Identyfikacja i analiza funkcjonalna bifawonu jako nowego inhibitora przejściowych procesów aterogennych zależnych od waniloidu 4
Feb 22, 2022
Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.comwiedzieć więcej
Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman
Miażdżyca, postępująca choroba zapalna dużych tętnic, jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do rosnącego obciążenia śmiertelnością i zachorowalnością związaną z chorobami sercowo-naczyniowymi na całym świecie1. Kluczowym zdarzeniem inicjującym, które prowadzi do miażdżycy tętnic, jest zatrzymanie zmodyfikowanych cząsteczek lipoprotein o małej gęstości (oxLDL) w podśródbłonkowej przestrzeni wewnętrznej aorty, głównie w punktach rozgałęzień tętnic2. Podczas wczesnej miażdżycy, po dysfunkcji śródbłonka, krążące monocyty krwi migrują do obszarów błony wewnętrznej i różnicują się w makrofagi tkankowe3. W przestrzeniach śródbłonka aorty wiązanie i wychwyt oxLDL przez makrofagi wspomagane przez receptory zmiatające, takie jak SRA i CD36, tworzy pętlę sprzężenia miażdżycowo-zapalnego, prowadzącą do rozwoju komórek piankowatych obciążonych lipidami, co jest procesem krytycznym w miażdżycy2-8. Kaskady stanów zapalnych wywołanych przez komórki piankowate prowadzą do powstania wczesnej smugi tłuszczowej i ostatecznie do pojawienia się zaawansowanych zmian miażdżycowych, charakteryzujących się obecnością włóknistej czapeczki, zwapniałej tkanki, komórek odpornościowych, białek macierzy i lipidów2–10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) z podrodziny TRPV, nieselektywny, polimodalny kanał kationowy przepuszczalny dla Ca2 plus, jest powszechnie wyrażany w różnych typach komórek, w tym w makrofagach11-24. Wcześniej znany jako osmosensor, TRPV4 jest obecnie znany z reagowania na różnorodne bodźce biochemiczne i biomechaniczne, w tym ciepło, sztywność matrycy, osmolarność, czynniki wzrostu, pH i 4 estry forbolu11-24. Doniesiono, że TRPV4 pośredniczy w kilku funkcjach fizjologicznych, takich jak odczuwanie bólu w zapaleniu i neuropatiach18,22,23, różnicowanie i migracja miofibroblastów 17,25,26 oraz różnicowanie osteoklastów w kości27. Mutacje TRPV4 powiązano z kilkoma kanałopatiami28-31. Ostatnie badania przeprowadzone przez naszą grupę i inne wskazują na możliwą rolę tego kanału w niezliczonych stanach patologicznych, takich jak urazy płuc22,32, tworzenie komórek piankowatych14,16, zwłóknienie tkanek17,33, odpowiedź na ciało obce13 i rak34,35. Wcześniej wykazano rolę TRPV4 chroniącą przed miażdżycą, w której funkcja TRPV4 wywołana przez agonistę chemicznego w komórkach śródbłonka była związana z aktywacją eNOS i hamowaniem adhezji monocytów do komórek śródbłonka36. W przeciwieństwie do tego, niedobory funkcji TRPV4 powiązano z licznymi reakcjami miażdżycowo-zapalnymi, w tym dysfunkcją śródbłonka, zmniejszonym wytwarzaniem komórek piankowatych makrofagów i chorobami naczyniowymi14,16,37-39. Nasze laboratorium niedawno zidentyfikowało proaterogenną rolę TRPV4, dzięki czemu reguluje on tworzenie komórek piankowatych makrofagów wywołane przez oxLDL. Mechanicznie wykazaliśmy, że TRPV4 wpływa na wychwyt, ale nie na wiązanie oxLDL w makrofagach w sposób niezależny od CD36-14. W innym badaniu opisaliśmy zależne od TRPV4- zaostrzenie tworzenia komórek piankowatych indukowanego przez oxLDL w obecności lipopolisacharydu i zwiększającej się sztywności macierzy, zapewniając w ten sposób związek między mechanoczuniem a ryzykiem miażdżycy16. Rozpatrywane razem, odkrycia te sugerują, że TRPV4 jest atrakcyjnym celem w miażdżycy i innych chorobach, zachęcając w ten sposób do odkrycia drobnocząsteczkowych inhibitorów TRPV4, które można przełożyć na klinicznie skuteczne terapeutyki. Zastosowania naturalnych związków w lecznictwie zyskały na znaczeniu, głównie ze względu na potrzebę posiadania opłacalnych i biokompatybilnych