Niedotlenione pęcherzyki pozakomórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych łagodzą zwłóknienie nerek po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym poprzez przywrócenie utleniania kwasów tłuszczowych za pośrednictwem CPT1A

Abstrakcyjny

1. Tło

Zwłóknienie nerek jest powszechnym procesem patologicznym przewlekłych chorób nerek wywołanych wieloma czynnikami. Niedotlenienie wstępne mezenchymalnych komórek macierzystych może zwiększyć skuteczność wydzielanych pęcherzyków pozakomórkowych (MSC-EV) w różnych chorobach, ale nie jest jasne, czy mogą one lepiej poprawić zwłóknienie nerek. Najnowsze badania wykazały, że odzyskiwanie utleniania kwasów tłuszczowych (FAO) może zmniejszyć zwłóknienie nerek. W tym badaniu naszym celem było zbadanie, czy wstępne leczenie niedotlenieniem pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi MSC (Hypo-EV) może poprawić FAO w celu przywrócenia zwłóknienia nerek i zbadania mechanizmu leżącego u jego podstaw.

2. Metody

Hypo-EV wyizolowano z ludzkich MSC pochodzących z łożyska (hP-MSC) poddanych wstępnej obróbce hipoksją, a Norm-EV wyizolowano z hP-MSC hodowanych w normalnych warunkach. Zastosowaliśmy model zwłóknienia nerek wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją (I / R) in vivo. Myszom wstrzyknięto PBS, Hypo-EV lub Norm-EV natychmiast po operacji i 1 dzień po operacji. Czynność nerek, patologię nerek i zwłóknienie nerek oceniano pod kątem uszkodzenia nerek. Na potrzeby eksploracji mechanistycznej in vivo wykryto utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO), mitochondrialne zmiany morfologiczne, produkcję ATP i mitochondrialne białka masowe. Potencjał błony mitochondrialnej i wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) badano in vitro.

3. Wyniki

Stwierdziliśmy, że Hypo-EV mają lepszy efekt terapeutyczny w przywracaniu uszkodzenia struktury nerek, przywróceniu funkcji nerek i zmniejszeniu zwłóknienia nerek. Tymczasem Hypo-EV wzmocniły mitochondrialne FAO w nerkach, przywracając ekspresję kluczowego enzymu FAO ograniczającego szybkość transferazy palmitoilo-karnitynowej 1A (CPT1A). Mechanistycznie poprawa homeostazy mitochondriów, charakteryzująca się naprawą struktury mitochondriów, przywróceniem masy mitochondriów i produkcją ATP, zahamowaniem stresu oksydacyjnego i zwiększeniem potencjału błony mitochondrialnej, częściowo wyjaśnia wpływ Hypo-EV na poprawę mitochondrialnego FAO, a tym samym osłabienie I/ obrażenia R.

4. Konkluzje

Hypo-EV hamują zwłóknienie nerek poprzez przywrócenie mitochondrialnego FAO, w którym pośredniczy CPT1A, którego efekty można osiągnąć poprzez regulację homeostazy mitochondriów. Nasze odkrycia dostarczają dalszego wsparcia dla mechanizmu rozwoju bezkomórkowej terapii zwłóknienia nerek.

5. Słowa kluczowe

Mezenchymalne komórki macierzyste, Niedotlenienie, Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, Mitochondrialne, Utlenianie kwasów tłuszczowych, Zwłóknienie nerek.

Kliknij tutaj, aby kupić suplement Cistanche

Wstęp

Przewlekła choroba nerek (CKD) jest poważną chorobą zagrażającą zdrowiu ludzkiemu, a także ważnym globalnym problemem publicznym. Globalna częstość występowania, rozpowszechnienie i zgony z powodu CKD są znaczące i rosną, a częstość występowania wśród dorosłych na całym świecie wynosi około 10 procent [1, 2]. Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny nerek (I/R) jest związany ze zwłóknieniem nerek i postępującą CKD [3, 4]. Zwłóknienie nerek jest uważane za powszechny proces patologiczny, który prowadzi do CKD i schyłkowej niewydolności nerek. Jednak obecnie nie ma skutecznych terapii, które skutecznie zapobiegałyby lub odwracały włóknienie [5].

Doniesiono, że pozakomórkowe pęcherzyki pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC-EV) odgrywają rolę regeneracyjną i przeciwzwłóknieniową w kilku przedklinicznych modelach CKD [6-9]. Jednak niska wydajność MSC-EV jest czynnikiem ograniczającym produkcję terapii bezkomórkowych na dużą skalę [10]. Wstępne kondycjonowanie niedotlenienia stymuluje parakrynne działania MSC oraz zwiększa funkcję i produkcję EV i jest uważane za podejście inżynieryjne mające na celu poprawę potencjału terapeutycznego EV [11, 12]. Niedawne badanie wykazało, że prekondycjonowane niedotlenieniem MSC są bardziej znaczące niż nieleczone MSC w zapobieganiu zwłóknieniu nerek i stanom zapalnym [13]. Jednak rola wstępnie uwarunkowanych hipoksją EV pochodzących z MSC w zwłóknieniu nerek nie została jeszcze ustalona.

