Identyfikacja siedemnastu składników w Cistanches Herba hodowanych na pustyni Tarim za pomocą HPLC-MS

NAN Ze-dong1 ,ＲEN Hua-zhong1 ,ZHAO Ming-bo2 ,JIANG Yong2 ,TU Peng-fei2*

( 1. Leshan Vocational and Technical College, Leshan 614000, Chiny; 2. Państwowe kluczowe laboratorium leków naturalnych i biomimetycznych, Szkoła Nauk Farmaceutycznych, Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego, Pekin 100191, Chiny)

[Abstrakcyjny]Cel: Identyfikacja składników chromatograficznych 60-procentowego ekstraktu metanolowego wCistanches deserticola Herbahodowane na pustyni Tarim metodą HPLC-MS．metoda: Analizę HPLC-MS przeprowadzono na kolumnie Agilent ZOＲBAX Eclipse Plus C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm). Fazą ruchomą był acetonitryl-0. 1-procentowy wodny roztwór kwasu mrówkowego metodą elucji gradientowej przy szybkości przepływu 1 ml·min-1, a długość fali wykrywania wynosiła 254 nm. Temperaturę kolumny ustawiono na 25 stopni, a objętość wstrzyknięcia wynosiła 10 μl. ＲWynik: Szesnaście pików chromatograficznych / siedemnaście składników zostało dokładnie zidentyfikowanych poprzez porównanie czasu retencji, mas cząsteczkowych i jonów fragmentacyjnych wyizolowanych i zidentyfikowanych związków． Te składniki chromatograficzne określono jako iglaste, demetylosyringinę, syringinę, echinakozyd, cistanozyd A, werbaskozyd (tubulozyd A), cistanozyd B, izowerbaskozyd, 2'-acetylocistanozyd A, cistanozyd C, izocystanozyd C, 2'-acetylowerbaskozyd, tubulozyd B, epimerydynozyd A, cistanozyd K i cistanozyd J．

Wniosek: Metoda HPLC-MS jest odpowiednia do identyfikacji składników chromatograficznych 60-procentowego ekstraktu metanolowego w Cistanches Herba． To badanie dostarczy naukowych dowodów na wszechstronną analizę składników chemicznych tego zioła leczniczego．

[Słowa kluczowe] Cistanches deserticolaHerba; Cistanche; HPLC-MS; ekstrakt metanolowy

Cistanche deserticola YCMa

Cistanche deserticola, znany również jako „pustynny żeń-szeń”,jest znanym tonikiem medycyny chińskiej, który występuje w Mongolii Wewnętrznej, Ningxia, Gansu i Xinjiang w Chinach [1].Ma działanie tonizujące yang nerek, korzystnie wpływa na esencję krwi, nawilża jelita i wypróżnia. Jest powszechnie stosowany w klinikach w leczeniu męskiej impotencji, niepłodności żeńskiej, zimnego bólu w talii i kolanie, zastoju krwi w zaparciachitd. [2-3].Cistanche deserticola maw pierwszej części Farmakopei Chińskiej (wydanie z 2015 r.) znajduje się suszona mięsista łodyga Cistanche deserticola i Cistanche tubulosa (4). Nasz zespół badawczy od wielu lat prowadzi systematyczne i dogłębne badania roślin Cistanche.Składnikami chemicznymi roślin Cistanche są głównie glikozydy fenyloetanoidowe, oprócz irydoidów i ich glikozydów, lignany i ich glikozydy, glikozydy alkoholu benzylowego itp.[5]. Współczesne badania farmakologiczne wykazują, że glikozydy fenyloetanolu, główne składniki tego rodzaju, mają działanie neuroprotekcyjne, przeciwutleniające, chroniące wątrobę, przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe, przeciwzapalne i inne [6-11].