związków w porównaniu z obecnie istniejącymi lekami syntetycznymi. Związki naturalne, takie jakflawonoidy, alkaloidy,polifenolei kurkuminoidy wpływają na choroby sercowo-naczyniowe poprzez różne mechanizmy, takie jak hamowanieprozapalnesygnały, uczulenie na insulinę i poprawę profili lipidowych we krwi poprzez celowanie w szlaki AMPK, COX1/2, eNOS i Nrf240-45. Ostatnie badania przeprowadzone przez wiele grup zidentyfikowały dwa flawonoidy, berberynę i apigeninę, jako potencjalne modulatory aktywności TRPV446,47. Opracowaliśmy i zastosowaliśmy półwysokoprzepustową metodę przesiewową w celu zidentyfikowania potencjalnych antagonistów TRPV4 z biblioteki naturalnych związków przy użyciu testu napływu Ca2 plus opartego na Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR). W niniejszym dokumencie przedstawiamy identyfikację i analizę funkcjonalną linkedyny, flawonu, jako nowego inhibitora procesów aterogennych zależnych od TRPV4- w makrofagach, kładąc w ten sposób podwaliny pod dalsze badania tego naturalnego związku jako naturalnego środka przeciwmiażdżycowego związek cząsteczkowy. Stwierdzono, że linkedin wykazuje działanie neuroprotekcyjne,antyrakotwórcze, orazprzeciwzapalnyrole48,49. Opisujemy mechanizm działania Linkedin przeciwko TRPV4 w warunkach tworzenia makrofagowych komórek piankowatych przy użyciu licznych testów biochemicznych i komórkowych.
Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej
Materiały i metody Hodowla zwierząt i komórek
Zakupiliśmy kongeniczne myszy C57BL/6 typu dzikiego (WT) z Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). We wszystkich doświadczeniach na zwierzętach przestrzegano wytycznych Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Maryland, a autorzy przestrzegali wytycznych ARRIVE. W celu izolacji indukowanych tioglikolanem mysich makrofagów rezydentnych (MRM) po 4 dniach dootrzewnowego wstrzyknięcia tioglikolanu pobierano popłuczyny z otrzewnej i komórki utrzymywano w 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej DMEM7,14,16. Linię komórkową mysich makrofagów (RAW264.7) i ludzkie fibroblasty skórne (HDF) zakupiono z ATCC (Manassas, VA) i hodowano odpowiednio z DMEM lub MEM (Gibco, Waltham, MA). Makrofagi pochodzące z mysiego szpiku kostnego (BMDM) pobrano od 6- do 7-tygodniowych myszy, jak opisano wcześniej14,50,51. W skrócie, pobrano kości udowe od myszy WT i TRPV4 KO i szpik kostny z kości udowych wypłukano pełną pożywką DMEM z 10% FBS. Zawieszone komórki szpiku kostnego przefiltrowano przez filtr 70 µm (BD Bioscience), odwirowano i utrzymywano w pożywce DMEM uzupełnionej M-CSF (25 ng/ml) przez 7-8 dni w temperaturze 37 stopni, aby umożliwić różnicowanie do makrofagów.
Odczynniki
Linkedynę i GSK1016790A (GSK101) zakupiono z Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), a zestaw testowy FLIPR Calcium 6 otrzymano z Molecular Device (Sunnyvale, CA). Ludzki natywny LDL (VLDL) zakupiono od Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). Inkubowaliśmy LDL z 5 µM CuSO4 przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni, aby przygotować LDL utleniony miedzią (oxLDL)7,14,16. DiI-oxLDL znakowany barwnikiem fluorescencyjnym zakupiono z firmy Invitrogen (Carlsbad, CA), a MCSF z firmy R&D (Minneapolis, MN). Przeciwciała do analizy FACS to: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 i TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z PE pochodziły z R&D (Minneapolis, MN), a kontrole izotypowe skoniugowane z PE pochodziły z BD (Franklin Lake, NJ). Do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qRT-PCR) użyliśmy zestawu RNeasy firmy QIAGEN (Redwood City, CA). Wszystkie startery zakupiono od Bio-Rad (Hercules, CA). Pożywki do hodowli komórkowych, produkty związane z hodowlą komórkową i odczynniki do analizy Western blot otrzymano z firmy Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).
