Immunostymulujące koniugaty przeciwciał wywołują silną aktywację szpiku i trwałą odporność przeciwnowotworową (część 2)

Aby dowiedzieć się więcej informacji plz kontaktdavid.wan@wecistanche.com

Dyskusja:

Przedstawione tutaj wyniki dostarczają przekonujących dowodów wspierających ISAC jako nową technologię immunoterapii nowotworów. Modelowanie in vitro ISAC wykazało ich zdolność do aktywacji pierwotnych ludzkich szpikowych APC w sposób zależny od Fc R i TLR oraz do wzmocnienia prezentacji krzyżowej antygenów przy użyciu mysiego systemu modelowego OVA. Aktywację poprzez zwiększenie ekspresji cząsteczki kostymulującej CD40 zaobserwowano nie tylko in vitro, ale również zaobserwowano ją na szpikowych APC rezydujących w guzie zarówno w modelach heteroprzeszczepu, jak i syngenicznych guzów. Jednym z uderzających odkryć tego badania było to, że kowalencyjne przyłączenie agonisty TLR do Ukierunkowane na nowotwór przeciwciało monoklonalne w postaci ISAC zmieniło efekt immunostymulacyjny i ogólną skuteczność, która jest typowo oczekiwana w przypadku agonistów TLR. Porównanie miejscowego dostarczania trastuzumabu w połączeniu z T785 z ogólnoustrojowym dostarczaniem T785-ISAC wykazało, że tylko ISAC był skuteczny w zmniejszaniu masy guza. Miejscowe dostarczanie mieszaniny nie przyniosło korzyści w modelu heteroprzeszczepu guza HCC1954, przy porównywalnych efektach do samego trastuzumabu. To odkrycie potwierdza, że ​​nie tylko dostarczanie miejscowe, ale także jednoczesne dostarczanie przeciwciała i agonisty TLR ma zasadnicze znaczenie dla skuteczności terapeutycznej obserwowanej z ISAC. Dane mechanistyczne wygenerowane w modelu heteroprzeszczepu guza HCC1954 wykazały wymóg in vivo zaangażowania Fc R i zaangażowania TLR dla skuteczności, ponieważ zarówno TLRnull-ISAC, jak i ISAC nieaktywny Fc nie kontrolowały wzrostu guza. Ponadto, ogólnoustrojowe podawanie ISAC skutkowało trwałą skutecznością przeciwnowotworową w szczurzych modelach HER2 plus syngeniczny nowotwór i ludzkich heteroprzeszczepach HER2 plus raka piersi, które były oporne na leczenie nieskoniugowanym przeciwciałem. HER2 został wybrany jako docelowy antygen do badań przedklinicznych in vivo, ponieważ terapia neoadiuwantowa, adiuwantowa i pierwszego rzutu u pacjentów z miejscowo zaawansowanym lub przerzutowym rakiem piersi jest zdominowana przez przeciwciała skierowane przeciwko HER2-, które nie są zaprojektowane do stymulowania układu odpornościowego i zatwierdzone przeciwciała blokujące inhibitor punktów kontrolnych komórek T były minimalnie skuteczne u tych pacjentów. Pacjenci ci mogliby skorzystać z ISAC, które zachowują funkcjonalność przeciwciał macierzystych i dodają znaczny potencjał immunostymulujący. Podobnie jak w przypadku każdego immunoterapeutyku, istnieje możliwość wytworzenia lub zaostrzenia przeciwciał przeciwlekowych i, w przypadku ISAC, może ostatecznie zależeć od immunogenności przeciwciała macierzystego. Oceny te najlepiej przeprowadzać klinicznie, a trastuzumab może idealnie nadawać się do badań, ponieważ zgłoszony wskaźnik immunogenności Herceptin™ u pacjentów wynosi mniej niż 1 procent. Dane in vivo wykazujące wymóg jednoczesnego dostarczania przeciwciała i adiuwanta są dodatkowo poparte pracami wyszczególniającymi wewnątrzkomórkową sygnalizację rządzącą aktywnością ISAC poprzez jednoczesne sygnalizowanie FcR i TLR. Podczas gdy dodatkowe badania mogą dalej wyjaśnić dynamikę wewnątrzkomórkowej sygnalizacji ISAC, opisane tutaj badania podkreślają potencjalne korzyści sygnalizacyjne sprzęgania agonisty TLR z przeciwciałem, co zwykle obserwuje się, gdy przeciwciała angażują patogeny podczas odporności ochronnej. Analiza sygnalizacji wewnątrzkomórkowej oparta na CyTOF w ludzkie PBMC zostały wykorzystane do dalszegozrozumieć i rozróżnić aktywność mieszaniny i ISAC. Wyniki ujawniły wzmocnioną sygnaturę po stymulacji ISAC w porównaniu z sygnaturą wywołaną przez mieszaninę poszczególnych składników, co dodatkowo potwierdza potencjał wzmocnienia aktywności poprzez chemiczne sprzęganie przeciwciała i agonisty TLR. Chociaż specyficznej siły działania ISAC dla TLR7 i TLR8- nie można zmierzyć przy użyciu komórek reporterowych HEK293, demonstracjaindukowanej przez ISAC fosforylacji IRF-7 sugeruje aktywny agonizm TLR7/8, ponieważ wiadomo, że IRF-7 przebiega za sygnałem TLR7 i TLR8 MyD88-30. Dane wskazują, że ISAC nie tylko wywołuje zwiększoną sygnalizację szlaków kanonicznych związanych ze szlakami TLR i Fc R, ale także zmniejsza próg aktywacji parami wymagany do wywołania fosforylacji dalszych białek sygnałowych, takich jak rybosomalne białko S6, kluczowy regulator translacji białek w komórce. Wysokie wyniki DREMI, szczególnie mierzonew monocytach, jak również w DC, wspierają silną warunkową zależność indukowaną przez stymulację ISAC, której nie widać w mieszaninie. Zjawisko to możebyć ułatwione przez wewnątrzkomórkowe zmiany w obfitości, lokalizacji i/lub rekrutacji receptorów w endosomie, ale wymagane są dalsze badania w celu potwierdzenia dokładnego mechanizmu. Co ważne, analiza DREMI zidentyfikowała relacje zgodne ze znanymi partnerami sygnalizacyjnymi w wyniku stymulacji ISAC. Przez jego znane hamowanierola w kanonicznej sygnalizacji NF-κB 49, zaobserwowaliśmy zmniejszoną zależność (tj. wynik DREMI)między pIRF7 a inhibitorem kappa B (IκB), gdy komórki szpiku stymulowano ISAC. Podsumowując, wyniki te wspierają wzmocnioną i podtrzymywaną odpowiedź wewnątrzkomórkową poprzez odpowiednie cząsteczki szlaku transdukcji sygnału w dół od stymulacji ISAC, oprócz synergii między szlakami sygnałowymi związanymi z TLR i Fc R.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej o Cistanche