Patologiczny mechanizm włóknienia nerek był przedmiotem wielu ostatnich badań [14–16], zwłaszcza w zakresie regulacji metabolicznej [17]. Powszechnie wiadomo, że komórki kanalików proksymalnych (PTC) są najbardziej energochłonnymi komórkami nerki i odgrywają kluczową rolę w progresji włóknienia cewkowo-śródmiąższowego [18, 19]. Utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO) jest głównym źródłem energii PTC [19, 20]. Wyniki badań transkryptomu całego genomu wykazały, że ekspresja kluczowych enzymów metabolicznych i regulatorów transkrypcji związanych z FAO była znacznie zmniejszona w ludzkich i mysich modelach ze zwłóknieniem cewkowo-śródmiąższowym [20]. Ponadto przywrócenie metabolizmu kwasów tłuszczowych może chronić myszy przed zwłóknieniem cewkowo-śródmiąższowym [17, 20]. Niedawne badanie potwierdziło, że nadekspresja kluczowego enzymu ograniczającego szybkość palmitoilotransferazy karnitynowej 1A (CPT1A) może zwiększać FAO w komórkach nabłonka kanalików nerkowych, zmniejszać ekspresję mediatorów stanu zapalnego i prowadzić do znacznego złagodzenia zwłóknienia w trzech modelach eksperymentalnych [21]. ]. Dlatego terapie ukierunkowane na FAO mogą być potencjalnie skuteczną strategią terapeutyczną w zmniejszaniu zwłóknienia.

Mitochondria odgrywają niezastąpioną rolę w regulacji FAO. Poprzednie badanie wykazało, że astragalozyd IV może zwiększać FAO poprzez regulację aktywności mitochondriów podczas starzenia [22]. Zniszczenie homeostazy mitochondriów odgrywa ważną rolę we wczesnym uszkodzeniu nerek, nieprawidłowej naprawie po urazie i patogenezie CKD [23, 24]. W warunkach fizjologicznych i patologicznych różne mechanizmy koordynują utrzymanie homeostazy mitochondriów, w tym obronę przeciwutleniającą, naprawę mitochondrialnego DNA, fuzję i rozszczepienie mitochondriów, autofagię mitochondriów i biogenezę mitochondriów [25]. Kilka badań wykazało, że MSC-EV mogą łagodzić uszkodzenia mitochondriów poprzez stabilizację mitochondrialnego DNA [26], hamowanie rozszczepienia mitochondriów i stymulowanie mitochondrialnej obrony antyoksydacyjnej i produkcji trifosforanu adenozyny (ATP) w modelach ostrego uszkodzenia nerek (AKI) [27, 28] . Wcześniejsze badania wskazywały, że leczenie Hypo-EV miało lepszy wpływ na promowanie angiogenezy, proliferacji i migracji oraz hamowanie stanu zapalnego i apoptozy niż leczenie Norm-EV [29-31]. Niemniej jednak badacze nie ustalili ostatecznie, czy wyniki terapeutyczne Hypo-EV w przypadku zwłóknienia zależą od homeostazy mitochondriów.

Celem tego badania było (1) zbadanie, czy wstępne leczenie niedotlenieniem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z MSC (Hypo-EV) ma lepszy efekt przeciw zwłóknieniu; (2) w celu ustalenia, czy Hypo-EV łagodzą zwłóknienie wywołane reperfuzją niedokrwienną poprzez wzmocnienie FAO, w którym pośredniczy CPT1A; (3) zbadanie, czy ochronny wpływ Hypo-EV na FAO jest związany z regulacją homeostazy mitochondriów.

Cistanche w proszku

Metody

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie do hipoksji

Ludzkie MSC pochodzące z łożyska (hP-MSC) zostały dostarczone przez Institute of Foundation, Chinese Academy of Medical Sciences i hodowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, Gibco) z 10% płodowa surowica bydlęca (FBS, Corning) uzupełniona 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (Gibco) i utrzymywana w 37 stopniach w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Gdy hP-MSC osiągnęło 60-70% konfluencji, pożywkę hodowlaną zastąpiono FBS zubożonym w egzosom (SBI, 50A{14}}) i hodowano w 37 stopniach, 5 procentach CO2, 21 procentach O2 lub w 1 procent O2, 94 procent N2 i 5 procent CO2 przez dodatkowe 48 godzin. Pożywkę następnie zebrano w celu izolacji EV, a EV zebrane z niedotlenienia wstępnego traktowania MSC (1 procent O2) nazwano Hypo-EV, a normalny MSC (21 procent O2) nazwano Norm-EV. Do dalszych eksperymentów użyto tylko hP-MSC z pasażów 6–10.

2. Hodowla komórkowa i leczenie

Ludzkie komórki nabłonka proksymalnych kanalików nerkowych (HK-2, ATCC, USA) hodowano w DMEM/F12 z 10% FBS i uzupełniono 100 U/ml penicyliny-streptomycyny. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 stopni w wilgotnej atmosferze zawierającej 5 procent CO2. Zastosowaliśmy dwa podejścia do naśladowania CKD in vitro. Model niedotlenienia/reoksygenacji komórek (H/R) przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami [32]. Pokrótce, komórki HK{8}} poddano działaniu warunków niedotlenienia (37 stopni, 1 procent O2, 94 procent N2 i 5 procent CO2) przez 12 godzin w pożywce bez glukozy i surowicy, aby wywołać uszkodzenie spowodowane niedotlenieniem. Następnie wymieniono pożywkę i komórki umieszczono w normalnych warunkach (21 procent O2) w celu ponownego natlenienia na 24 godziny. Grupę kontrolną hodowano w normalnych warunkach (21 procent O2) zgodnie z projektem eksperymentu. Inną metodą była inkubacja komórek HK-2 z transformującym czynnikiem wzrostu beta-1 (TGF- 1) w końcowym stężeniu 10 ng/ml przez 48 godzin, jak podano wcześniej [13]. Podczas reoksygenacji lub czasu stymulacji TGF{29}} do komórek dodawano Norm-EV lub Hypo-EV (100 μg/ml pożywki).