Cistanche przeciw zmęczeniu
Przesiewanie półwysokoprzepustowe
Podjęliśmy się półwysokoprzepustowego badania przesiewowego dla antagonistów Trpv4 z biblioteki 2000 naturalnych związków (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) przy użyciu fluorymetrycznego czytnika płytek do obrazowania (FLIPR) opartego na teście napływu wapnia14,17. Zidentyfikowaliśmy ginkgetin (GGT), jako nowego antagonistę TRPV4. Pierwotne i wtórne badanie przesiewowe przeprowadzono za pomocą RAW264.7, HDF i BMDM w celu oceny zdolności Linkedyny i innych kandydatów do hamowania wywoływanego TRPV4-Ca2 plus infuks14,17. Jako kontrole użyliśmy A23187, jonoforu wapnia, TRPV4 null BMDMs i GSK219, selektywnego antagonisty TRPV417. Po drugim badaniu przesiewowym zidentyfikowaliśmy sześć związków wykazujących ponad trzykrotne hamowanie napływu Ca2 za pośrednictwem TRPV4-w porównaniu z kontrolą z nośnikiem. Linkedynę zidentyfikowano jako najsilniejszy inhibitor aktywności TRPV4. BMDM (5 x 104 komórek/studzienkę) posiano na pokrytych kolagenem (10 µg/ml) dołkowych czarnych płytkach z przezroczystym dnem i inkubowano w 37°C, 5% CO2. W dniu eksperymentu komórki obciążono barwnikiem wapniowym 6 w HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecydem i inkubowano przez 45 min w 37 stopniach. Po inkubacji do każdej studzienki dodano związki z biblioteki do końcowego stężenia 2 µM. Płytki inkubowano przez kolejne 45 min w 37 stopniach . Napływ Ca2 plus indukowano przez dodanie 10 nM agonisty TRPV4 GSK1016790A w komórkach wstępnie traktowanych nośnikiem lub związkiem i rejestrowano przez pomiar ΔF/F (Max-Min), jak opisano wcześniej17. Dane przedstawiono jako jednostki względnej fluorescencji (RFU).
Immunobloty
Wywołane tioglikolanem makrofagi otrzewnowe wysiano w 10% FBS zawierającym DMEM i inkubowano przez noc. Nieprzywierające komórki odmyto i do płytki dodano 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zawierającej DMEM i inkubowano przez 3 godziny przed traktowaniem linkedyną. Aby określić ekspresję białek CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 i GAPDH, lizaty całych komórek przygotowano z komórek traktowanych przez noc linkedyną (1 i 5 µM) lub nośnikiem w obecności lub przy braku oxLDL (25 µg/ml ). W celu określenia poziomów ekspresji p-JNK i JNK wyzwalanych przez LPS, komórki wstępnie traktowano linkedyną (5 i 10 µM) przez 3 godz., a następnie stymulowano LPS E. coli przez 30 min. Lizaty całych komórek przygotowano z dwukrotnie przemytych komórek (zimny w lodzie PBS) przy użyciu buforu RIPA z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteazy (Thermo Scientific, MA). Bloty sondowano króliczymi anty-TRPV4 (Alomone Lab, Jerozolima, Izrael), anty-mysim CD36 (R&D, Minneapolis, MN), króliczymi anty-TLR4, króliczymi anty-TLR6, króliczymi anty-JNK i króliczymi anty-p- Pierwszorzędowe przeciwciała JNK (Cell Signaling, Danvers, MA), a następnie przeciwciała drugorzędowe przeciw króliczym i przeciw mysim sprzężonym z HRP (R&D, Minneapolis, MN). Bloty usunięto i ponownie sondowano IgG anty-GAPDH (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) w celu kontroli obciążenia.
Tworzenie komórek piankowych.MRM wyzwalane tioglikolanem wysiano na szklane szkiełka nakrywkowe w 12-studzienkowej płytce z DMEM, 10% FBS i inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 2 godziny. Do komórek dodano GGT (1 lub 10 µM) i po 3 godzinach inkubacji dodano oxLDL (50 µg/ml) i hodowle inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Natywny LDL (50 ug/ml) dodano do studzienek grupy kontrolnej i inkubowano przez noc. Komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie, a następnie wybarwiono Oil Red O w celu ilościowego określenia wytwarzania komórek piankowatych.
Transdukcja wektora adenowirusowego.Zebraliśmy konstrukty adenowirusowe do ekspresji Ad(RGD)-mysiego TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) i pusty wektor adenowirusowy, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), z Vector Biolabs, Malvern, PA. We wszystkich eksperymentach stosowaliśmy 1× 108 pfu/ml. Do badań wytwarzania komórek piankowatych, mysie makrofagi otrzewnowe inkubowano z Ade-TRPV4 lub Ade-Vec w pożywce DMEM przez 72 godziny przed dodaniem oxLDL w celu wytworzenia makrofagowych komórek piankowatych.