Nasze wyniki ujawniły, że funkcjonalne interakcje Fc-Fc R są niezbędne do aktywacji szpikowych APC za pośrednictwem ISAC. Natywny Fc IgG1, który ma najwyższe powinowactwo do aktywujących Fc R z naturalnie istniejących izotypów IgG, był lepszy od innych izotypów IgG z niższym powinowactwem do aktywujących Fc R. Dalsze wzmocnienie oddziaływania Fc-Fc R poprzez zwiększenie siły działania fukozylacji, podczas gdy zmniejszenie oddziaływania Fc-Fc R poprzez zmniejszenie siły działania glikozylacji. Zgodnie z oczekiwaniami, aby ISAC wywołały maksymalną stymulację, wymagana była sygnalizacja Syk poniżej zaangażowania Fc R w połączeniu z późniejszym agonizmem TLR. Odkrycia te są poparte badaniami wykazującymi dramatyczne wzmocnienie stymulacji szpiku po kostymulacji za pomocą IgG związanego z płytką i agonisty TLR PAM3CSK 50. Sugerują również, że bardziej rozległe sieciowanie Fc na powierzchni komórki docelowej lub w warunkach płytki in vitro , lub zaangażowane są sieci sygnalizacji różnicowej po stymulacji ISAC, w przeciwieństwie do mieszaniny składników. Translację platformy ISAC in vivo po raz pierwszy oceniono na ludzkich liniach komórek nowotworowych HER2 plus u myszy pozbawionych w pełni funkcjonalnych komórek B, T i NK. Co ciekawe, trastuzumab ISAC był znacznie skuteczniejszy niż trastuzumab w wielu guzach o różnym poziomie ekspresji HER2. Ponadto dane wykazały zależność działania przeciwnowotworowego ISAC od ukierunkowania na nowotwór, ponieważ izotyp-ISAC nie był w stanie wywoływać regresji i usuwania nowotworu. Chociaż modelowanie in vitro wykazało konieczność aktywności TLR i Fc R w celu umożliwienia działania ISAC, takie modele nie były skuteczne w mierzeniu zależności od ukierunkowania na antygen ISAC. Nie zmierzono różnic między docelowymi i izotypowymi T785-ISAC w testach płytkowych ze zdrowymi ludzkimi szpikowymi APC hodowanymi wspólniez komórkami nowotworowymi (dane niepokazane).Brak zależności od celu mierzonego in vitro można przypisać wielu czynnikom: stwierdzono, że szpikowe APC podwyższają poziom Fc R na powierzchni komórki po hodowli in vitro, co może zwiększać zdolność rozpuszczalnej IgG do wiązania się z Fc R, prowadząc do wzmocniony sygnał z izotypu ISAC.Dodatkowo kulturasystem nie ma endogennych IgG i dodatkowych czynników surowicy obecnych in vivo, które mogą konkurować o Fc R in vivo i tłumić efekty obserwowane w przypadku izotypu ISAC.Niemniej jednak modele in vivo wykazały zależność ISAC od ukierunkowania na nowotwory pod kątem skuteczności przeciwnowotworowej.Izotypowe ISAC nie tylko wykazały niewielki wpływ na wzrost guza w badaniach skuteczności, ale stwierdzono również, że nie mają żadnego wpływu na poziom genetyczny w guzach, co wykazano w modelach heteroprzeszczepów i syngenicznych guzów.Oprócz wykazania skuteczności zależnej od celu in vivo, T785-ISAC był tolerowany przez zwierzęta i wywoływał minimalną utratę masy ciała, wykazując u myszy niewielkie oznaki efektów odbiegających od celu i zdarzeń niepożądanych.Dane te dodatkowo potwierdzają zdolność dostarczanego systemowo ISAC ukierunkowanego na nowotwór do przemieszczania się do nowotworu i indukowania zlokalizowanej prozapalnej odpowiedzi przeciwnowotworowej.

Znaczenie funkcji efektorowych, w których pośredniczą komórki szpiku, wykazano w badaniach zubożania komórek, w których zubożenie fagocytów przez klodroniany znosiło zdolność ISAC do indukowania usuwania guza.Co ciekawe, chociaż guzy początkowo uległy regresji po wyczerpaniu komórek Gr1-dodatnich, guzy później wyrosły.Zjawisko to mogło wystąpić w wyniku wyczerpania prekursorów fagocytów, takich jak monocyty, które mogły później różnicować się w funkcjonalne i dojrzałe komórki fagocytarne 51.Dalsze wglądy molekularne i komórkowe uzyskano na podstawie ilościowego określenia poziomów mRNA i zmian po leczeniu ISAC.Dane te zostały dodatkowo potwierdzone przez immunohistochemię, a także ocenę ilościową białka, wskazując na infiltrację komórek szpiku do guza wzdłużz produkcją prozapalnej cytokiny TNF i chemoatraktantów szpiku CCL2 (MCP-1) i CCL4 (Mip1b).

Rycina 2: ISACS wywołuje różne wzorce sygnalizacji w szpikowych APC. (ad) Świeżo wyizolowane ludzkie PBMC stymulowano 1 μM rituximabu-ISAC lub równomolowego odpowiednika mieszaniny w obecności komórek nowotworowych CD20 plus Toledo w stosunku 1:1 stosunek przez 15 minut. (a) Medianę współczynnika arcsinh dla ISAC nad sygnalizacją zmierzono po stymulacji mieszaniną dla różnych fosfoprotein, jak przedstawiono na mapie cieplnej, z żółtym wskaźnikiem zwiększonej sygnalizacji i niebieskim wskaźnikiem zmniejszonego sygnału. (b) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej dla pIRF7 i pRPS6 w monocytach i cDC. (c) Wielokrotna zmiana indukowanej sygnalizacji została obliczona jako stosunek arcsinh do niestymulowanej kontroli. Fosforylację IRF7 i ERK1/2 mierzono w monocytach i cDC po stymulacji ISAC lub mieszaniną. Dane pochodzą z jednego eksperymentu z sześcioma dawcami (średnia i SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