3. Izolacja i identyfikacja MSC‑EV

EV pochodzące z MSC wyizolowano za pomocą różnicowej metody ultrawirowania. Pokrótce, pożywkę hodowlaną odwirowano w 4 stopniach w następujący sposób: 500×g przez 10 min, przy 2,000×g przez 20 min i 10,000×g przez 30 min. Pożywkę przesączono przez filtr 0,22-}μm przed ultrawirowaniem przy 100,000×g przez 2 godziny. Na koniec peletki EV ponownie zawieszono w PBS i ultrawirowano przez dodatkowe 2 godziny, aby odrzucić zanieczyszczające białka, a następnie oczyszczone EV zebrano w PBS i przechowywano w temperaturze -80 stopni do dalszego użycia. Stężenia białek Norm-EV i Hypo-EV zbadano za pomocą testu białka kwasu bicynchoninowego (BCA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) zaobserwowano typową dwuwarstwową strukturę membrany EV w kształcie kuli. Do zbadania jakości EV zastosowano technikę Western blotting, a rozkład wielkości EV zbadano metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS).

Cistanche tubulosa

4. Doświadczenia na zwierzętach

Samce myszy C57BL / 6 SPF (w wieku 7–9 tygodni) zostały dostarczone przez Sibeifu Experimental Animal Science and Technology (Pekin, Chiny) i były karmione adaptacyjnie przez 4 dni w ośrodku dla zwierząt w chińskim szpitalu ogólnym PLA przed eksperymentem. Myszy losowo podzielono na cztery grupy: grupę kontrolną, grupę z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), grupy Norm-EV i Hypo-EV. Myszy z grup PBS, Norm-EV i Hypo-EV poddano niedokrwieniu-reperfuzji nerek, jak opisano wcześniej [33, 34]. Pokrótce, myszy znieczulono pentobarbitalem (50 mg/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Włosy grzbietowe powyżej nerki myszy zostały oczyszczone, a następnie odsłonięto obustronne naczynia nasady nerki. Aby wywołać niedokrwienie nerek, lewą tętnicę nerkową zaciśnięto nieurazowym zaciskiem naczyniowym na 30 minut i jednocześnie usunięto prawą nerkę. Następnie rozpoczęto reperfuzję poprzez zwolnienie zacisku. Nerki obserwowano przez 5 minut, aby zapewnić reperfuzję po zdjęciu zacisku. Stół operacyjny i temperaturę w pomieszczeniu utrzymywano podczas operacji na poziomie 37 stopni. W modelach leczenia 100 μg Norm-EV lub Hypo-EV w 0,15 ml rozpuszczalnika PBS podawano przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej bezpośrednio po operacji i dnia (D) 1 po zabiegu odpowiednio w grupach Norm-EV i Hypo-EV. Tę samą objętość PBS podawano przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej w grupie PBS. Myszy uśmiercono w D 2, D 7 i D 14 po operacji (ryc. 1a).

5. Internalizacja MSC‑EV

Aby zweryfikować, czy EV mogą zostać zinternalizowane przez uszkodzone nerki. Barwienie fluorescencyjne Dil (Yeasen) przeprowadzono w celu oznaczenia EV. Te Norm-EV lub Hypo-EV (200 μg), które rozpuszczono w 100 μl PBS, inkubowano z 4 μM Dil w temperaturze 37 stopni przez 1 godzinę. Niezwiązane barwniki usunięto następnie za pomocą kolumny do wirowania egzosomów (Invitrogen). Di/Norm-EV i Dil/Hypo-EV zawieszono w PBS do późniejszego użycia. Dil/Norm-EV lub Dil/HypoEV (100 μg) wstrzyknięto dożylnie modelowi myszy z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym (I/R) przez żyłę ogonową natychmiast po zabiegu chirurgicznym i w D 1 po operacji, jak wspomniano powyżej. W dniach 1, 3, 5 i 7 myszy obrazowano natychmiast przy użyciu oprogramowania Living Image Software 4.4 (PerkinElmer). Ponadto pobrano nerki i obserwowano je w systemie obrazowania optycznego na D 7. Wszystkie sygnały obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) mierzono na podstawie średniego promieniowania z obszarów zainteresowania (ROI).

6. Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

Łącznie 1 mm3 tkanki nerki utrwalano w 2,5% aldehydzie glutarowym (pH 7,4) w 4 stopniach przez 24 godziny. Następnie tkankę utrwalano 1% kwasem osmowym przez 2–3 godziny, odwadniano acetonem i etanolem i zatapiano w żywicy epoksydowej. Następnie za pomocą ultramikrotomu przygotowano ultracienkie skrawki o grubości 60 nm, które następnie barwiono 3% octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Wreszcie sekcja była obserwowana pod TEM (Japonia).

7. Analiza funkcji nerek

Próbkę krwi pobrano z żyły ogonowej w dniu 3 i zbadano poziomy azotu mocznikowego we krwi (BUN) u myszy przy użyciu odpowiedniego zestawu (test biologiczny).

8. Ocena histopatologiczna nerek

Tkanki nerek utrwalono w 10% formalinie przez 48 godzin, zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki o grubości 3 μm, wybarwiono odczynnikami barwiącymi Masson według standardowego protokołu i obserwowano za pomocą mikroskopu (Olympus, Tokio, Japonia). Procent powierzchni odkładania się kolagenu obliczono za pomocą oprogramowania ImageJ. Było co najmniej 10 losowych, nienakładających się pól na zwierzę do oceny.

9. Immunohistochemia

Zatopione w parafinie skrawki nerki traktowano wstępnie przez 20 minut, stosując podgrzewanie do odzyskiwania antygenu z buforem cytrynianu sodu (pH 6, roztwór do odzyskiwania epitopów 1), a następnie inkubowano przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze 4°C. Następnie skrawki inkubowano z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym, a jako chromogen zastosowano 3,3'-diaminobenzydynę (DAB). Następnie skrawki barwiono kontrastowo hematoksyliną i obserwowano pod mikroskopem optycznym. Zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: CPT1A (ab128568, Abcam) i wimentyna (ab92547, Abcam).