Wiązanie i wchłanianie ox-LDL.Aby ocenić wiązanie, makrofagi otrzewnowe traktowano dwiema dawkami (1 lub 10 µM) linkedyny lub nośnika przez 3 godziny i inkubowano z DiI-oxLDL w 4 stopniach przez jedną godzinę. Po wstępnym potraktowaniu linkedyną lub nośnikiem, komórki inkubowano z DiI-oxLDL w 37°C przez 30 min w celu oceny wychwytu. Obrazy uchwycono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (63x), a obraz J wykorzystano do ilościowego określenia wyników.
Analiza cytometrii przepływowej.Wywołane tioglikolanem makrofagi otrzewnowe hodowano w DMEM, 10% FBS przez 24 godziny. Nieprzywierające komórki wypłukano, dodano pożywkę wolną od surowicy i komórki inkubowano przez 2 godziny, po czym dodano 5 µM GGT lub nośnik i inkubację kontynuowano przez 3 godziny. Traktowane komórki zdrapano z płytki i ponownie zawieszono w PBS, 2% BSA. Komórki inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 45 min, a następnie 30 min z drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z PE. Do uzyskania danych zastosowano cytometr przepływowy FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Kanada). Wszystkie dane zostały przetworzone przy użyciu oprogramowania FlowJo.
qRT‑PCR.Makrofagi indukowane tioglikolanem traktowano 5 µM linkedyną lub nośnikiem przez 3 godziny; Do nośnika lub komórek traktowanych linkedyną dodano 25 µg/ml oxLDL i inkubację kontynuowano przez noc. Do ekstrakcji całkowitego RNA użyto zestawu RNeasy Micro Kit (nr 74,004) firmy QIAGEN, a do odwrotnej transkrypcji RNA użyto zestawu Universal SYBR Green One-Step Kit firmy Bio-Rad. Do gromadzenia danych zastosowano termocykler C1000 Touch (Bio-Rad). Ekspresję genu określono jako ilość mRNA specyficznego dla genu względem mRNA GAPDH przy użyciu metody porównawczej CT opisanej w biuletynie użytkownika systemu Bio-Rad qRT-PCR.
Analiza statystyczna.Dane przedstawiono jako średnią ± SEM biologicznych trzech powtórzeń. Zastosowano oprogramowanie GraphPad Prism 7.0, a obliczenia przeprowadzono przy użyciu testu t-Studenta dla dwóch grup lub jednostronnej analizy ANOVA dla wielu grup.
Zatwierdzenie etyczne.Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i zostały zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Maryland-College Park.
Wyniki in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>potrójny; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">
Rysunek 1. Półwysokoprzepustowa identyfikacja Linkedin w oparciu o badania przesiewowe jako nowego inhibitora TRPV4 z biblioteki naturalnych związków. (A) Schemat blokowy pokazujący przepływ pracy prowadzący do identyfikacji ginkgetyny jako potencjalnego inhibitora TRPV4 z biblioteki 2000 naturalnych związków. (B) Reprezentatywne nagranie FlexStation 3 pokazujące hamujący wpływ 6 naturalnych związków na wywołany agonistą TRPV4 (GSK1016790A) Ca2 plus napływ do BMDM obciążonych barwnikiem wapnia 6 podczas wtórnego badania przesiewowego. Wstępne traktowanie wszystkimi 6 związkami wykazało działanie hamujące na zależny od TRPV4- napływ Ca2 plus napływ w porównaniu z komórkami traktowanymi wstępnie nośnikiem (kontrola negatywna; nośnik plus GSK1016790A (10 nM)) lub jonofor wapnia (A23187, 2 μM). Jako kontrolę negatywną użyliśmy selektywnego antagonisty TRPV4, GSK2193874 (10 nM). Wszystkie eksperymenty powtórzono trzykrotnie w czterech powtórzeniach. RFU: jednostka względnej fluorescencji.