Żeń-szeń pustynny

W Chinach,Cistanche deserticolawystępuje w zachodniej Mongolii Wewnętrznej, północnym Sinciangu i dorzeczu Qaidam w Qinghai, ale nie w dorzeczu Tarim w południowym Xinjiangu. Pod koniec lat 90., aby chronić pole naftowe Tazhong i kontrolować pustynię, kwatera główna pola naftowego wprowadziła dużą liczbę dendronów z amunicją Haloxylon wokół pola naftowego Tazhong i po obu stronach pustynnej autostrady oraz zaszczepiła dendrony z amunicją Haloxylon cistanche, która została ponad 10 lat. Dzięki ciepłemu klimatowi w południowym Sinciangu i dobrym warunkom nawadniania kropelkowego w bazie olejowej plon cistanche deserticola jest bardzo wysoki, a plon świeżego cistanche deserticola na mu sięga ponad 500 kg [8]. Wiele składników chemicznych w Cistanche deserticola wytworzyło dużą liczbę izomerów z powodu różnych pozycji podstawników w połączeniach. Powoduje to duże trudności w identyfikacji piku chromatograficznego tego materiału leczniczego. Trudno jest dokładnie zidentyfikować składniki piku chromatograficznego, opierając się tylko na LC-MS bez związków monomerów jako kontroli. Dlatego niewiele jest doniesień literaturowych na temat tej pracy we wczesnym stadium. Autor wyizolował wiele związków monomerycznych [9-11] z Cistanche deserticola uprawianej we wczesnym stadium na pustyni Tazhong. Dzięki tym związkom monomerów otrzymanym na wczesnym etapie dokładnie zidentyfikowano częściowe piki chromatograficzne HPLC 60% metanolowego ekstraktu z Cistanche deserticola. Pozwoli to nie tylko uniknąć ponownej identyfikacji niektórych znanych związków w składnikach chemicznych Cistanche deserticola, ale także zapewni pewne odniesienie do dalszych badań nad kontrolą jakości materiału leczniczego. W tym artykule za pomocą HPLC-MS zidentyfikowano 17 składników 60-procentowego metanolowego ekstraktu z Cistanche deserticola.

Plasterek cistanche deserticola

Kliknij tutaj, aby zobaczyć produkty Cistanche

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

1.Materiał

Inova-500 instrument do magnetycznego rezonansu jądrowego (Varian, USA); Spektrometr masowy 6320IonTrap LC-MS, kolumna EclipseXDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) (Agilent, USA); waga elektroniczna QUINTIX{9}}CN typ 1/10000 (Sedaris Division); myjka ultradźwiękowa KQ{12}}DV (Jiangsu Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); KMUP - Ⅰ Trace Analytical Ultra Pure System wytwarzania wody (Chengdu Haochun Instrument Equipment Co., Ltd.).

39 substancji kontrolnych użytych w tym eksperymencie zostało wyizolowanych przez autora na wczesnym etapie z uprawianej na pustyni Cistanche deserticola w Tazhong, a ich struktury zostały określone za pomocą NMR i innych technik spektroskopowych. Struktury 39 próbek kontrolnych zidentyfikowano jako Cistanche deserticoside J, Cistanche deserticoside K, Cistanche deserticoside L, Cistanche deserticoside M, Cistanche deserticoside N, epimeridinoside A, Isocistancheside C, angiocyanin B, Cistanche heterophyllin, Isocornicin, Cistanche deserticoside D, Cistanche deserticoside C, Cistanche cymosin, 2'-acetylo Cistanche deserticozyd A, 2' - acetylo Cistanche deserticozyd A, Cistanche deserticola B, Cistanche deserticola A, Echinoside A, Cistanche deserticola glikozyd E, Salidroside, 6'- acetylosadrozyd, salizyd B, syringin, demethyl syringin , jałowiec, (2E, 6E) - 3, 7-dimetylo-8-hydroksyktadien-1-O- - D-glukozyd, ( plus ) - syringin, ( plus ) - syringin-4 '- O- - D-glukopiranozyd, ( plus ) - isoeucomminA, eucomminA, ( plus ) - eter monometylowy kalafonii- - D-glukozyd, larwobójczy-4 ' - O- - D-glukozyd, larwobójczy-4-O- - D-glukozyd- - D-glukopiranozyd, hesperydyna A, obszar A, 6-deoksykatapol. Czystość wszystkich powyższych substancji odniesienia wynosi ponad 98,{37}} procent . Acetonitryl jest czysty chromatograficznie (DikmaPure, USA), woda jest wodą ultraczystą, a inne odczynniki stosowane w procesie testowym to odczynniki o czystości analitycznej, produkowane przez Beijing Chemical Plant.