10. Immunofluorescencja

Komórki lub tkanki permeabilizowano 0,2% Tritonem X-100 przez 5 minut, blokowano surowicą owczą przez 30 minut i inkubowano z aktyną mięśni gładkich (-SMA, 1:200, 55135, Proteintech) lub kolagenu I (1:100, ab270993, Abcam) przez 16–18 godzin w 4 stopniach, a następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z Cy3 (czerwone) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Jądra barwiono kontrastowo DAPI. Barwienie fluorescencyjne skrawków tkanki obrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

11. Analiza Western blot

Nerki, komórki lub peletki EV poddano lizie w buforze do lizy RadioImmune Precipitation Assay (RIPA) zawierającym fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), a zawiesinę supernatantu otrzymaną po odwirowaniu zmierzono za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA (Thermo Fisher Scientific). Próbki białka o tej samej jakości (20 μg/ścieżkę) dodawano do 10% lub 12% żelu dodecylosiarczanu sodu-poliakryloamidu (SDS-PAGE), a następnie przenoszono z żeli SDS-PAGE na membrany. Membranę blokowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z 1X roztworem kazeiny, a następnie inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 4 stopniach przeciwko następującym białkom: -SMA (ab7817, Abcam), wimentyna (ab92547, Abcam), aldehyd glicerynowy 3- dehydrogenaza fosforanowa (GAPDH, 60004-1- Ig, Proteintech), aktyna (20536-1- AP, Proteintech), PGC1 (ab191838, Abcam), CPT1A (ab128568, Abcam), kompleks dehydrogenazy bursztynianowej, podjednostka B żelaza i siarki (SDHB , 10620-1-AP, Proteintech), podjednostka IV oksydazy cytochromu c (COXIV, ab202554, Abcam) i ATPB (17247-1-AP, Proteintech). Błonę następnie inkubowano z odpowiednim drugorzędowym przeciwciałem przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej i przemyto trzy razy. Obrazy analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ.

12. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT‑qPCR)

Najpierw RNA ekstrahowano z poddanych lizie komórek lub tkanki nerki przy użyciu odczynnika Trizol (Invitrogen), a następnie RNA syntetyzowano do cDNA zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu zestawu ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo). Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu SYBR Select Master Mix (Life Technologies) i systemu detekcji RT-qPCR (ABI). Zsyntetyzowano startery dla następujących genów: przedni PPAR TTTGCCAAGGCTATCCCAGG, wsteczny GTCACAGAACGGCTTCCTCA,

PGC1 do przodu AATGCAGCGGTCTTAGCACT, do tyłu CTGAGCAGGGACGTCTTTGT, ACOX2 TCATCCAACGTGACCCAGTG, do tyłu CAG CAAGGACTCTGTCAGCA, CPT2 do przodu CATCGT ACCCACCATGCACT, do tyłu CTCCTTCCCAATGCC GTTCT, 18S AGCTATCAATCTGTCAATCCT GTC, do tyłu GCTTAATTTGACTCA ACACGGGA, a ekspresja każdego genu docelowego została znormalizowana przez gen 18S i obliczona przez 2-ΔΔCT metoda.

13. Pomiar potencjału błony mitochondrialnej

Potencjał błony mitochondrialnej (MMP) wykryto za pomocą JC-1 (Beyotime). Najpierw otrzymano roztwór roboczy do barwienia JC -1, dodając 8 ml ultraczystej wody na każde 50 μl JC -1 (200X), którą gwałtownie wytrząsano w celu całkowitego rozpuszczenia, a następnie 2 ml JC{{ Dodano 7}} buforu barwiącego (5X). Po drugie, komórki w sześcioporowej płytce przemyto dwukrotnie PBS, a następnie dodano 1 ml roztworu roboczego barwiącego JC{11}} i pozostawiono na 20 min w 37 stopniach C. Na koniec komórki ponownie przemyto PBS i dodano 2 ml roztworu do hodowli komórkowej. Zwizualizowane obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Kapsułki Cistanche

14. Wykrywanie mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS).

Wytwarzanie mitochondrialnych ROS mierzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu Mito-SOX Red (Thermo Fisher Scientific). Dodano roztwór roboczy odczynnika MitoSOX (2,0 ml, 5 μM) w celu pokrycia komórek w płytkach z sześcioma porami, a następnie barwiono czerwienią MitoSOX przez 10 minut w 37 stopniach. Następnie komórki przemyto trzykrotnie PBS, a zwizualizowane obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

15. Wykrywanie ATP

Wytwarzanie ATP określono za pomocą zestawu Enhanced ATP Assay Kit (Beyotime, Chiny, nr kat.: S0027) zgodnie z protokołem producenta.

16. Analiza statystyczna

Kwantyfikację i wykresy analizowano przy użyciu GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, USA) i przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej. Różnice między wieloma grupami analizowano przy użyciu analizy wariancji (ANOVA), a istotność statystyczną ustalono na poziomie P <0,05.

Dyskusja

W tym badaniu skupiliśmy się na FAO w zwłóknieniu nerek i zidentyfikowaliśmy enzymy metaboliczne (CPT1A) i regulatory transkrypcji (PGC1, PPAR) FAO, co wskazało, że Hypo-EV mogą odwrócić zaburzenie metabolizmu kwasów tłuszczowych w zwłóknieniu nerki spowodowane przez I /R. Ponadto odkryliśmy, że Hypo-EV wywierają głęboki wpływ na FAO za pośrednictwem CPT1A, co częściowo przypisuje się regulacji homeostazy mitochondriów.