Hamowanie TRPV4 przez GGT znosi indukowane przez oxLDL tworzenie komórek piankowatych makrofagów.Nasze poprzednie badania wykazały, że TRPV4-wywołany napływ Ca2 plus bierze udział w tworzeniu komórek piankowatych za pośrednictwem oxLDL 14,16. Dlatego oceniliśmy możliwość, że tworzenie komórek piankowatych było hamowane przez antagonizację aktywności TRPV4 za pośrednictwem GGT. Mysie makrofagi otrzewnowe typu dzikiego inkubowano z oxLDL w celu wywołania tworzenia komórek piankowatych w obecności lub przy braku GGT i analizowano za pomocą barwienia Oil Red O. Zgodnie z oczekiwaniami stwierdziliśmy, że wytwarzanie komórek piankowatych wzrosło pięciokrotnie w makrofagach traktowanych oxLDL w porównaniu z natywnym LDL (ryc. 2A, B). Jednak traktowanie makrofagów GGT (1 lub 10 µM) przed stymulacją oxLDL znacząco zmniejszyło procent komórek piankowatych (Fig. 2A, B). Podsumowując, odkrycia te sugerują hamujący wpływ GGT na tworzenie komórek piankowatych makrofagów, prawdopodobnie ukierunkowanych na wywołany przez TRPV4- napływ Ca2 plus. Ponadto nadekspresjonowaliśmy TRPV4 w makrofagach zerowych TRPV4 przy użyciu konstruktu adenowirusa, a następnie indukowaliśmy tworzenie komórek piankowatych przy użyciu oxLDL w obecności GGT. Stwierdziliśmy, że nadekspresja TRPV4 zwiększyła tworzenie komórek piankowatych, które zostało zablokowane, gdy wstępnie potraktowaliśmy komórkę GGT, co sugeruje, że hamowanie proaterogennego tworzenia komórek piankowatych przez GGT jest zależne od TRPV4 (ryc. 2C, D).
GGT nie blokuje podstawowego poziomu ekspresji TRPV4 i receptorów zapalnych.Receptor zamiatający CD36 odgrywa główną rolę w wychwytywaniu i wiązaniu oxLDL oraz tworzeniu komórek piankowatych, kluczowych procesach w miażdżycy4–7,54,55. Ostatnio coraz więcej dowodów wskazuje na udział receptorów Toll-podobnych w miażdżycy2,4,56. Aby zbadać, czy GGT blokuje tworzenie komórek piankowatych poprzez wpływanie na ekspresję CD36, TLR4, TLR6 i TRPV4, wykonaliśmy analizę immunoblot przy dwóch stężeniach GGT (1 lub 5 µM). Stwierdziliśmy podobne poziomy ekspresji CD36, TRPV4, TLR6 i TLR4 w porównaniu z nietraktowaną kontrolą (ryc. 3A-D). Analiza cytometrii przepływowej również nie wykazała istotnych różnic w ekspresji na powierzchni komórek białek z lub bez traktowania GGT (ryc. 3E–H, I–L). Biorąc pod uwagę wszystkie razem, wyniki te sugerują, że GGT blokuje tworzenie komórek piankowatych makrofagów bez hamowania podstawowych poziomów powierzchniowej ekspresji TRPV4, CD36, TLR4 i TLR6.
Figura 2. Hamowanie TRPV4 przez linkedynę znosi indukowane przez oxLDL tworzenie komórek piankowatych makrofagów. (A) Mysie makrofagi otrzewnowe indukowane tioglikolanem traktowano przez noc 50 µg/ml oxLDL, po czym następowała 3 h wstępna inkubacja z nośnikiem lub 1 lub 10 µM linkedyny. Komórki traktowano 50 µg/ml natywnego LDL (VLDL) jako kontrolę. Oryginalne powiększenie: 40x. (B) Kwantyfikacja wyników jest pokazana w (A). n=500 komórek/stan. Test t-Studenta; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>
Wychwyt oxLDL, ale brak wiązania przez makrofagi jest tłumiony przez GGT. Ponieważ wcześniej wykazano, że TRPV4 odgrywa rolę w wychwytywaniu oxLDL i tworzeniu komórek piankowatych14,16, oceniliśmy, czy traktowanie GGT powodowało upośledzenie wiązania oxLDL na powierzchni makrofagów. Makrofagi otrzewnowe WT traktowano GGT przed inkubacją z DiI-oxLDL w 4 stopniach i oceniano wiązanie. Wyniki wskazują, że wiązanie oxLDL na powierzchni makrofagów nie było znacząco utrudnione przez traktowanie GGT (1 lub 10 µM) w porównaniu z kontrolą nośnika (ryc. 5A-C). Po ustaleniu, że GGT nie hamuje wiązania oxLDL, postanowiliśmy następnie ustalić, czy wychwyt oxLDL w makrofagach został osłabiony przez leczenie GGT. Co ciekawe, nasze wyniki wskazały, że wystąpiło znaczące zahamowanie wychwytu oxLDL w makrofagach w komórkach wstępnie traktowanych GGT w porównaniu z grupą traktowaną nośnikiem (Fig. 6A, B). Biorąc wszystko pod uwagę, wyniki te sugerują, że GGT blokuje wychwyt oxLDL, ale nie wiąże się z makrofagami.