Materiał leczniczy użyty w tym eksperymencie, Cistanche deserticola, został zebrany z pustynnego obszaru Tazhong w Xinjiangu w listopadzie 2010 roku. Został zidentyfikowany przez profesora Tu Pengfei ze Szkoły Farmacji Uniwersytetu Pekińskiego jako wysuszona mięsista łodyga rośliny Leobaceae Cistanche deserticola. Próbka była przechowywana w Centrum Badań Nowoczesnej Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Uniwersytetu Pekińskiego (numer próbki: CD201011).

Plasterek cistanche deserticola

2.Metody i wyniki

2.1 Przygotowanie roztworu wzorcowego

Weź około 1 mg każdej z 39 próbek kontrolnych uzyskanych z Cistanche deserticola we wczesnym stadium, zważ je dokładnie, umieść odpowiednio w 5 ml kolbie miarowej, rozpuść w metanolu i odmierz objętość do wagi, a następnie pobierz pojedynczą kontrolę rozwiązanie.

2.2 Przygotowanie roztworu testowego

Zgodnie z Farmakopeą Chińską, wydanie 20}15, weź około 1 g proszku produktu (przesiej przez czwarte sito), dokładnie zważ, przelej do brązowej butelki o pojemności 100 ml, dokładnie dodaj 50 ml 60-procentowego metanolu, ubij dobrze wstrząsnąć, zważyć masę, moczyć przez 30 min, poddać działaniu ultradźwięków przez 40 min, schłodzić, ponownie zważyć masę, dodać 50% metanolu do uzyskania zredukowanej masy, dobrze wstrząsnąć, odstawić, pobrać supernatant, i użyj mikroporowatej filtracji membranowej 0,45 μM, weź ciągły przesącz, aby uzyskać roztwór testowy.

2.3 Warunki chromatograficzne

Kolumna chromatograficzna AgilentEclipse XDB-C18 (4,6 mm × 25 0 mm, 5 μm), długość fali detekcji 254 nm, temperatura kolumny 25 stopni; Używając acetonitrylu (A) - 0,1 procent wodnego roztworu kwasu mrówkowego (B) jako fazy ruchomej, elucja gradientowa (0 - 20 min, 5 procent - 15 procent A; 20 - 50 min, 15 procent - 30 procent A; 50 - 60 min, 30 procent - 50 procent A; 60 - 70 min, 50 procent - 95 procent A); Natężenie przepływu: 1,0 ml · min{24}}, objętość wstrzyknięcia: 10 μl.

2.4 Warunki widma masowego

Temperatura kapilarna 35{3}} stopni; Napięcie kapilarne 3500V; Natężenie przepływu gazu płaszczowego (azotu) 12,0 l · min-1; Ciśnienie gazu pomocniczego (azotu) 206,8 kPa; Pełny zakres skanowania spektrometrii mas to m/z 50 ~ 1000; Gaz kolizyjny hel, energia zderzenia jest wybierana automatycznie podczas testu; Zbierz 1 igłę dla każdego trybu jonów dodatnich i ujemnych.

2.5 Badanie substancji odniesienia

39 roztworów wzorcowych przygotowanych zgodnie z 2.1 zbadano w warunkach chromatograficznych 2,3 i spektrometrii mas 2,4 i zarejestrowano ich czas retencji i względną masę cząsteczkową (Tabela 1).