W ostatnich latach coraz więcej badań donosi o ochronnym wpływie MSC-EV na nerki w modelach CKD in vivo, a niewielka ilość dostępnych danych wykazała, że ​​EV były lepsze lub równie skuteczne w ochronie renoprotekcyjnej w porównaniu z macierzystym MSC [43]. . Leczenie MSC-EV w CKD jest w powijakach, a złożony mechanizm nie został w pełni wykazany. AKI jest jednym z głównych czynników PChN, która prowadzi do schyłkowej niewydolności nerek [44], a uszkodzenie I/R nerek jest głównym czynnikiem AKI, dlatego wybraliśmy model zwłóknienia indukowanego I/R, aby odkryć potencjalny mechanizm molekularny, który jak MSC-EV zapobiega zwłóknieniu nerek.

Niska wydajność MSC-EV jest czynnikiem ograniczającym produkcję na dużą skalę terapii bezkomórkowych. W związku z tym zbadano różne potencjalne podejścia do zwiększenia wydajności EV, w tym optymalizację warunków hodowli MSC, trójwymiarowe rusztowania oparte na macierzy pozakomórkowej oraz regulację biogenezy EV [10]. Wśród nich niedotlenienie kondycjonowania MSC jest ważną metodą wzmocnienia efektu leczenia EV w różnych chorobach, takich jak gojenie się złamań kości [30], gojenie się ran cukrzycowych [29] i naprawa mięśnia sercowego [45]. Nasze badanie dostarcza dowodów na wzmocnione niedotlenieniem działanie EV wydzielanych przez MSC. Co więcej, wykazaliśmy również, że niedotlenione, wstępnie kondycjonowane EV pochodzące z MSC mają większy efekt przeciwzwłóknieniowy i chroniący nerki niż Norm-EV w CKD indukowanej przez I / R. Dane dotyczące miRNA w Hypo-EV w porównaniu z Norm-EV zostały dobrze opisane. Liczne badania wykazały, że zawartość miRNA była odpowiedzialna za korzystne działanie Hypo-EV w wielu chorobach [30, 46]. W porównaniu z Norm-EV, 215 miRNA było regulowanych w górę, a 369 miRNA regulowanych w dół w Hypo-EV pochodzących z tkanki tłuszczowej, które głównie regulują metabolizm komórkowy, różnicowanie i funkcję TGF [29]. Jednak mechanizm, za pomocą którego Hypo-EV regulują funkcję metabolizmu, pozostaje słabo poznany w CKD. Obszerna literatura wskazuje, że FAO jest zmniejszone we zwłóknieniu nerek i przyczynia się do jego patogenezy [47]. Zgodnie z doniesieniami, nasze badanie wykazało, że ekspresja genów kluczowych enzymów metabolicznych związanych z FAO (CPT1A, CPT2 i ACOX2) oraz czynników regulujących transkrypcję FAO (PPAR i PGC1) była znacznie zmniejszona w zwłóknieniu nerek wywołanym przez I / R.

Ponadto przywrócenie metabolizmu lipidów jest potencjalną strategią leczenia zwłóknienia nerek [48]. Nadekspresja CPT1A w kanalikach nerkowych jest znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do wzmocnienia funkcji w FAO i skutkuje ochroną funkcji nerek i zwłóknienia poprzez zapobieganie dysfunkcji mitochondriów, różnicowaniu TEC i stanom zapalnym w modelach zwierzęcych CKD [21]. Nasze dane pokazały, że Hypo-EV mogą z powodzeniem odwrócić uszkodzony FAO w zwłóknieniu wywołanym I / R, co sugeruje, że efekty terapeutyczne Hypo-EV w zwłóknieniu nerek są częściowo wynikiem przywrócenia FAO.

Upośledzenie sygnalizacji PPAR w nerkach zmniejsza aktywność szlaku FAO i nasila rozwój włóknienia nerek [49]. Podanie fenofibratu, agonisty PPAR, przywróciło defekt utleniania tłuszczów i zwłóknienie kanalików śródmiąższowych w CKD [50, 51]. PGC{3}} jest koaktywatorem PPAR w transkrypcyjnej kontroli pojemności mitochondrialnego FAO [39]. Zbadaliśmy, czy HypoEV mogą zwiększyć sygnalizację PPAR i przywrócić FAO w urazie I / R. Nasze wyniki pokazały, że nie było oczywistych różnic w ekspresji PGC{5}} i PPARa między Norm-EV i Hypo-EV. Dlatego muszą istnieć inne czynniki sprzyjające wystąpieniu tego procesu. Mitochondria są siłą napędową FAO do generowania energii dla komórki [52]. Dysfunkcja mitochondriów ma kluczowe znaczenie w patogenezie zwłóknienia nerek [53]. Przywrócenie mitochondrialnej homeostazy okazało się obiecującą strategią terapeutyczną zapobiegającą uszkodzeniu nerek i przyspieszającą naprawę nerek [25]. Ostatnie badania wykazały, że MSC-EV mają ochronny wpływ na uszkodzenia mitochondriów spowodowane przez AKI, co chroni TEC przed uszkodzeniem poprzez zmniejszenie fragmentacji mitochondriów, normalizację potencjału błony mitochondrialnej oraz odwrócenie delecji mtDNA i defektów mitochondrialnego OXPHOS [26, 27]. Nasze wyniki wykazały, że leczenie Hypo-EV przywróciło nieprawidłową zmianę morfologii mitochondriów, zwiększoną masę mitochondriów i wzmocnioną funkcję mitochondriów w włóknistych nerkach. Nasze odkrycia wskazują, że wpływ Hypo-EV na FAO można osiągnąć poprzez regulację homeostazy mitochondriów.

W naszym badaniu istnieją pewne ograniczenia. Na przykład nasze dane pokazują, że Hypo-EV mają lepsze działanie przeciwzwłóknieniowe u myszy z urazem I / R niż Norm-EV. Jednak nie określiliśmy zróżnicowanej ekspresji zawartości między Norm-EV i Hypo-EV, a także nie oceniliśmy konkretnego sposobu, w jaki Hypo-EV wpływają na homeostazę mitochondriów w tym badaniu.