Receptory dla CCL2 i CCL4, CCR2 i CCR5 ulegają ekspresji odpowiednio na monocytach i makrofagach, co sugeruje, że te typy komórek mogą być rekrutowane do nowotworów leczonych ISAC.Ponadto, mRNA Cxcl9 i Cxcl11, które kodują chemokiny specyficzne dla komórek T i ulegają ekspresji przez DC w TME, były również regulowane w górę przez leczenie trastuzumabem ISAC (rysunek uzupełniający 23) 52,53.Trastuzumab ISAC o zwiększonej sile działania, wykorzystujący agonistę CL264, wykazywał zwiększoną skuteczność w modelach guzów z mniejszą ekspresją HER2.Jest to ważne, biorąc pod uwagę, że pacjenci, których guzy wykazują niską ekspresję HER2 mają bardziej ograniczone możliwości leczenia i nie kwalifikują się do leczenia trastuzumabem lub innymi terapiami zawierającymi trastuzumab.U zwierząt leczonych zarówno docelowymi, jak i izotypowymi CL264-ISAC, zaobserwowano przejściową utratę masy ciała wynoszącą około 5-10 procent i zwiększone ogólnoustrojowe wydzielanie TNF, co wskazuje na możliwe działania poza docelowymi oprócz silnego zaobserwowano aktywność guza.Zbiorcze dane przedstawione w modelach heteroprzeszczepów sugerują, że fagocytoza za pośrednictwem ISAC jest skutecznym mechanizmem eliminacji guzów, ale mechanizm ten może zostać wzmocniony po prezentacji antygenu neoantygenów guza limfocytom T u immunokompetentnych gospodarzy.W tym celu zbadano zdolność ISAC do promowania odporności przeciwnowotworowej u myszy typu dzikiego za pomocą ISAC anty-rHER2 w dwóch różnychrHER2-wyrażając modele syngeniczne (MMC i CT26-rHER2). Zarówno T785, jak i CL264 zawierające ISAC zostały ocenione w syngenicznym modelu MMC, biorąc pod uwagę wysoką ekspresję antygenu rHER2, ponieważ postulowano, że zarówno ISAC o niższej, jak i wyższej mocy są skuteczne przy wysokiej gęstości antygenu na komórce nowotworowej. Oba rHER2 ISAC doprowadziły do ​​całkowitego usunięcia guza u zwierząt z dużymi guzami (350-950 mm3) w modelu MMC, podczas gdy nieskoniugowane przeciwciało nie kontrolowało wzrostu guza. Analiza poziomów transkryptu mRNA w modelu MMC wykazała dramatyczną zmianę w regulacjiwiele genów w 24 godziny po leczeniu docelowym rHER2 T785-ISAC w stosunku do przeciwciała rHER2 lub izotypu ISAC, w tym w obrębie genów zaangażowanych w biologię komórek szpikowych, biologię TLR i adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne. Zwiększone nacieki komórek eksprymujących CD11c i F4/80- zaobserwowano w immunohistochemii, podobnie do trendu obserwowanego w modelu heteroprzeszczepu guza HCC1954. Ponadto infiltrację komórek T CD8 zaobserwowano przezimmunohistochemia, wspierająca generowanie adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej po leczeniu ISAC.

Oprócz wykazanego znaczenia fagocytów w modelu heteroprzeszczepu, badania deplecji w syngenicznym modelu guza MMC ujawniły silną zależność od fagocytów, ponieważ deplecja przy użyciu liposomów obciążonych klodronianem zatrzymała działanie przeciwnowotworowe zależne od ISAC. Co więcej, badania syngeniczne wykazały kluczową rolę limfocytów T w skuteczności ISAC. Usuwanie guza wywołane przez ISAC było silnie zależne od aktywności limfocytów T CD8, ponieważ zmniejszenie liczby limfocytów T CD8 hamowało skuteczność przeciwnowotworową. Dane sugerują, że aktywność komórek T jest kierowana przez aktywację komórek szpikowych stymulowanych przez ISAC za pośrednictwem TLR. Takie wymaganie dla komórek T, prawdopodobnie związane z prezentacją antygenów związanych z nowotworem przez stymulowane ISAC komórki szpiku, potwierdza, że ​​ISAC prawdopodobnie pośredniczą w ich aktywności przeciwnowotworowej poprzez co najmniej dwa mechanizmy: fagocytozę i prezentację antygenu. Podczas gdy fagocyty zapewniają wczesną odpowiedź przeciwnowotworową po leczeniu ISAC, priming antygenem limfocytów T ostatecznie zapewnia usunięcie guza i trwałe efekty mierzone w modelach w pełni immunokompetentnych. Ta kombinacja byłaby wysoce pożądana dla pacjentów z rakiem, ponieważ leczenie ISAC mogłoby prowadzić do silnej i trwałej odporności przeciwnowotworowej. Aby dalej badać znaczenie aktywacji limfocytów T za pośrednictwem ISAC, myszy wyleczone z guzów CT 26- rHER2 po rHER2 CL 264-Leczenie ISAC wznowiono, po 30 dniach braku guza, z macierzystą linią komórkową CT26 nie eksprymującą rHER2. Zwierzęta wyleczone rHER2-CT26 były chronione przed prowokacją CT26, podczas gdy zwierzęta bez nowotworu nie były w stanie odrzucić wzrostu nowotworu. Dodatkowo, aby wykazać, że ochrona była specyficzna dla linii komórek nowotworowych CT26, 4T1 wszczepiono jednocześnie w przeciwległy bok myszy rodzicielskiej prowokowanej CT26. Chociaż guzy CT26 nie rosły u myszy wyleczonych her-CT26, wzrost guza 4T1 był nieobciążony, a zatem dostarcza dowodów, że odporność jest swoista dla antygenu i zależna od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Ponadto, badania te sugerują, że ISAC ukierunkowane na nowotwór pośredniczą w pamięci immunologicznej nie tylko na początkowo docelowy antygen nowotworowy, ale także na antygeny nieukierunkowane. Dane te sugerują również, że komórki szpiku mogą prezentować antygeny związane z nowotworem, które napędzają dodatkowe odpowiedzi CTL. Implikacje tych odkryć pokazują, że nawet jeśli docelowy antygen nowotworowy jest następnie regulowany w dół lub niezdolny do wiązania się z ISAC, pamięć immunologiczna została już wywołana i jest w stanie podtrzymać trwałą odpowiedź. Ta odpowiedź nie jestograniczone do antygenu będącego celem ISAC, ale także do dodatkowych, niezidentyfikowanych antygenów wykazujących ekspresję guza.Podsumowując, dane te wskazują, że ISAC wywołują jakościowo i ilościowo odmienną biologię związaną z aktywacją komórkową i prezentacją antygenu, proliferacją limfocytów T i trwałą odpornością przeciwnowotworową.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75% w oparciu o odzyskane białko. Analiza SEC wykryła minimalną obecność agregatów, a DAR określono za pomocą analizy LC/MS. Oczyszczone ISAC przefiltrowano przez sterylny filtr 0 0,2 μm i przechowywano w temperaturze -20 stopni do czasu użycia. Test reporterowy HEK HEK293 komórki reporterowe wyrażające ludzki TLR7 lub ludzki TLR8 zakupiono od Invivogen (hub-htlr7 lub hub-htlr8) i protokoły dostawcy były przestrzegane w przypadku propagacji i eksperymentów komórkowych. W skrócie, komórki hodowano do 80-85% konfluencji przy 5% CO2 w DMEM uzupełnionej 10% FBS, Zeocin i Blasticidin. Następnie komórki wysiano w 96-dołkowych płaskich płytkach w ilości 4x104 komórek/dołek z substratem zawierającym pożywkę do wykrywania HEK i cząsteczki immunostymulujące. Aktywność mierzono za pomocą czytnika płytek przy długości fali 620-655 nm. Analiza Biacore Znakowane Histami białka receptora gamma Fc (FCGR) otrzymano z R&D Systems (FCGR1 (CD64, nr kat. 1257-FC{{23}) }), FCGR2A (CD32a, nr kat. 1257-FC-050), FCGR2B (CD32b, nr kat. 1875-FC-050), FCGR3A (CD16a, nr kat. {{34) }}FC-050).Analiza wiązania została przeprowadzona na aparacie Biacore T200 w buforze HBS-EP plus (GE BR100669) przy użyciu chipa CM5 (GE BR100530) zawierającego unieruchomione przeciwciało anty-HIS (zestaw HIS Capture, GE 28995056 W przypadku rytuksymabu lub rytuksymabu-ISAC wstrzyknięto komórki przepływowe zawierające wyłącznie wychwycone FCGR lub przeciwciało anty-His na powierzchni odniesienia.powierzchnia anty-His i zastrzyk zawierający tylko bufor. Zastosowano metodę miareczkowania kinetycznego i powierzchnie regenerowano między cyklami przez wstrzyknięcie 10 mM glicyny, pH 1,5. Dane zostały dopasowane przy użyciu oprogramowania do oceny Biacore T200 (V3.1) przy użyciu dopasowania kinetycznego (1:1) dla FCGR1 i FCGR3A (średnia z 6 przebiegów) i powinowactwa w stanie stacjonarnym (1:1) dla FCGR2A i FCGR2B (średnia z 3 przebiegów ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90%, co określono metodą cytometrii przepływowej na podstawie ekspresji CD14, CD16, CD11c i HLA-DR. Przygotowanie komórek nowotworowych Toledo Komórki Toledo (ATCC) hodowano w pożywkach zalecanych przez dostawcę i utrzymywano w zalecanych przez dostawcę gęstościach komórek (ATCC). Komórki usunięto z hodowli, przemyto i ponownie zawieszono w PBS z 2% FBS i 2 mM EDTA przy 1-10x106 komórek/ml. W niektórych przypadkach komórki znakowano następnie 2 μM CFSE przez 2 minuty, a następnie przemywano raz RPMI-1640 (Lonza) uzupełnionym 10% FBS (Atlanta Biologicals) i 100 U/ml Pen/Strep (Lonza). Następnie komórki utrwalono w 2% paraformaldehydzie i przemyto trzykrotnie PBS przed dalszym użyciem. Testy aktywacji komórkowejPBMC lub wyizolowane monocyty wysiano w ilości odpowiednio 3x105 lub 2x105 komórek na dołek, w płaskodennych płytkach 96-dołkowych w IMDM uzupełniony 10 procentami FBS (Atlanta Biologicals), 1 mM pirogronianem sodu (Lonza), 100 μM aminokwasami endogennymi (Lonza) i 100 U/mL Pen/Strep (Lonza). Do eksperymentów z hodowlą monocytów i guza, monocyty hodowano z utrwalonymi allogenicznymi komórkami guza w stosunku 3 do 1. Komórki następnie inkubowano ze środkami immunostymulującymi lub kontrolami przez 18-36 godzin w temperaturze 37 stopni z 10% CO2. Aktywację komórkową mierzono poprzez ekspresję markerów aktywacji na powierzchni komórki i produkcję cytokin. Poziomy ekspresji markerów powierzchniowych mierzono metodą cytometrii przepływowej z przeciwciałami przeciwko CD40 (5C3, BD), CD86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD) i CD16 (3G8, BD), CD14 (MΦP9, BD) i CD123 (7G3, BD). PBMC analizowano metodą cytometrii przepływowej z przeciwciałami przeciwko wyżej wymienionym markerom aktywacji oraz markerom linii CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) i CD69 (FN50, BD). We wszystkich przypadkach supernatant z hodowli komórkowej zbierano po 18 lub 36-godzinach inkubacji, a wytwarzanie cytokin mierzono za pomocą zestawów z macierzą cytokin (zestaw do oznaczania cytokin (Human Inflammatory Cytokine Kit, BD Biosciences) i ELISA (zestaw TNF Human ELISA, eBiosciences). Cytometria masowaPBMCs izolowano z krwi zdrowego dawcy i stymulowano ISAC, mieszaniną przeciwciała i adiuwantu lub bez bodźca przez 5-15 minut w temperaturze 37 stopni. Po stymulacji komórkiutrwalono przez dodanie 16 procent PFA (Electron microscopy sciences) do końcowego stężenia 1,6 procent i inkubowano przez 1 0 minut w temperaturze pokojowej (RT). Utrwalone komórki przepłukano pożywką do barwienia komórek (CSM; PBS z 0,5% BSA i 0,02% azydkiem sodu (wszystkie Sigma) i oznaczono kodem kreskowym przy użyciu podejścia opartego na palladzie, jak opisano wcześniej 54. Próbki z kodem kreskowym połączono w jedną próbka złożona do barwienia powierzchni.

