek kanalików nerkowych metodą western blotting

Białko wyekstrahowano przy użyciu zestawu do ekstrakcji białek z naturalnej błony ProteoExtract (Chemical Book Co., Pekin, Chiny), a stężenie białka określono przy użyciu zestawu do oznaczania białek Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Pekin, Chiny). Następnie 40 ug białka ładowano na 8-procentowy żel SDS-poliakrylamidowy (żel układający 100 V, żel rozdzielający 200 V) przez 1 godzinę przy stałym prądzie 300 mA. Białka w żelu przeniesiono na membranę nitrocelulozową (Kexing Co., Shenzhen, Chiny) i zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem przez 1 godzinę w 37°C i inkubowano przez noc w 4 stopniach z owczym przeciwciałem monoklonalnym przeciw szczurzemu PLSCR (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, Chiny). Następnie dodano królicze przeciwciało drugorzędowe przeciw owcom znakowane peroksydazą chrzanową (1:400) i mieszaninę inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Po przemyciu membrany sygnał wykrywano wzmocnionym odczynnikiem chemiluminescencji (Abcam, Guang-zhou, Chiny). Prążki dodatnie analizowano stosując oprogramowanie do analizy gęstości optycznej Gel-Pro 4.0gel i mierzono wartość IOD, przy czym wartość R odpowiadała względnej zawartości białka, jak opisano powyżej.

Tabela 1 Sekwencje siRNA dla PLSCR

Pomiar rozkładu błonowego fosfatydyloseryny

Ilość wywinięcia PS błony komórkowej określono metodą wygaszania fluorescencji opisaną przez Kim i wsp. [27] oraz nasz zespół badawczy [2], z nitrobenzenem-2-oksa-1,3-diazolem (NBD, Szanghaj, Chiny) jako sondą fluorescencyjną. Po znakowaniu PS w zewnętrznej warstwie błony komórkowej za pomocą NBD, komórki hodowano w PBS zawierającym 5 mM diizopropylofluorofosforanu. Następnie dodano PBS zawierający szczawian wapnia (1,0 mM) i komórki inkubowano w temperaturze 37 stopni. Równą ilość zawiesiny komórek wyładowywano co 10 minut i rejestrowano intensywność fluorescencji przy użyciu spektrofluorometru RF-5000 (Shimadzu, Kioto, Japonia). Ustawienia spektrofluorometru były następujące: szerokość szczeliny 10 nm dla długości fali emisji 530 nm; oraz szerokość szczeliny 5 nm dla długości fali wzbudzenia 470 nm. Następnie zarejestrowano średnią wartość fluorescencji (FT) w ciągu 50-tych. Średnią zmniejszoną intensywność fluorescencji (FD) rejestrowano również po zastosowaniu roztworu ditionitu do wygaszenia fluorescencji NBD z zewnętrznej warstwy komórki. Następnie dodano 1% (wag./obj.) Triton X-100 w celu przepuszczania błony komórkowej. Następnie wygaszono fluorescencję NBD z wewnętrznej warstwy błony komórkowej i zarejestrowano intensywność fluorescencji (FO). Procent NBD-PS w płatkach wewnętrznych obliczono później przy użyciu następującego równania: procentowy wiek zinternalizowanego NBD-PS=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Procent eksternalizacji PS określono zgodnie z zasadą stosowaną do pomiaru internalizacji NBD-PS. Procent NBD-PS w płatkach zewnętrznych obliczono również przy użyciu następującego równania: procent NBD-PS w płatkach zewnętrznych=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Analiza statystyczna

Zmienne ciągłe są wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe. Zastosowano nieparametryczny sparowany test sumy rang, test t i test chi-kwadrat. Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Wyniki z P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Wyniki

Sygnalizacja TGF- 1/Smad stymuluje eksternalizację PS in vivo

Tworzenie kryształów w tkance nerek modelu szczura

Stworzenie szczurzego modelu wczesnego stadiumkamień nerkowydo żołądka szczurów przez 2 tygodnie podawano glikol etylenowy i chlorek amonu, a następnie każdy skrawek nerki badano pod mikroskopem cyfrowym. W próbkach z grupy kontrolnej w 14 dniu zaobserwowano prawidłowe struktury kanalików nerkowych bez tworzenia się kryształów (ryc. 1A). Kiedy tkanka nerek zkamień nerkowygrupa była obserwowana pod mikroskopem, kanaliki nerkowe wydawały się rozszerzone z widocznymi mikrokryształkami; sporadyczną akumulację kryształów CaOx zaobserwowano w niektórych kanalikach nerkowych, co wskazuje na pomyślne ustanowienie szczurzego modelu wczesnego stadiumkamień nerkowypowstawanie i powstawanie uszkodzenia komórek kanalików nerkowych.