2.6 Oznaczanie roztworu testowego

Wziąć materiał leczniczy Cistanche deserticola pobrany z pustynnego obszaru Tazhong w Xinjiangu i przygotować roztwór badawczy zgodnie z metodą opisaną w ppkt 2.2. Następnie wykonać oznaczenie zgodnie z warunkami chromatografii opisanymi w ppkt 2.3 i warunkami spektrometrii mas opisanymi w 2.4 oraz oznaczyć chromatogram HPLC i spektrometrię mas w trybie jonów dodatnich i ujemnych (rysunki 1-3).

Figa. 1 chromatogram HPLC 60% metanolowego ekstraktu Cistanches Herba

Figa. 2 Pozytywny chromatogram TIC MS 60% metanolowego ekstraktu Cistanches Herba

Figa. 3 Negatywny chromatogram TIC MS 60% metanolowego ekstraktu Cistanches Herba

2.7 Identyfikacja chromatogramu HPLC materiałów leczniczych

W tych samych warunkach (2,3 warunki chromatograficzne i 2,4 warunki spektrometrii mas) składniki zidentyfikowano porównując czas retencji i względną masę cząsteczkową próbki testowej i próbki kontrolnej. Specyficzny proces identyfikacji piku chromatogramu badanej próbki (Rysunek 1) przebiega następująco.

2.7.1 Identyfikacja piku chromatograficznego 1

Czas retencji piku chromatograficznego 1 wynosi 16,67 minuty. W trybie jonów dodatnich pik ekscymeru jonu m/z365 jest podawany jako [M plus Na] plus , natomiast w trybie jonów ujemnych pik ekscymeru jonu m/z387 [M plus COOH] -. Względną masę cząsteczkową piku 1 określono na 342. Podano również fragment jonu m/z179, który pochodzi z utraty 1 cząsteczki glukozy 163 Da w wyniku rozszczepienia wiązania glikozydowego. Zgodnie z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, chromatograficzny pik 1 zidentyfikowano jako iglicę.

2.7.2 Identyfikacja piku chromatograficznego 2

Czas retencji piku chromatograficznego 2 wynosi 17,36 min. W trybie jonów ujemnych podane są piki jonów ekscymerowych m/z357 [M – H] -, 393 [M plus Cl] -, a względna masa cząsteczkowa piku 2 wynosi 358. Jednocześnie jon fragmentaryczny m/z195 pochodzi z utraty 1 cząsteczki glukozy 163 Da w wyniku zerwania wiązania glikozydowego. Pik chromatograficzny 2 zidentyfikowano jako demetylosyringinę na podstawie czasu retencji i względnej masy cząsteczkowej substancji odniesienia.

2.7.3 Identyfikacja piku chromatograficznego 3

Czas retencji piku chromatograficznego 3 wynosi 19,04 min, pik ekscymeru jonu m/z395 [M plus Na] plus podano w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru jonu m/z417 [M plus HCOO] - podano w tryb jonów ujemnych, a względną masę cząsteczkową piku 3 określono na 372. W tym samym czasie jon fragmentacyjny m/z209 pochodzi z utraty 1 cząsteczki glukozy 163 Da w wyniku zerwania wiązania glikozydowego. Pik chromatograficzny 3 zidentyfikowano jako syringinę na podstawie czasu retencji i względnej masy cząsteczkowej substancji odniesienia.

2.7.4 Identyfikacja piku chromatograficznego 4

Czas retencji piku chromatograficznego 4 wynosi 27,66 min. W trybie jonów dodatnich podawany jest pik ekscymeru jonu m/z804 [M plus NH4] plus, aw trybie jonów ujemnych pik ekscymeru m/z785 [M – H]. Względną masę cząsteczkową piku 4 określono na 786. W tym samym czasie jon fragmentacyjny m/z623 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da. W połączeniu z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 4 zidentyfikowano jako echinacea.