Barwienie powierzchni przeprowadzono przez dodanie przeciwciał (tabela uzupełniająca 2) w CSM i inkubację przez 3{{10}} minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciała antyludzkie zakupiono jako sprzężone (Fluidigm) lub sprzężone z izotopami metali ciężkich przy użyciu zestawu do znakowania przeciwciał MaxPar X8 (Fluidigm) zgodnie z zaleceniami producenta. Wybarwione powierzchniowo komórki przemyto raz w CSM i permeabilizowano MeOH przez 10 minut na lodzie. Permeabilizowane komórki przemyto dwukrotnie CSM i dodano przeciwciała przeciwko antygenom wewnątrzkomórkowym na 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemyto CSM i ostatecznie ponownie zawieszono w roztworze interkalacyjnym (1,6% PFA w PBS, 0,02% saponiny (Sigma) i 0,5 µM interkalatora irydowego (Fluidigm)) przez noc w 4 stopniach. Przed akwizycją danych próbki płukano raz w CSM i dwukrotnie w ddH2O. Wszystkie próbki przefiltrowano przez sitko do komórek (Falcon) i ponownie zawieszono przy 1x106 komórek/ml w ddH2O uzupełnionym 1x czteroelementowymi kulkami kalibracyjnymi EQ (Fluidigm) i zebrano dane na cytometrze masowym CyTOF2 (Fluidigm). Odpowiedzi sygnalizacyjne oceniano przy użyciu implementacji SPADE w Citibank 29. Analizy prowadzono na wszystkich komórkach (bez próbkowania w dół), wybierając określoną liczbę klastrów i wykorzystując wszystkie odpowiednie markery powierzchniowe, ale bez markerów wewnątrzkomórkowych do grupowania. Linie komórek odpornościowych zostały opisane na podstawie ich wysokowymiarowych wzorców ekspresji białek powierzchniowych. Analizy statystyczne przeprowadzono w R, środowisku oprogramowania statystycznego o otwartym kodzie źródłowym. W każdym podzbiorze komórek, grupie leczonej i dawcy obliczono średnią krotność zmiany dla następujących dwudziestu markerów fosfobiałkowych: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p -SLP76, p-IRF-7, p-ZAP70/SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (ogółem), p-PLCG1, p-ERK1/2, p-p38, p -BTK/ITK, p-S6, p-STAT3 i p-JNK/SAPK. Średnia krotność zmiany była ważona przez całkowitą liczbę komórek w każdym skupieniu, jak zdefiniowano po grupowaniu SPADE. Przeprowadzono sparowane testy t w celu oszacowania różnicy w średniej krotności zmiany i przetestowania hipotezy zerowej, że nie było różnicy w średniej krotności zmiany każdego markera w warunkach leczenia i kontroli.