Obecność PS w błonie komórkowej kanalików nerkowych

Aneksyna V-FITC, fluorescencyjna cząsteczka, która wiąże się z PS na powierzchni komórki, jest szeroko stosowana do wykrywania redystrybucji PS. W naszym badaniu komórki MDCK w normalnej kontroli,kamień nerkowy, orazkamień nerkowyplus grupy SB431542 obserwowano pod konfokalnym mikroskopem laserowym (ryc. 1B). Wskaźnik ewersji PS wzrósł wkamień nerkowyw porównaniu z grupą kontrolną (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">kamień nerkowyplus SB431542 wykazała niższy podstawowy poziom eksternalizacji PS niż w grupienerkazłóggrupa (P<0.05, fig.="" 1c,="">

Pomiar poziomów TGF- 1 i Smad7

Poziom TGF- 1 wkamień nerkowygrupę określono ilościowo metodą western blotting. Typowy western blot pokazano na Fig. 2A wraz z analizą densytometryczną poziomu TGF- 1. Wartości znormalizowano do wartości kontrolnych i wyrażono jako stosunek TGF- 1 do tubuliny. Dodatek glikolu etylenowego i NHCl znacząco zwiększył poziom TGF- 1 i obniżył poziom Smad7 w porównaniu z tymi w komórkach kontrolnych (ryc. 2A); jednak leczenie SB431542 plus glikol etylenowy i NH Call spowodowało znaczne obniżenie poziomu TGF- 1 i zwiększenie poziomu Smad7 w porównaniu z komórkami traktowanymi glikolem etylenowym i NH, Cl.

TGF aktywuje aktywność PLSCR w błonie komórkowej kanalików nerkowych in vitro

PLSCR

Poziom PLSCR oceniano metodą Western blot. Komórki traktowano CaOx przez 2 godziny. Poziom PLSCR był nieistotny w komórkach kontrolnych, ale znacznie wzrósł w grupie CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Zaburzony ruch do wewnątrz NBD-PS

Określiliśmy ruchy PS do wewnątrz i na zewnątrz w błonie komórkowej nabłonka kanalików nerkowych, aby ocenić aktywność PLSCR. Aby ocenić, czy PLSCR wpływa na ruch PS z zewnętrznego płatka do wewnętrznego płatka błony plazmatycznej, zintegrowaliśmy znakowany fluorescencyjnie PS (NBD-PS) z zewnętrznym płatkiem błony plazmatycznej i monitorowaliśmy jego internalizację (ryc. 3). Ilość NBD-PS internalizowanej przez komórki MDCK w grupach kontrolnych i CaOx wynosiła odpowiednio około 46,2% i 17,8%. Stąd tempo internalizacji PS w komórkach grupy CaOx było znacznie niższe niż w komórkach grupy kontrolnej (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Fig. 1 Tworzenie kryształów i eksternalizację PS zaobserwowano w grupach kontrolnych, z kamieniem nerkowym i kamieniem nerkowym plus SB431542.

(A) Tworzenie się kryształów w tkance nerek w dniu 14; strzałka wskazuje struktury mikrokrystaliczne. (B) Komórki MDCK obserwowano za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.

(C) Wykresy szybkości wywracania metodą cytometrii przepływowej. (D) Wskaźnik odwrócenia (procent). Trójkąt wskazuje P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">kamień nerkowyGrupa

Ulepszony ruch na zewnątrz NBD‑PS

Aby określić, czy szczawian wpływa na transport na zewnątrz PS, komórki MDCK znakowano wewnątrzkomórkowo NBD-PS i określano zakres ich przemieszczania się do przykładu – ulotki mic. Pożywka inkubacyjna zawierała albuminę surowicy bydlęcej (1 procent wag./obj.), która szybko wyekstrahowała wyrażany na powierzchni NBD-PS. Około 34,5% NBD-PS migrowało do zewnętrznego płatka w komórkach kontrolnych, podczas gdy szybkość zewnętrznego transferu PS w komórkach z grupy CaOx wzrosła do 75,3% w porównaniu z całkowitą wewnętrzną znakowaną NBD-PS, która była znacznie większa niż że w komórkach grupy kontrolnej (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Ryc. 2 Ekspresja TGF- 1/Smad w grupie kontrolnej, z kamieniem nerkowym i kamieniem nerkowym plus SB431542 oraz ekspresja PLSCR w błonie komórkowej kanalików nerkowych.

(A)TGF- 1/wyrażenie Smad. (B) Względne poziomy scramblazy fosfolipidowej (PLSCR) i reprezentatywny blot z ekspresją znormalizowaną do ekspresji GAPDH.P<>

Trójkąt wskazuje P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

KLIKNIJ TUTAJ, ABY CZĘŚCIĆ Ⅱ