GGT blokuje indukowaną przez oxLDL ekspresję TRPV4 w makrofagach.
Ponieważ nasze wcześniej opublikowane badania wykazały, że TRPV4-wywołany Ca2 plus odgrywa rolę w tworzeniu komórek piankowatych makrofagów za pośrednictwem oxLDL14,16, staraliśmy się ustalić, czy GGT blokuje tworzenie komórek piankowatych poprzez tłumienie ekspresji CD36 indukowanej przez oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 lub TRPV4. Stwierdziliśmy, że nocna stymulacja makrofagów za pomocą oxLDL spowodowała znaczne zwiększenie ekspresji białek TRPV4 w porównaniu z LDL, podczas gdy ekspresja innych receptorów (CD36, TLR2, TLR4 i TLR6) pozostała niezmieniona (ryc. 4A-F). Wstępne traktowanie komórek GGT przed stymulacją oxLDL selektywnie obniżało poziom ekspresji białek TRPV4 w porównaniu z traktowaniem nośnikiem (ryc. 4A-F). Podsumowując, odkrycia te sugerują hamujący wpływ GGT na ekspresję białka TRPV4, które może być częściowo zaangażowane w hamowanie tworzenia komórek piankowatych przez GGT.
Rysunek 3. Traktowanie linkedyną nie zmienia całkowitego białka ani ekspresji powierzchniowej TRPV4, CD36 i TLR w makrofagach. (A-D) Immunobloty lizatów całych komórek makrofagów po całonocnym traktowaniu 1 lub 5 µM linkedyną lub nośnikiem. Reprezentatywne immunobloty pokazują całkowitą ekspresję białka CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) i TLR4 (D) w komórkach traktowanych i nietraktowanych linkedyną. Wykonano trzy niezależne powtórzenia biologiczne i 3 powtórzenia eksperymentalne dla każdego zestawu eksperymentów. (E-H) Analiza metodą cytometrii przepływowej makrofagów traktowanych przez noc 5 µM linkedyną lub nietraktowanych, wykazująca ekspresję powierzchniową TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) i TLR6 (G) w komórkach nietraktowanych i traktowanych linkedyną. Przeanalizowano trzy niezależne replikacje biologiczne i 30 000 komórek na stan. (I–L) Ilościowa analiza wyników z (E–H). Analizowane za pomocą dwustronnego testu t z 99-procentowym przedziałem ufności. Liczba komórek w eksperymencie, 30,000; dwa eksperymentalne powtórzenia.
GGT blokuje proaterogenną aktywację JNK2 i stan zapalny w makrofagach. Opublikowane raporty z naszego laboratorium i innych wykazały, że aktywacja JNK2 odgrywa kluczową rolę w tworzeniu komórek piankowatych i miażdżycy7,57. Aby określić, czy GGT może hamować aktywację JNK1/2, makrofagi potraktowano GGT, a następnie stymulację LPS lub oxLDL. Wyniki analizy immunoblot wykazały, że leczenie GGT istotnie hamowało fosforylację JNK1/2 indukowaną przez oxLDL lub LPS w porównaniu z nietraktowaną lub traktowaną natywnym LDL kontrolą (ryc. 7A-D). Wykazano, że aktywacja JNK w makrofagach indukuje transkrypcję mediatorów prozapalnych związanych z miażdżycą58–60. Aby określić, czy GGT może potencjalnie blokować ekspresję tych regulatorów prozapalnych w makrofagach, komórki poddane wstępnej obróbce GGT stymulowano oxLDL, a poziomy ekspresji mRNA TNF, IL6, IL12, IL1 i MCP1 określono ilościowo za pomocą analizy qRT-PCR. Wykryliśmy znaczącą regulację w dół w indukowanych oxLDL poziomach ekspresji mRNA TNF, IL12, IL1 i MCP1 w komórkach traktowanych GGT w porównaniu z kontrolami traktowanymi nośnikiem (ryc. 7E-I). Podsumowując, wyniki te sugerują, że GGT blokuje proaterogenną aktywację JNK2 i ekspresję genów zapalnych w odpowiedzi na stymulację oxLDL w makrofagach. Omówienie Wiadomo, że naturalne związki, takie jak flawonoidy i polifenole, modulują odpowiedź sercowo-naczyniową za pomocą różnych mechanizmów, takich jak hamowanie sygnałów prozapalnych, uczulenie na insulinę, stan oksydacyjny i poprawa profilu lipidów we krwi40-45. W niniejszym dokumencie opisujemy pół-wysokoprzepustową