Procedura eksperymentalna na modelu heteroprzeszczepu guza Linie komórek guza zakupiono od ATCC (NCI-N87, HCC1954 i COLO205) lub AddexBio (JIMT-1) i hodowano zgodnie z wytycznymi producenta. Komórki zebrano, gdy osiągnęły 80-90 procent konfluencji przez odłączenie Accutase (Stemcell), przemyto PBS, ponownie zawieszono przy 40 x 106 komórek/ml w PBS i umieszczono na lodzie na nie dłużej niż dwie godziny. Bezpośrednio przed implantacją zawieszone komórki zmieszano z równą objętością Cultrex PathClear BME, typ 3 (R&D Systems), a 100 µl mieszaniny (2 x 106 komórek) wszczepiono podskórnie w prawy bok 6-8-tygodnia -stare samice myszy w następujący sposób: komórki NCI-N87 i COLO205 wszczepiono myszom NSG (Jackson Laboratory), komórki HCC1954 i JIMT-1 wszczepiono w Rag2/IL2rg double knockout (Taconic) i HCC1954 (do oceny z T785-ISAC) wszczepiono w NSG lubMyszy SCID/beżowe (Jackson Laboratory lub Taconic and Envigo). Wielkość guza rejestrowano dwa razy w tygodniu i oszacowano za pomocą następującego wzoru: (długość x szerokość2)/2. Gdy guzy osiągnęły 50-100 mm3, zwykle w ciągu tygodnia od implantacji guza, rozpoczęto leczenie. Myszy przydzielono losowo według wielkości guza do grup terapeutycznych przed początkowym leczeniem. Trastuzumab (EirGenix; EG12014), Trastuzumab ISAC lub Isotype ISAC przygotowano w PBS w stężeniu 1 mg/ml i podawano w dawce 5 mg/kg dootrzewnowo co pięć dni (Q5D) w sumie w sześciu dawkach. Myszy, których guzy przekroczyły 2000 mm3, zostały poddane eutanazji.

Procedura eksperymentalna deplecji komórek HCC1954 i MMC Aby zubożyć makrofagi i inne komórki fagocytarne, myszy z guzami HCC1954 lub MMC leczono przez wstrzyknięcie dootrzewnowe na dwa dni przed wstępnym leczeniem ISAC liposomami klodronianu lub liposomami kontrolnymi niezawierającymi klodronianu jako kontroli negatywnej (Encapsula, nr katalogowy CLD-8901), a następnie leczono dwa razy w tygodniu przez łącznie trzy tygodnie. Aby zubożyć neutrofile, myszy potraktowano zubożającymi przeciwciałami 1A8 w celu zubożenia tylko Ly6G plus neutrofili (BioXCell nr katalogowy BE0075-1) lub RB6-8C5 w celu zubożenia komórek Gr1 plus, które obejmują Ly6G plus neutrofile i Ly6C plus komórki (BioXCell nr katalogowy BE0075) lub kontrole izotypowe 2A3 i LTF-2 (odpowiednio BioXCell nr katalogowy BE0089 i BE0090) dwa dni przed wstępnym leczeniem ISAC, a następnie leczone dwa razy w tygodniu przez trzy tygodnie. Ubytek komórek we krwi potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej (rysunek uzupełniający 24). Procedura analizy cytokin i mRNA guza Nowotwory wszczepiono jak opisano wcześniej i zebrano do analizy we wskazanych punktach czasowych po leczeniu. W celu przeprowadzenia analizy immunohistochemicznej i mRNA, guzy podzielono, a mRNA przeanalizowano za pomocą panelu profilowania immunologicznego trzustki mysiej NanoString. Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania nSolver Advanced Analysis Software zgodnie z zaleceniami producenta. Wykresy wulkanu sporządzono za pomocą pakietu ggplot2 w R. Aby uzyskać lizaty nowotworu do analizy cytokin, fragmenty nowotworu trzymano we wcześniej przygotowanym buforze (1 tabletki inhibitora proteazy Pierce (Thermo Fisher, nr katalogowy A32965) rozpuszczone w 20 ml T- Odczynnik do ekstrakcji białek tkankowych PER, Thermo Fisher, katalog #78510) w probówkach GentleMACS M (Miltenyi, nr katalogowy 130-093-236) bezpośrednio po sekcji. Próbki guza poddano następnie dysocjacji przy użyciu GentleMACS Octo Dissociator. Wszystkie próbki wirowano przez 5 minut przy 300 g później. Supernatanty następnie zebrano do probówek mikrowirówkowych i ponownie odwirowano za pomocą mikrowirówki. Analizę cytokin przeprowadzono na supernatantach za pomocą MSD. Przeprowadzono immunohistochemię przy użyciu hematoksyliny i eozyny w celu zidentyfikowania architektury tkankowej, jak również dla następujących markerów, które wskazano w badaniach: CD11c (Katalog CST #87585) i CD8 (Katalog CST #98941).