2.7.5 Identyfikacja piku chromatograficznego 5

Czas retencji piku chromatograficznego 5 wynosi 31,48 min, pik ekscymeru jonu m/z818 [M plus NH4] plus podano w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru jonu m/z799 [M – H] - podano w tryb jonów ujemnych, a względną masę cząsteczkową piku 5 określono na 800. Jednocześnie jon fragmentacyjny m/z637 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163Da. Łącząc czas retencji i względną masę cząsteczkową substancji odniesienia, potwierdzono, że chromatograficzny pik 5 był cistanche glikozydem A.

Tabela 1 Masa cząsteczkowa i czas retencji( tＲ ) z 39 standardowych związków

2.7.6 Identyfikacja piku chromatograficznego 6

Czas retencji piku chromatograficznego 6 wynosi 34,17 min. Dwa piki ekscymerowe jonów m/z846642 [M plus NH4] plus są podane w trybie jonów dodatnich, a dwa piki ekscymerów jonów m/z827623 [M – H] - są również podane w trybie jonów ujemnych. Spekuluje się, że pik 6 może zawierać dwa związki o względnej masie cząsteczkowej 828624. Jednocześnie jon fragmentaryczny m/z665461 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da, a jon fragmentacyjny m /z622 pochodzi z rozerwania wiązania estru acetylowego. Te dwa związki wyizolowano i połączono z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, chromatograficzny pik 6 był mieszaniną cimicifugaryny i antocyjaniny A.

2.7.7 Identyfikacja piku chromatograficznego 7

Czas retencji piku chromatograficznego 7 wynosi 35,34 min. Pik ekscymerowy jonu m/z832 [M plus NH4] plus , 837 [M plus Na] plus jest podawany w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru m/z813 [M – H] - jest podawany w trybie jonów ujemnych , a względna masa cząsteczkowa piku 7 wynosi 814. W tym samym czasie fragment jonu m/z637 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kwasu ferulowego 177Da. W połączeniu z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 7 zidentyfikowano jako glikozyd cistanche B.

2.7.8 Identyfikacja piku chromatograficznego 8

Czas retencji piku chromatograficznego 8 wynosi 36,17 min, pik ekscymeru jonu m/z647 [M plus Na] plus podano w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru jonu m/z623 [M – H] - podano w tryb jonów ujemnych, a względną masę cząsteczkową piku 8 określa się na 624. Jednocześnie podaje się jon fragmentacyjny m/z461, który pochodzi z rozerwania wiązania estrowego i utraty 1 cząsteczki grupy kofeiny 163 Da. W połączeniu z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 8 zidentyfikowano jako heterocenozyd.

2.7.9 Identyfikacja piku chromatograficznego 9

Czas retencji piku chromatograficznego 9 wynosi 38,20 minut. Piki jonów ekscymerowych m/z860 [M plus NH4] plus , 865 [M plus Na] plus podano w trybie jonów dodatnich, a piki ekscymeru m/z841 [M – H ] -, 877 [M plus Cl] - podane są w trybie jonów ujemnych. Względną masę cząsteczkową piku 9 określono na 842. W tym samym czasie fragment jonu m/z679636 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da i 1 cząsteczki acetylu 43 Da. Czas retencji i względna masa cząsteczkowa substancji odniesienia są zgodne, a pik identyfikacyjny 9 to 2'-acetylocystanche glikozyd A.

2.7.10 Identyfikacja nasyceniatograficzny strtak 10

Czas retencji piku chromatograficznego 10 wynosi 39,04 min. Pik ekscymerowy jonu m/z656 [M plus NH4] plus , 661 [M plus Na] plus jest podany w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru jonu m/z637 [M – H] -, 673 [M plus Cl] - jest podawany w trybie jonów ujemnych. Względną masę cząsteczkową piku 10 określono na 638. W tym samym czasie jon fragmentacyjny m/z475 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da. Czas retencji i względna masa cząsteczkowa substancji odniesienia są zgodne, a pikiem identyfikacyjnym 10 jest Cistanche C.