Korzyści Cistanche

Wnioski

Podsumowując, nasze dane wskazują, że Hypo-EV znacząco hamują zwłóknienie nerek poprzez przywrócenie FAO za pośrednictwem CPT1A, a efekty te można osiągnąć poprzez regulację homeostazy mitochondriów. Nasze odkrycia zapewniają dalsze mechaniczne wsparcie dla rozwoju bezkomórkowej terapii zwłóknienia nerek.

Bibliografia

1. Kalantar-Zadeh K, Jafar TH, Nitsch D, Neuen BL, Perkovic V. Przewlekła choroba nerek. Lancet. 2021;398(10302):786–802.

2. Xie Y, Bowe B, Mokdad AH, Xian H, Yan Y, Li T, Maddukuri G, Tsai CY, Floyd T, Al-Aly Z. Analiza badania Global Burden of Disease podkreśla globalne, regionalne i krajowe trendy epidemiologii przewlekłej choroby nerek w latach 1990-2016. Kidney Int. 2018;94(3):567–81.

3. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Ostre uszkodzenie nerek. Lancet. 2019;394(10212):1949–64.

4. Zheng Z, Li C, Shao G, Li J, Xu K, Zhao Z, Zhang Z, Liu J, Wu H. Hippo-YAP/MCP{2}}, w której pośredniczy nieadaptacyjna naprawa kanalików promuje stan zapalny w przypadku niewydolności nerek po niedokrwienna AKI. Śmierć komórkowa Dis. 2021;12(8):754.

5. Yan H, Xu J, Xu Z, Yang B, Luo P, He Q. Definiowanie celów terapeutycznych dla zwłóknienia nerek: wykorzystanie biologii patogenezy. Firma Biomed Pharmacother. 2021;143:112115.

6. Shi Z, Wang Q, Zhang Y, Jiang D. Pęcherzyki pozakomórkowe wytwarzane przez mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego łagodzą zwłóknienie nerek, częściowo poprzez hamowanie szlaku RhoA/ROCK, w modelu szczurzym UUO. Komórki Macierzyste Res Ther. 2020;11(1):253.

7. Kholia S, Herrera Sanchez MB, Cedrino M, Papadimitriou E, Tapparo M, Deregibus MC, Bruno S, Antico F, Brizzi MF, Quesenberry PJ, Camussi G. Pozakomórkowe pęcherzyki pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych łagodzą uszkodzenie nerek w nefropatii kwasu arystolochowego . Front Cell Dev Biol. 2020;8:188.

8. Birtwistle L, Chen XM, Pollock C. Pozakomórkowe pęcherzyki pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych na ratunek w przypadku uszkodzenia nerek. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6596.

9. Huang Y, Yang L. Mezenchymalne komórki macierzyste i pęcherzyki pozakomórkowe w terapii chorób nerek. Komórki Macierzyste Res Ther. 2021;12(1):219.

10. Phan J, Kumar P, Hao D, Gao K, Farmer D, Wang A. Inżynieria mezenchymalnych komórek macierzystych w celu poprawy ich skuteczności egzosomów i wydajności terapii bezkomórkowej. Pęcherzyki J Extracell. 2018;7(1):1522236.

11. Bister N, Pistono C, Huremagic B, Jolkkonen J, Giugno R, Malm T. Niedotlenienie i pęcherzyki pozakomórkowe: przegląd metod, ładunku pęcherzykowego i funkcji. Pęcherzyki J Extracell. 2020;10(1): e12002.

12. Yang Y, Lee EH, Yang Z. Mezenchymalne komórki macierzyste kondycjonowane niedotlenieniem w zastosowaniu do regeneracji tkanek. Tissue Eng Part B Rev 2021.

13. Ishiuchi N, Nakashima A, Doi S, Yoshida K, Maeda S, Kanai R, Yamada Y, Ike T, Doi T, Kato Y, Masaki T. Wstępnie kondycjonowane mezenchymalne komórki macierzyste niedotlenienia zapobiegają zwłóknieniu nerek i stanom zapalnym w niedokrwieniu-reperfuzji szczury. Komórki Macierzyste Res Ther. 2020;11(1):130.

14. Panizo S, Martinez-Arias L, Alonso-Montes C, Cannata P, Martin-Carro B, Fernandez-Martin JL, Naves-Diaz M, Carrillo-Lopez N, Cannata-Andia JB. Zwłóknienie w przewlekłej chorobie nerek: patogeneza i konsekwencje. Int J Mol Sci. 2021;22(1):408.

15. Humphreys BD. Mechanizmy zwłóknienia nerek. Annu Rev Physiol. 2018;80:309–26.

16. Nastase MV, Zeng-Brouwers J, Wygrecka M, Schaefer L. Celowanie w zwłóknienie nerek: mechanizmy i systemy dostarczania leków. Adv Drug Deliv Rev. 2018;129:295–307.

17. Zhao X, Kwan JYY, Yip K, Liu PP, Liu FF. Celowanie w dysregulację metaboliczną w terapii zwłóknienia. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(1):57–75.

18. Qi R, Yang C. Komórki nabłonka kanalików nerkowych: zaniedbany mediator zwłóknienia kanalików śródmiąższowych po urazie. Śmierć komórkowa Dis. 2018;9(11):1126.

19. Gewin LS. Zwłóknienie nerek: prymat kanalika proksymalnego. Matrix Biol. 2018;68:248–62.

20. Kang HM, Ahn SH, Choi P, Ko YA, Han SH, Chinga F, Park AS, Tao J, Sharma K, Pullman J, Bottinger EP, Goldberg IJ, Susztak K. Wadliwe utlenianie kwasów tłuszczowych w komórkach nabłonka kanalików nerkowych odgrywa kluczową rolę w rozwoju zwłóknienia nerek. Nat Med. 2015;21(1):37–46.