Rycina 4: T785-ISAC wywołują silną odporność przeciwnowotworową w modelach heteroprzeszczepu guza opornego na trastuzumab. (ad) Myszom SCID/Beige lub NSG wszczepiono linię komórek nowotworowych HCC1954 i poddano randomizacji, gdy objętość guza osiągnęła 50 – 75 mm3. (a) Myszy leczono raz dootrzewnowo (IP) 5 mg/kg trastuzumabem T785-ISAC lub trastuzumabem lub równoważnymi molowo dawkowaniem mieszaniny trastuzumabu i T785 do ISAC przez wstrzyknięcie do guza (IT). Dane pochodzą z jednego eksperymentu z n=3-5 myszami na grupę. (b) Myszy leczono przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 5 mg/kg trastuzumabu, trastuzumab-ISAC,rytuksymab lub rytuksymab-ISAC Q5DX6 (n= 5 myszy na grupę). (c) Myszy leczono przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 5 mg/kg trastuzumabu, trastuzumabu T785-ISAC, trastuzumabu N297A-ISAC lub trastuzumabu TLRnull-ISAC (n=5 myszy na grupę). (d) Komórki nowotworowe HCC1954 wszczepiono myszom SCID/Beige, a komórki będące przedmiotem zainteresowania zostały usunięte przed i podczas leczenia trastuzumabem T785-ISAC (5 mg/kg, Q5DX3) przy użyciu przeciwciała anty-Ly6G (kontrola szczurzej IgG2a) , liposomy klodronianowe (liposomy kontrolne jako kontrola) lub przeciwciało anty-Gr1 (kontrola szczurzego IgG2b). Dane pochodzą z jednego eksperymentu z n=4-6 myszami na grupę. (e, f) myszom z podwójnym nokautem NSG lub Rag2/IL2rg wszczepiono linię komórek nowotworowych JIMT-1 i randomizowano, gdy objętość guza osiągnęła 50 – 75 mm3. Myszy następnie leczono wskazanymi terapiami w dawce 5 mg/kg dootrzewnowo z częstotliwością (e) Q5DX6lub (f) Q5DX5 (n=3-6 myszy na grupę). (bf) Przedstawione dane są reprezentatywne dla co najmniej dwóch eksperymentów. (gj) Guzy HCC-1954 pobrano z kohort myszy we wskazanych punktach czasowych po leczeniu pojedynczą dawką 5 mg/kg ISAC lub przeciwciał kontrolnych. Nowotwory poddano analizie metodą cytometrii przepływowej, oznaczeniu ilościowym mRNA NanoString lub utrwalonym w formalinie i zatopionym w parafinie do celów immunohistochemicznych. (g) Wykresy wulkanu przedstawiają log2-krotną zmianę ekspresji genów w guzach leczonych w porównaniu z kontrolą izotypową, mierzoną za pomocą NanoString po 24 godzinach (n=5 myszy na grupę). Zmiany z skorygowaną wartością p < 0.05="" są="" pokazane="" na="" czerwono.="" (h)="" punktacja="" sygnatur="" genów="" określona="" ilościowo="" za="" pomocą="" punktacji="" ścieżki="" zaawansowanej="" analizy="" nsolver="" dla="" guzów="" analizowanych="" 24="" godziny="" po="" leczeniu="" (n="5" myszy="" na="" grupę).="" (i)="" analiza="" składu="" komórek="" guza="" metodą="" cytometrii="" przepływowej="" 24="" godziny="" i="" 7="" dni="" po="" leczeniu="" (n="2-4" myszy="" na="" grupę).="" dane="" są="" reprezentatywne="" dla="" co="" najmniej="" 2="" eksperymentów.="" (j)="" reprezentatywne="" obrazy="" oraz="" oznaczenie="" ilościowe="" f4/80="" i="" cd11c="" ihc="" guzów="" zebranych="" 9="" dni="" po="" każdym="" wskazanym="" leczeniu.="" słupki="" skali="" mają="" 50="" μm.="" (aj)="" dane="" są="" pokazane="" jako="" średnia="" z="" sem,="" a="" statystyki="" są="" pokazane="" z=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Procedura eksperymentalna z syngenicznym modelem guza Komórki MMC uzyskano od Dr. Disis (University of Washington) i hodowano w RPMI 1640 uzupełnionej 20% FBS, 1% penicyliną-streptomycyną i L-glutaminą w 37°C i 5% CO2 aż do {{8 }} procent konfluencji. Komórki CT26 (ATCC) transfekowane w celu stabilnej ekspresji szczurzego białka HER2 hodowano w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FBS i 600 ug/ml selektywnego antybiotyku G418 (Thermo) w 37°C i 5% CO2 aż do 80-90% konfluencji. Po uzyskaniu wystarczającej konfluencji komórki zebrano przez odłączenie Accutase (Stemcell) i przemycie PBS. Zebrane komórki zawieszono ponownie przy 20 x 106 komórek/ml (MMC)lub 5 x 106 komórek/ml (CT26-rHER2) w PBS i trzymane w 4 stopniach/na lodzie do czasu użycia. 100 μLzawieszonych komórek wszczepiono podskórnie 6-8-tygodniowe myszy FVB/N-TgN(MMTV-Erbb2)NK1Mul/J (model MMC, The Jackson Laboratory) lub samice myszy BALB/c (model CT26, The Jackson Laboratory) . Rozmiar guza mierzono i rejestrowano dwukrotnietydzień na czas trwania badania. Objętość guza oszacowano za pomocą następującego wzoru: (długość x szerokość2)/2. Gdy guzy osiągnęły 200-500 mm3 (MMC) lub 50-100 mm3 (CT26-rHER2), zwykle w ciągu tygodnia od implantacji guza, rozpoczęto leczenie. Myszy przydzielono losowo według wielkości guza do grup terapeutycznych przed rozpoczęciemleczenie. mAb anty-rHER2 (BioXCell; 7.16.4) lub anty-rHER2-ISAC podawano dootrzewnowo (częstotliwość wskazana w legendach figur) przez czas trwania badania.Myszy, których guzy przekroczyły 2000 mm3, zostały poddane eutanazji. Oceniono deplecję komórek Tu zwierząt stosujących przeciwciała zubożające komórki CD4 (BioXCell; GK1.5) lub CD8 (BioXCell; YTS 169.4). Wyczerpywanie rozpoczęto przed implantacją nowotworu i kontynuowano przy podawaniu dwa razy w tygodniu 200 ug na przeciwciało. W celu ponownego prowokowania nowotworu, linie komórkowe CT26 i 4T1 wszczepiono w ilości 5 x 106 komórek na linię nowotworu, a myszy bez nowotworu prowokowano obiema liniami komórkowymi jako kontrolami.

Materiały uzupełniające Dodatkowe materiały można znaleźć w internetowej wersji PubMed Central. Podziękowania: Autorzy pragną podziękować P. Basto, NE Reticker-Flynn, T. Prestwood i B. Malletowi za ich pomocną dyskusję. Dziękujemy również Stanford Blood Center Flow Cytometry Core, w szczególności L. Tolentino, O. Choi i N.Wu. Wyrażamy również nasze uznanie dla dr Mary L. (Nora) Disis i Denise Cecil z University of Washington, które dostarczyły linię komórek nowotworowych MMC.

Finansowanie: SE Ackerman był wspierany przez stypendium Stanford BioX Bowes.

Referencje:1. Davis TA i in. Terapia przeciwciałem monoklonalnym anty-CD20 rytuksymabem w chłoniaku nieziarniczym: bezpieczeństwo i skuteczność ponownego leczenia. J Clin Oncol 18, 3135–3143, doi:10.1200/JCO.2000.18.17.3135 (2000). [PubMed: 10963642]2. Grillo-Lopez AJ i in. Rytuksymab: pierwsze przeciwciało monoklonalne zatwierdzone do leczenia chłoniaka. Curr Pharm Biotechnol 1, 1-9 (2000). [PubMed: 11467356]3. Lizotte PH i in. Profilowanie wieloparametryczne niedrobnokomórkowych raków płuca ujawnia różne immunofenotypy. JCI Insight 1, e89014, doi:10,1172/jci.insight.89014 (2016). [PubMed: 27699239]4. Sprangera S i in. Gęstość antygenów immunogennych nie wyjaśnia obecności lub nieobecności mikrośrodowiska guza z zapaleniem komórek T w czerniaku. Proc Natl Acad Sci USA 113, E7759–E7768, doi:10.1073/pnas.1609376113 (2016). [PubMed: 27837020]5. Beatty GL & Gladney WL Mechanizmy ucieczki immunologicznej jako przewodnik po immunoterapii raka. Clin Cancer Res 21, 687-692, doi: 10,1158/1078-0432.CCR-14-1860 (2015). [PubMed: 25501578]6. Fridman WH, Strony F, Salutes-Fridman C i Galon J Kontekst immunologiczny w ludzkich nowotworach: wpływ na wynik kliniczny. Nat Rev Cancer 12, 298-306, doi: 10.1038/nrc3245 (2012). [PubMed: 22419253]