2.7.11 Identyfikacja piku chromatograficznego 11

Czas retencji piku chromatograficznego 11 wynosi 40,82 min. Pik ekscymerowy jonu m/z661 [M plus Na] plus , 677 [M plus K] plus podany jest w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru m/z637 [M – H] -, 673 [M plus Cl] - jest podawany w trybie jonów ujemnych. Można określić, że względna masa cząsteczkowa piku 11 wynosi 638. Jednocześnie jon fragmentaryczny m/z475 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da. Łącząc czas retencji i względną masę cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 11 zidentyfikowano jako izocystanche glikozyd C.

2.7.12 Identyfikacja piku chromatograficznego 12

Czas retencji piku chromatograficznego 12 wynosi 41,48 min. Pik ekscymerowy jonu m/z684 [M plus NH4] plus , 689 [M plus Na] plus jest podany w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru m/z665 [M – H] - w trybie jonów ujemnych . Można stwierdzić, że względna masa cząsteczkowa piku 12 wynosi 666. Jednocześnie wykazano, że jon fragmentacyjny m/z503460 pochodzi z rozpadu wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da i 1 cząsteczki acetylu 43 Da. Zgodnie z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 12 zidentyfikowano jako 2'-acetyloceliaozyd.

Eksperyment Cistanche deserticola

2.7.13 Identyfikacja piku chromatograficznego 13

Czas retencji piku chromatograficznego 13 wynosi 44,29 min, pik ekscymeru jonu m/z689 [M plus Na] plus podano w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru jonu m/z665 [M – H] - podano w tryb jonów ujemnych, a względna masa cząsteczkowa piku 13 wynosi 666. Jednocześnie wykazano, że jon fragmentacyjny m/z503460 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da i 1 cząsteczki acetylu 43 Da. W połączeniu z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 13 zidentyfikowano jako antocyjaninę B.

2.7.14 Identyfikacja piku chromatograficznego 14

Czas retencji piku chromatograficznego 14 wynosi 46,67 min. W trybie jonów dodatnich podawany jest pik ekscymeru jonu m/z675 [M plus Na] plus, aw trybie jonów ujemnych pik ekscymeru m/z651 [M – H]. Względna masa cząsteczkowa piku 14 wynosi 652. Jednocześnie fragment jonu m/z475 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki grupy kwasu ferulowego 177Da. W połączeniu z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 14 zidentyfikowano jako epimerydynozyd A.

2.7.15 Identyfikacja piku chromatograficznego 15

Czas retencji piku chromatograficznego 15 wynosi 49,90 min. Pik ekscymerowy jonu m/z698 [M plus NH4] plus , 703 [M plus Na] plus jest podany w trybie jonów dodatnich, a pik ekscymeru m/z679 [M – H] -, 715 [M plus Cl] - jest podawany w trybie jonów ujemnych. Względna masa cząsteczkowa piku 15 wynosi 680. Jednocześnie fragment jonu m/z517474 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kofeiny 163 Da i 1 cząsteczki acetylu 43 Da. Pik chromatograficzny 15 zidentyfikowano jako glikozyd cistanche K w oparciu o czas retencji i względną masę cząsteczkową substancji odniesienia.