identyfikację opartą na badaniach przesiewowych i funkcjonalną charakterystykę linkedyny, flawonu, jako nowego inhibitora zależnych od TRPV 4-proterogennych/zapalnych procesów w makrofagach. W szczególności wykazaliśmy, że i) ginkgetyna blokuje za pośrednictwem TRPV4- napływ Ca2 plus do makrofagów, ii) blokada funkcji ginkgetyny w funkcji TRPV4 znacząco zmniejsza tworzenie komórek piankowatych indukowane przez oxLDL poprzez hamowanie wychwytu oxLDL przez makrofagi, oraz iii) blokowanie ginkgetyny Indukowana przez LPS i oxLDL fosforylacja JNK1/2, ekspresja białek TRPV4 i ekspresja genów zapalnych. Podsumowując, wyniki naszego badania wykazały, że ginkgetyna hamuje proaterogenną/zapalną funkcję makrofagów w sposób zależny od TRPV4-. Miażdżyca tętnic, choroba aorty, jest początkowo napędzana stanem zapalnym i przekrwieniem makrofagów za pomocą oxLDL, indukując tworzenie się komórek piankowatych makrofagów, które następnie rozwijają się w miażdżycę2-10. Ponieważ tworzenie komórek piankowatych jest kluczowym procesem w miażdżycy, zrozumienie i manipulowanie tworzeniem komórek piankowatych może mieć potencjał terapeutyczny. Wiadomo, że makrofagi eksprymują szereg kanałów jonowych i pomp penetrujących błonę, w tym TRPV4, mechanowrażliwy polimodalny Ca2 plus przepuszczalny kanał jonowy, który jest aktywowany zarówno przez bodźce fizyczne, jak i biochemiczne11-24. Opublikowane badania przeprowadzone przez nasze laboratorium i inne instytucje zidentyfikowały rolę TRPV4 w zapaleniu makrofagów i tworzeniu komórek piankowatych indukowanym oxLDL14-16,26. TRPV4 może zatem służyć jako realny cel do tłumienia procesów proaterogennych.
Figura 5. Linkedyna nie hamuje wiązania DiI-oxLDL z makrofagami. Makrofagi wstępnie traktowano nośnikiem lub linkedyną (1 lub 10 µM) przez 3 godziny, a następnie inkubowano z oxLDL znakowanym DiI (2,5 µg/ml) przez 1 godzinę w 4 stopniach. (A) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe fluorescencyjne (oryginalne powiększenie, 63x) wiązania DiI-oxLDL na powierzchni błony makrofagów (n=20 komórek/stan). (B) Wyniki z eksperymentu A pokazane jako wykres wykresu przy użyciu oprogramowania NIH ImageJ. (C) Analiza ilościowa wyników z komórek A. n=20/stan. w poprawie miażdżycy poprzez zmniejszenie MMP-2 i MMP-9 oraz zwiększenie poziomów NO i NOS w aorcie piersiowej szczura52. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że ginkgetyna blokuje TRPV4-wywołany Ca2 plus napływ w makrofagach. Mechanicznie wykazaliśmy, że ginkgetyna blokuje wychwyt oxLDL, ale nie wiąże się z makrofagami. Badania przeprowadzone in vivo i in vitro sugerowały kluczową rolę CD36 jako głównego receptora zmiatającego w wychwytywaniu oxLDL i tworzeniu komórek piankowatych makrofagów2-7. Wykazano, że myszy zerowe CD36 bez ApoE lub LDLR są mniej podatne na rozwój zmian miażdżycowych5,6. Wcześniejsze badania z naszej grupy zidentyfikowały zasadniczą rolę kaskady sygnałowej CD36-JNK w tworzeniu komórek piankowatych makrofagów7. Receptory Toll-podobne TLR2, TLR4 i TLR6 działają jako koreceptory poprzez interakcję z CD36 i wykazano, że biorą udział w miażdżycy2,56,63. Zbadaliśmy możliwość, że brak tworzenia komórek piankowatych obserwowany w makrofagach traktowanych linkedyną był spowodowany zmniejszoną ekspresją białek CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 lub TLR6. Co ciekawe, leczenie linkedyną nie zmniejszyło znacząco ekspresji białek CD36, TLR2, TLR4 lub TLR6 na poziomach podstawowych lub w warunkach stymulowanych oxLDL. Jednak Linkedin specyficznie blokował indukowaną przez oxLDL regulację w górę ekspresji białek TRPV4, podczas gdy jej ekspresja na poziomie podstawowym pozostała