7. Galon J & Bruni D Podejścia do leczenia immunologicznych gorących, zmienionych i zimnych guzów za pomocą skojarzonych immunoterapii. Nat Rev Drug Discov 18, 197–218, doi:10.1038/s41573-018-0007-y (2019). [PubMed: 30610226]8. Gabrilovich DI, Ostrand-Rosenberg S i Bronte V Skoordynowana regulacja komórek szpiku przez nowotwory. Nat Rev Immunol 12, 253–268, doi: 10.1038/nri3175 (2012). [PubMed: 22437938]9. Wykluczenie limfocytów T Joyce JA & Fearon DT, przywileje immunologiczne i mikrośrodowisko guza. Science 348, 74–80, doi:10.1126/science.aaa6204 (2015). [PubMed: 25838376] 10. Carmi Y i in. Akt i SHP-1 są wewnętrznymi punktami kontrolnymi DC dla odporności na nowotwory. JCI Insight 1, e89020, doi: 10,1172/jci.insight.89020 (2016). [PubMed: 27812544]11. Carmi Y i in. Allogeniczne IgG w połączeniu z bodźcami komórek dendrytycznych indukują przeciwnowotworową odporność komórek T. Natura 521, 99–104, doi: 10.1038/nature14424 (2015). [PubMed: 25924063]12. Allen BM i in. Dysfunkcja systemowa i plastyczność mikrośrodowiska immunologicznego w modelach nowotworów. Nat Med 26, 1125–1134, doi:10.1038/s41591-020-0892-6 (2020). [PubMed: 32451499]13. Sagiv-Barfi I i in. Zwalczanie samoistnych nowotworów złośliwych przez miejscową immunoterapię. Sci Transl Med 10, doi:10.1126/scitranslmed.aan4488 (2018).14. Spitzer MH i in. Odporność ogólnoustrojowa jest wymagana do skutecznej immunoterapii raka. Komórka 168, 487–502 e415, doi:10.1016/j.cell.2016.12.022 (2017). [PubMed: 28111070]15. Milhem Mohammed M., Theresa Medina RG, Kirkwood John M., Buchbinder Elizabeth, Mehmi Inderjit, Niu Jiaxin, Shaheen Montaser, Weight Ryan, Margolin Kim, Luke Jason, Morris Aaron, Mauro David, Krieg Arthur M., Ribas Antoni CT{ {77}}Agonista receptora Toll-podobnego (TLR9), CMP-001 wewnątrz guza, w połączeniu z pembrolizumabem może odwrócić oporność na hamowanie PD-1 w badaniu fazy 1b u pacjentów z zaawansowanym czerniakiem (coroczne spotkanie AACR 2018, 2018).16. Rook AH Piękno agonistów TLR dla CTCL. Krew 119, 321–322, doi: 10,1182/ krew -2011-11-391243 (2012). [PubMed: 22247516]17. Singh M i in. Skuteczna wrodzona i adaptacyjna odporność na czerniaka dzięki zlokalizowanej aktywacji TLR7/8. J Immunol 193, 4722-4731, doi: 10.4049/J Immunol.1401160 (2014). [PubMed:25252955]18. Zhao BG, Vasilakos JP, Tross D, Smirnov D i Klinman DM Terapia skojarzona ukierunkowana na receptory Toll-like 7, 8 i 9 eliminuje duże, ustalone nowotwory. J Immunother Cancer 2, 12, doi: 10,1186/2051-1426-2-12 (2014). [PubMed: 24982761]19. Jurk M i in. Ludzkie TLR7 lub TLR8 niezależnie nadają odpowiedź na związek przeciwwirusowy R-848. Nat Immunol 3, 499, doi: 10.1038/ni 0602-499 (2002). [PubMed: 12032557]20. Chattergoon MA i in. HIV i HCV aktywują inflamasom w monocytach i makrofagach poprzez endosomalne receptory Toll-podobne bez indukcji interferonu typu 1. PLoS Pathog 10, e1004082, doi:10.1371/journal.bat.1004082 (2014). [PubMed: 24788318]21. Eigenbrod T, Pelka K, Latz E, Kreikemeyer B i Dalpke AH TLR8 wyczuwają bakteryjne RNA w ludzkich monocytach i odgrywają rolę niezbędną do rozpoznawania Streptococcus pyogenes. J Immunol 195, 1092-1099, doi: 10.4049/J Immunol.1403173 (2015). [PubMed: 26101323]22. Mattson G i in. Praktyczne podejście do sieciowania. Mol Biol Rep 17, 167-183 (1993). [PubMed: 8326953]23. Gabay C, Ben-Bassat H, Schlesinger M & Laskov R Somatyczne mutacje i zmienności wewnątrzklonalne w przegrupowanych genach Vkappa linii komórek chłoniaka nieziarniczego B. Eur J Haematol 63, 180–191, doi:10.1111/j.1600-0609.1999.tb01766.x (1999). [PubMed: 10485273]24. Alonso MN i in. Komórki T(H)1, T(H)2 i T(H)17 instruują monocyty do różnicowania się w wyspecjalizowane podzbiory komórek dendrytycznych. Krew 118, 3311–3320, doi: 10,1182/krew-2011-03-341065 (2011). [PubMed: 21813450]25. Clarke SR i in. Charakterystyka transgenicznej linii TCR specyficznej dla owoalbuminy OT-I: elementy MHC do selekcji pozytywnej i negatywnej. Immunol Cell Biol 78, 110-117, doi:10.1046/j.1440-1711.2000.00889.x (2000). [PubMed: 10762410]26. Zehn D, Lee SY i Bevan MJ Kompletne, ale ograniczona odpowiedź komórek T na antygen o bardzo niskim powinowactwie. Nature 458, 211–214, doi: 10.1038/nature07657 (2009). [PubMed: 19182777]27. Kondratova M i in. Wieloskalowa mapa sieci sygnalizacyjnej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w raku ujawnia sygnatury niejednorodności komórek. Nat Commun 10, 4808, doi:10.1038/s41467-019-12270-x (2019). [PubMed: 31641119]