21. Miguel V, Tituana J, Herrero JI, Herrero L, Serra D, Cuevas P, Barbas C, Puyol DR, Marquez-Exposito L, Ruiz-Ortega M, Castillo C, Sheng X, Susztak K, Ruiz-Canela M, Salas-Salvado J, Gonzalez MAM, Ortega S, Ramos R, Lamas S. Nadekspresja kanalików nerkowych Cpt1a chroni przed zwłóknieniem nerek poprzez przywrócenie homeostazy mitochondriów. J Clin Invest. 2021;131(5):e140695.

22. Luo Z, Wang Y, Xue M, Xia F, Zhu L, Li Y, Jia D, Chen S, Xu G, Lei Y. Astragalozyd IV poprawia metabolizm tłuszczów w wątrobie starzejących się myszy poprzez ukierunkowanie na aktywność mitochondriów. J Cell Mol Med. 2021;25(18):8863–76.

23. Bhargava P, Schnellmann RG. Energetyka mitochondrialna w nerkach. Nat Rev Nephrol. 2017;13(10):629–46.

24. Jiang M, Bai M, Lei J, Xie Y, Xu S, Jia Z, Zhang A. Dysfunkcja mitochondrialna i przejście od AKI do CKD. Am J Physiol Renal Physiol. 2020;319(6): F1105–16.

25. Tang C, Cai J, Yin XM, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Dong Z. Mitochondrialna kontrola jakości w uszkodzeniu i naprawie nerek. Nat Rev Nephrol. 2021;17(5):299–318.

26. Zhao M, Liu S, Wang C, Wang Y, Wan M, Liu F, Gong M, Yuan Y, Chen Y, Cheng J, Lu Y, Liu J. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych łagodzą uszkodzenia i stany zapalne mitochondriów poprzez stabilizację mitochondrialnego DNA. ACS Nano. 2021;15(1):1519–38.

27. Cao H, Cheng Y, Gao H, Zhuang J, Zhang W, Bian Q, Wang F, Du Y, Li Z, Kong D, Ding D, Wang Y. Śledzenie in vivo pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych Funkcja mitochondriów w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym nerek. ACS Nano. 2020;14(4):4014–26.

28. Gu D, Zou X, Ju G, Zhang G, Bao E, Zhu Y. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek zrębowych łagodzą ostre uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne nerek poprzez hamowanie rozszczepienia mitochondrialnego przez miR{2}}. Komórki Macierzyste Int. 2016;2016:2093940.

29. Wang J, Wu H, Peng Y, Zhao Y, Qin Y, Zhang Y, Xiao Z. Egzosomy pochodzące z komórek macierzystych niedotlenienia tkanki tłuszczowej sprzyjają wysokiej jakości gojeniu się ran cukrzycowych, w tym aktywacji szlaków PI3K/Akt. J Nanobiotechnologia. 2021;19(1):202.

30. Liu W, Li L, Rong Y, Qian D, Chen J, Zhou Z, Luo Y, Jiang D, Cheng L, Zhao S, Kong F, Wang J, Zhou Z, Xu T, Gong F, Huang Y, Gu C, Zhao X, Bai J, Wang F, Zhao W, Zhang L, Li X, Yin G, Fan J, Cai W. Niedotlenione egzosomy pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych sprzyjają gojeniu się złamań kości poprzez transfer miR{{2} }. Acta Biomater. 2020;103:196–212.

31. Rong Y, Zhang J, Jiang D, Ji C, Liu W, Wang J, Ge X, Tang P, Yu S, Cui W, Cai W. Niedotlenienie wstępne małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pośredniczy w naprawie chrząstki w chorobie zwyrodnieniowej stawów poprzez dostarczanie miR { {1}}a-5str. Acta Biomater. 2021;122:325–42.

32. Yang C, Chen Z, Yu H, Liu X. Hamowanie zakłócacza wyciszania telomerowego 1- jak złagodzenie niedokrwienia nerek i zwłóknienia wywołanego urazem reperfuzyjnym poprzez blokowanie stresu oksydacyjnego za pośrednictwem PI3K/AKT. Drug Des Devel Ther. 2019;13:4375–87.

33. Qian Y, Qian C, Xie K, Fan Q, Yan Y, Lu R, Wang L, Zhang M, Wang Q, Mou S, Dai H, Ni Z, Pang H, Gu L. Sygnalizacja receptora P2X7 sprzyja zapaleniu w komórki miąższu nerki dotknięte uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym. Śmierć komórkowa Dis. 2021;12(1):132.

34. Hu MC, Shi M, Gillings N, Flores B, Takahashi M, Kuro OM, Moe OW. Rekombinowana alfa-Klotho może być profilaktyczna i terapeutyczna w progresji ostrej do przewlekłej choroby nerek i kardiomiopatii mocznicowej. Nerki Int. 2017;91(5):1104–14.

35. Dubois V, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B. Wyraźny, ale uzupełniający wkład izotypów PPAR w homeostazę energii. Śledztwo J Clin. 2017;127(4):1202–14.

36. Desvergne B, Wahli W. Receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów: jądrowa kontrola metabolizmu. Endocr Rev. 1999;20(5):649–88.

37. Libby AE, Jones B, Lopez-Santiago I, Rowland E, Levi M. Receptory jądrowe w nerkach podczas zdrowia i choroby. Mol Aspects Med. 2021;78:100935.

38. Bougarne N, Weyers B, Desmet SJ, Deckers J, Ray DW, Staels B, De Bosscher K. Molekularne działania PPARalpha w metabolizmie lipidów i stanach zapalnych. Endocr Rev. 2018;39(5):760–802.