2.7.16 Identyfikacja piku chromatograficznego 16

Czas retencji piku chromatograficznego 16 wynosi 55,36 minut. W trybie jonów dodatnich podawany jest pik ekscymeru m/z717 [M plus Na] plus, natomiast w trybie jonów ujemnych piki ekscymeru m/z693 [M – H] -, 729 [M plus Cl] - podano, co daje względną masę cząsteczkową 694 dla piku 16. Jednocześnie wykazano, że jon fragmentacyjny m/z517474 pochodzi z utraty wiązania estrowego 1 cząsteczki kwasu ferulowego z grupy 177 Da i 1 cząsteczki kwasu ferulowego z grupy 177 Da grupa acetylowa 43Da. W połączeniu z czasem retencji i względną masą cząsteczkową substancji odniesienia, pik chromatograficzny 16 zidentyfikowano jako glikozyd cistanche J. Piki chromatograficzne 60-procentowego metanolowego ekstraktu Cistanche deserticola zidentyfikowano za pomocą HPLC-MS w połączeniu z względną masą cząsteczkową, retencją czas i jon fragmentacji oddzielonej substancji odniesienia. Wyniki pokazały, że dokładnie zidentyfikowano 17 składników z 16 pików chromatograficznych (Tabela 2).

Tabela 2 Zidentyfikowane piki chromatograficzne Cistanches Herba i wzorcowych związków odniesienia

3 .Dyskusja

3.1 Wybór metody przygotowania badanego wyrobu

Głównym celem tego badania jest identyfikacja pików HPLC Cistanche deserticola. Dlatego wybór rozpuszczalnika ekstrakcyjnego i metody ekstrakcji opiera się na możliwości uzyskania większej liczby pików HPLC. Zespół badawczy przeprowadził długoterminowe badania nad Cistanche deserticola i wykonał wiele pracy w zakresie analizy jakości. W niniejszej pracy wybrano również rozpuszczalnik do ekstrakcji i metodę ekstrakcji Cistanche deserticola na podstawie wcześniejszych prac analitycznych grupy badawczej oraz Farmakopei Chińskiej (wydanie z 2015 r.). Ostatecznie jako metodę ekstrakcji wybrano ekstrakcję ultradźwiękową 60-procentowym rozpuszczalnikiem metanolu przez 40 minut.

3.2 Wybór warunków HPLC-MS

Wybór kolumny chromatograficznej w niniejszej pracy opiera się na analizie jakości Cistanche deserticola we wczesnej fazie grupy badawczej oraz badaniu AgilentZORBAXEclipsePlusC18 (4,6mm × 250mm,5 μm), DionexC18(4,6mm × 250mm,5 μ m), ThermoC18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μ m) Kolumna chromatograficzna, ostatecznie wybierz kolumnę chromatograficzną AgilentZORBAXEclipsePlusC18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μ m) Ma dobry efekt separacji na Cistanche deserticola; 39 substancji referencyjnych obejmuje fenyloetanoid, lignany i fenylopropanoid, więc długość fali wykrywania wynosi 254 nm; Jednocześnie wpływ faz ruchomych, takich jak metanol-woda, acetonitryl-woda, metanol -0,1% woda z kwasem fosforowym, acetonitryl{26}},1% woda z kwasem mrówkowym, na rozdzielanie chromatograficzne i masę zbadano detekcję spektrometryczną i ostatecznie jako fazę ruchomą wybrano acetonitryl -0,1% wodę z kwasem mrówkowym.

3.3 Podsumowanie

Metoda ustalona w tym badaniu dokładnie zidentyfikowała 17 składników z 16 pików chromatograficznych 60-procentowego metanoluwyciągzCistanche deserticola. 

Ekstrakt Cistanche w proszku

Wyniki badań nie tylko mają pewną wartość referencyjną dla dalszej analizy jakości materiału leczniczego, ale także pozwalają uniknąć pewnych powtarzalnych prac nad identyfikacją struktury znanych związków materiału leczniczego. Jednak na ogół istnieje stosunkowo niewiele zidentyfikowanych pików chromatograficznych, a wiele pików chromatograficznych nie zostało zidentyfikowanych, ponieważ nie zostały one przypisane do substancji odniesienia. Większość zidentyfikowanych składników to glikozydy fenyloetanoidowe, natomiast lignany występują rzadko. Może to wynikać z faktu, że metoda ekstrakcji, o której mowa w Farmakopei Chińskiej z 2015 r., jest ukierunkowana głównie na glikozydy fenyloetanoidowe lub zbyt wysoka zawartość echinakozydu i związków podobnych do bakterii z grupy coli w ekstrakcie tego surowca leczniczego, co utrudnia do wykrywania innych związków o niewielkiej zawartości. Konkretne przyczyny wymagają dalszego wyjaśnienia.