niezmieniona. Biorąc pod uwagę wszystkie razem, wyniki te sugerują, że ginkgetyna blokuje indukowane przez oxLDL tworzenie komórek piankowatych poprzez mechanizm niezależny od ekspresji CD36 i TLR, ale zależny od TRPV4. Wcześniejsze badania z naszej grupy i innych wykazały, że aktywacja JNK2 bierze udział w tworzeniu komórek piankowatych i rozwoju zmian miażdżycowych7,57. Doniesiono również, że JNK bierze udział w modulacji MMP-9 i MMP-13, które ulegają nadekspresji w zmianach miażdżycowych64–68. Biorąc pod uwagę rozpoznany związek JNK w procesach aterogennych, chcieliśmy ustalić, czy ginkgetyna może hamować aktywację JNK. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, nasze wyniki wykazały również, że ginkgetyna blokuje wywołaną bodźcem zapalnym fosforylację JNK2 w makrofagach. Wynik ten sugeruje możliwy mechanizm, dzięki któremu Linkedin blokuje tworzenie komórek piankowatych. Ponadto, stwierdziliśmy znaczne zmniejszenie indukowanej przez oxLDL ekspresji mRNA TNF, IL12, IL1 i MCP1 w komórkach traktowanych ginkgetiną w porównaniu z kontrolą nośnika, podkreślając potencjalne przeciwzapalne role ginkgetyny w odpowiedzi na oxLDL. Podsumowując, nasze wyniki wykazały, że ginkgetyna hamuje proaterogenną i zapalną funkcję makrofagów w sposób zależny od TRPV4-. Te odkrycia wzmacniają zatem uzasadnienie stosowania naturalnych związków w opracowywaniu potencjalnych środków terapeutycznych i/lub odczynników chemoprewencyjnych.
Bibliografia
1. Barquera, S. i in. Globalny przegląd epidemiologii miażdżycowej choroby sercowo-naczyniowej. Łuk. Med. Res. 46, 328-338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te biologia komórkowa makrofagów w miażdżycy. Komórka 145, 341-355 (2011).
3. Libby, P. Zapalenie w miażdżycy. Natura 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokiny, metabolizm lipidów makrofagów i komórki piankowate: implikacje dla terapii chorób sercowo-naczyniowych. Wałówka. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. i in. Ukierunkowane zakłócenie receptora zmiatającego CD36 klasy B chroni przed rozwojem zmian miażdżycowych u myszy. J. Clin. Inwestować. 105, 1049-1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV i in. Receptory zmiatające klasy AI/II i CD36 są głównymi receptorami odpowiedzialnymi za wychwyt zmodyfikowanej lipoproteiny o małej gęstości, co prowadzi do obciążenia lipidami makrofagów. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO i in. Do tworzenia makrofagowych komórek piankowatych niezbędna jest kaskada sygnalizacyjna zależna od CD36-. Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Miażdżyca – choroba zapalna. N Engl J Med. 340(2), 115-126 (1999).
9. Libby P. Te molekularne mechanizmy powikłań zakrzepowych miażdżycy. J. Stażysta Med. 517-527, 2008.
10. Lusis, AJ Miażdżyca. Natura 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD i in. Ultraszybka aktywacja kanałów jonowych TRPV4 przez siły mechaniczne przyłożone do integryn beta1 na powierzchni komórki. Liczba całkowita. Biol. (Camb). 2(9), 435-442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-Oś sygnalizacji mechanotransdukcji TAZ w sztywności macierzy i indukowanej przez TGF 1-przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym. Komórka Mol. Bioeng.12, 139-152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Przejściowy potencjał receptora waniloidowego 4 jest wymagany do odpowiedzi na ciało obce i tworzenia gigantycznych komórek. Jestem. J. Pathol. 189(8), 1505-1512 (2019).
14. Goswami, R. i in. Przepuszczalny dla wapnia kanał TRPV4 jest nowym regulatorem tworzenia komórek piankowatych makrofagów indukowanych przez utleniony LDL. Wolna Rada. Biol. Med. 110, 142-150 (2017).