39. Vega RB, Huss JM, Kelly DP. Koaktywator PGC-1 współpracuje z receptorem alfa aktywowanym przez proliferatory peroksysomów w kontroli transkrypcji genów jądrowych kodujących mitochondrialne enzymy utleniające kwasy tłuszczowe. Mol Cell Biol. 2000;20(5):1868–76.

40. Li SY, Susztak K. Rola koaktywatora gamma receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów 1alfa (PGC{3}}alfa) w chorobie nerek. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.

41. Fransen M, Lismont C, Walton P. Połączenie peroksysom-mitochondria: jak i dlaczego? Int J Mol Sci. 2017;18(6):1126.

42. Aparicio-Trejo OE, Avila-Rojas SH, Tapia E, Rojas-Morales P, Leon-Contreras JC, Martinez-Klimova E, Hernandez-Pando R, Sanchez-Lozada LG, PedrazaChaverri J. Chroniczne upośledzenie mitochondrialnej bioenergetyki i beta -utlenianie promuje eksperymentalne przejście AKI-do-CKD indukowane przez kwas foliowy. Free Radic Biol Med. 2020;154:18–32.

43. Eirin A, Lerman LO. Mezenchymalne pęcherzyki pozakomórkowe pochodzące z komórek macierzystych / zrębowych w przewlekłej chorobie nerek: czy już tam jesteśmy? Nadciśnienie. 2021;78(2):261–9.

44. Kurzhagen JT, Dellepiane S, Cantaluppi V, Rabb H. AKI: coraz bardziej rozpoznawalny czynnik ryzyka rozwoju i progresji CKD. J Nefrol. 2020;33(6):1171–87.

45. Zhu J, Lu K, Zhang N, Zhao Y, Ma Q, Shen J, Lin Y, Xiang P, Tang Y, Hu X, Chen J, Zhu W, Webster KA, Wang J, Yu H. Funkcje naprawcze mięśnia sercowego egzosomów z mezenchymalnych komórek macierzystych są wzmacniane przez niedotlenienie komórek poprzez przeniesienie mikroRNA-210 w sposób zależny od nSMazy2-. Komórki Artif Nanomed Biotechnologia. 2018;46(8):1659–70.

46. ​​Zhu LP, Tian T, Wang JY, He JN, Chen T, Pan M, Xu L, Zhang HX, Qiu XT, Li CC, Wang KK, Shen H, Zhang GG, Bai YP. Egzosomy pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych wywołane niedotlenieniem ułatwiają naprawę serca poprzez zapobieganie śmierci komórek zawału mięśnia sercowego za pośrednictwem miR{3}}b. Teranostyka. 2018;8(22):6163–77.

47. Xie YH, Xiao Y, Huang Q, Hu XF, Gong ZC, Du J. Rola szlaku CTRP6/AMPK w zwłóknieniu nerek poprzez promowanie utleniania kwasów tłuszczowych. Eur J Pharmacol. 2021;892:173755.

48. Chen YY, Chen XG, Zhang S. Lekarstwo modulacji metabolizmu lipidów przeciwko zwłóknieniu nerek. Acta Pharmacol Sin. 2021.

49. Chung KW, Lee EK, Lee MK, Oh GT, Yu BP, Chung HY. Upośledzenie PPARalfa i szlaku utleniania kwasów tłuszczowych pogarsza zwłóknienie nerek podczas starzenia. J Am Soc Nephrol. 2018;29(4):1223–37.

50. Han SH, Malaga-Dieguez L, Chinga F, Kang HM, Tao J, Reidy K, Susztak K. Delecja Lkb1 w komórkach nabłonka kanalików nerkowych prowadzi do CKD poprzez zmianę metabolizmu. J Am Soc Nephrol. 2016;27(2):439–53.

51. Jao TM, Nangaku M, Wu CH, Sugahara M, Saito H, Maekawa H, Ishimoto Y, Aoe M, Inoue T, Tanaka T, Staels B, Mori K, Inagi R. Regulacja w dół ATF6alpha PPARalpha promuje indukowaną lipotoksycznością cewkowo-śródmiąższową zwłóknienie. Nerki Int. 2019;95(3):577–89.

52. Spinelli JB, Haigis MC. Wielopłaszczyznowy wkład mitochondriów w metabolizm komórkowy. Nat Cell Biol. 2018;20(7):745–54.

53. Chung KW, Dhillon P, Huang S, Sheng X, Shrestha R, Qiu C, Kaufman BA, Park J, Pei L, Baur J, Palmer M, Susztak K. Uszkodzenie mitochondriów i aktywacja szlaku STING prowadzą do zapalenia nerek i zwłóknienie. Metabolizm komórkowy 2019;30(4):784–99.

Zhumei Gao1,2, Chuyue Zhang1,3, Fei Peng1, Qianqian Chen1, Yinghua Zhao4, Liangmei Chen5, Xu Wang1 i Xiangmei Chen1,2

1 Oddział Nefrologii, Pierwsze Centrum Medyczne Chińskiego Szpitala Ogólnego PLA, Instytut Nefrologii Chińskiej Armii Ludowo-Wyzwoleńczej, Państwowe Kluczowe Laboratorium Chorób Nerek, Narodowe Centrum Badań Klinicznych Chorób Nerek, Kluczowe Laboratorium Badań nad Chorobami Nerek w Pekinie, Pekin, Chiny.

2 Oddział Nefropatii Drugiego Szpitala Uniwersytetu Jilin, Changchun, Chiny.

3 Instytut Badań nad Nerkami, Narodowe Centrum Badań Klinicznych Geriatrii i Oddział Nefrologii, Szpital Zachodnich Chin Uniwersytetu Sichuan, Chengdu, Chiny.

4 Szkoła Medycyny Klinicznej, Uniwersytet Tsinghua, Pekin, Chiny.

5 Klinika Nefrologii, Pierwszy Szpital Stowarzyszony Uniwersytetu Jinan, Guangzhou, Chiny.