[Bibliografia]

[1] Komitet Redakcyjny Flory Chin. Flora Chin [M]. Pekin: Science Press, 1990: 86

[2] Yang Junshan. Żeń-szeń pustynny -- Cistanche deserticola [J]. Chinese Journal of Pharmacy, 2011, 46( 12): 881．

[3] Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai i in. Badania nad Cistanche deserticola i jej rozwojem przemysłowym [J]. Chinese Journal of Pharmacy, 2011, 46 (12): 882-887

[4]Krajowa Komisja Farmakopei. Farmakopea Chińskiej Republiki Ludowej. Część I [M]Pekin: China Pharmaceutical Science and Technology Press, 2015: 135

[5] JIANG Y, TU PF． Analiza składników chemicznych w gatunkach Cistanche ［J］． J Chromatogr A,2009,1216 (11): 1970-1979．

[6] PAN J, YUAN CS, LIN CJ i in. Aktywność farmakologiczna i mechanizmy naturalnych glikozydów fenylopropanoidowych［J］． Pharmazie,2003,58(11): 767-775．

[7] FU GM,PANG HH,Wong Y． Naturalnie występujące glikozydy fenyloetanoidowe: potencjalne tropy dla nowych leków［J］． Curr Med Chem, 2008, 15 ( 25 ) : 2592-2613．

[8] Rhode Mei, Long Mei, Du Wenjing i in. Mechanizm działania antyosteoporozy ekstraktu Cistanche deserticola na myszy M KOOPG ［ J ］. Chiński eksperyment Journal of Prescriptions, 2016, 22 (10): 138-142

[9] Ma Hui, Yin Ruoxi, Guo Min i in. Wpływ polisacharydu Cistanche deserticola na starzenie wywołane D-galaktozą Wpływ ekspresji CREB w starym modelu myszy ［ J ］. Chinese Experimental Prescriptions Journal, 2014, 20 (20): 137-141

[10] Tao Yicun, Li Jianying, Xu Yonghua i in. Wpływ fenyloetanozydu Cistanche deserticola na szczury Zapobieganie i leczenie obrzęku płuc na dużych wysokościach ［ J ］. Chinese Journal of Experimental Rescriptions, 2014, 20( 15): 134-138．

[11] Zhou Haitao, Cao Jianmin, Lin Qiang. Cistanche deserticola na wyczerpaną zdolność pływania szczurów i mitochondrialną zdolność antyoksydacyjną mięśnia sercowego ［ J ］. Chińska formuła eksperymentalna Journal of Science, 2012, 18 (6): 229-233

[12] NAN ZD, ZHAO MB, ZENG KW i in. Irydoidy przeciwzapalne z łodyg Cistanche deserticola hodowanych na pustyni Tarim［J］． Chin J Nat Med,2016,14(1) : 61-65．

[13] NAN ZD, ZENG KW, SHI SP i in. Glikozydy fenyloetanoidowe o działaniu przeciwzapalnym z łodyg Cistanche deserticola hodowanych na pustyni Tarim ［J］． Fitoterapia,2013,89: 167-174．

[14] Nan Zedong, Zhao Mingbo, Jiang Yong i in. Chemia pustynnych cistanche uprawianych w badaniu składu Tazhong ［ J ］. Chinese Journal of Tradycyjna Medycyna Chińska, 2013, 38 (16): 2665-2670．

[15] Nan Zedong, Zhao Mingbo, Jiang Yong i in. Lignans [J]. Chinese Journal of Tradycyjna Medycyna Chińska, 2015, 40 (3): 463-468．