28. Bendall SC i in. Jednokomórkowa cytometria masowa różnicujących odpowiedzi immunologicznych i lekowych w kontinuum krwiotwórczym człowieka. Science 332, 687–696, doi:10.1126/science.1198704 (2011).[PubMed: 21551058]29. Qiu P i in. Wyodrębnianie hierarchii komórkowej z wysokowymiarowych danych cytometrycznych za pomocą SPADE. Nat Biotechnol 29, 886–891, doi: 10.1038/nbt.1991 (2011). [PubMed: 21964415] 30. Sygnalizacja Kawai T i Akira S TLR. Cell Death Differ 13, 816-825, doi: 10.1038/sj.cdd.4401850 (2006). [PubMed: 16410796] 31.Sanchez-Mejorada G & Rosales C Przekazywanie sygnału przez receptory immunoglobuliny Fc. J Leukoc Biol 63, 521-533 (1998). [PubMed: 9581795]32. Krishnaswamy S i in. Biologia systemów. Warunkowa analiza sygnalizacji limfocytów T oparta na gęstości w danych pojedynczych komórek. Science 346, 1250689, doi:10.1126/science.1250689 (2014). [PubMed: 25342659]33. Kiefer F i in. Białkowa kinaza tyrozynowa Syk jest niezbędna do sygnalizacji receptora Fcgamma w makrofagach i neutrofilach. Mol Celi Biol 18, 4209-4220 (1998). [PubMed: 9632805]34. Braselmann S i in. R406, dostępny doustnie inhibitor kinazy tyrozynowej śledziony, blokuje sygnalizację receptora Fc i zmniejsza stan zapalny, w którym pośredniczy kompleks immunologiczny. J Pharmacol Exp Ther 319, 998-1008, doi:10.1124/jpet.106.109058 (2006). [PubMed: 16946104]35. Bruhns P i in. Specyficzność i powinowactwo ludzkich receptorów Fcgamma i ich wariantów polimorficznych do podklas ludzkich IgG. Krew 113, 3716–3725, doi: 10,1182/krew-2008-09-179754 (2009). [PubMed: 19018092]36. Nimmerjahn F & Ravetch JV Rozbieżna aktywność podklasy g immunoglobulin poprzez selektywne wiązanie receptora Fc. Science 310, 1510–1512, doi:10.1126/science.1118948 (2005). [PubMed: 16322460]37. Jefferis R Rekombinowane przeciwciała terapeutyczne: wpływ glikozylacji na mechanizmy działania. Trends Pharmacol Sci 30, 356–362, doi:10.1016/j.tips.2009.04.007 (2009). [PubMed: 19552968]38. Tanji H, Ohio U, Shibata T, Miyake K i Shimizu T Strukturalna reorganizacja dimerów receptora Toll-podobnego 8 indukowana przez agonistyczne ligandy. Science 339, 1426–1429, doi:10.1126/nauka.1229159 (2013). [PubMed: 23520111]39. Shultz LD i in. Rozwój ludzkich komórek limfoidalnych i szpikowych u myszy NOD/LtSz, u których zastosowano IL2R gamma null z wszczepionymi zmobilizowanymi ludzkimi hemopoetycznymi komórkami macierzystymi. J Immunol 174, 6477-6489, doi: 10.4049/J Immunol.174.10.6477 (2005). [PubMed: 15879151]40. Xia Z i in. Wrodzona odpowiedź immunologiczna na implantację komórek fibroblastycznych ludzkiego szpiku kostnego u myszy CB17 SCID/beige. J Celi Biochem 98, 966-980, doi: 10.1002/jcb.20730 (2006). [PubMed: 16795075]41. Tanner M i in. Charakterystyka nowej linii komórkowej otrzymanej od pacjentki z rakiem piersi opornym na Herceptin. Mol Cancer Ther 3, 1585-1592 (2004). [PubMed: 15634652]42.Luque-Cabal M, Garcia-Teijido P, Fernandez-Perez Y, Sanchez-Lorenzo L i Palacio-Vazquez I Mechanizmy stojące za opornością na trastuzumab w HER2-Wzmocniony rak piersi i strategie przezwyciężenia To. Clin Med Insights Oncol 10, 21–30, doi:10.4137/CMO.S34537 (2016). [PubMed: 27042153]43. Li JY i in. Dwuparatopowa HER2-ukierunkowana na HER 2-koniugat przeciwciało-lek wywołuje regresję guza w modelach pierwotnych opornych na HER lub niekwalifikujących się do HER2-Terapia celowana. Cancer Cell 29, 117– 129, doi: 10.1016/j.ccell.2015.12.008 (2016). [PubMed: 26766593]44. Ning S, Pagano JS & Barber GN IRF7: aktywacja, regulacja, modyfikacja i funkcja. Genes Immun 12, 399-414, doi:10.1038/gene.2011.21 (2011). [PubMed: 21490621]45. Cao Q i in. Nerki F4/80 plus CD11c plus jednojądrzaste fagocyty wykazują cechy fenotypowe i funkcjonalne makrofagów w zdrowiu i nefropatii adriamycyny. J Am Soc Nephrol 26, 349-363, doi: 10.1681/ASN.2013121336 (2015). [PubMed: 25012165]46. Sheng J i in. Odrębny podzbiór komórek pochodzących z monocytów wśród typowych konwencjonalnych komórek dendrytycznych typu 2 może skutecznie występować krzyżowo. Cell Rep 21, 1203–1214, doi:10.1016/j.celrep.2017.10.024 (2017). [PubMed: 29091760]

47. Knutson KL, Almand B, Dang Y i Disis ML Neu antygenowo ujemne warianty można wygenerować po terapii przeciwciałami swoistymi dla neu u transgenicznych myszy neu. Cancer Res 64, 1146-1151 (2004). [PubMed: 14871850]48. Moynihan KD i in. Zwalczanie dużych, ustalonych guzów u myszy za pomocą skojarzonej immunoterapii, która angażuje wrodzoną i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. Nat Med 22, 1402–1410, doi: 10.1038/nm.4200 (2016). [PubMed: 27775706]49.Siebenlist U, Franzoso G & Brown K Struktura, regulacja i funkcja NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol 10, 405-455, doi: 10,1146/annurev.cb.10.110194.002201 (1994) . [PubMed: 7888182]

Figura 6: CL264-zawierające ISAC wywołują usuwanie guza w podłożu HER2 eksprymującym heteroprzeszczepy i usuwanie guza za pośrednictwem limfocytów T, pamięć immunologiczną i rozprzestrzenianie się epitopów w syngenicznym modelu guza. (a) Struktury chemiczne adiuwantów T785 i CL264 stosowanych do generowania ISAC. (b) Myszy NSG, którym wszczepiono linię komórek nowotworowych HCC1954, poddano randomizacji, gdy objętość guza osiągnęła 50 – 75 mm3. Myszy leczono raz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 mg/kg trastuzumabu, trastuzumabu T785-ISAC lub trastuzumabu CL264-ISAC. Nowotwory zbierano 20 godzin po podaniu, przetwarzano w zawiesinę pojedynczych komórek i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny aktywacji szpikowych APC naciekających nowotwór. (cd) myszom z podwójnym nokautem NSG lub Rag2/IL2rg wszczepiono wskazaną ludzką linię komórkową nowotworu i poddano randomizacji, gdy objętość guza osiągnęła 50-75 mm3 (HCC1954) lub 75-150 mm3 (JIMT-1). Myszy leczono poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe 5 mg/kg rytuksymabu, trastuzumabu, trastuzumabu T785-ISAC, trastuzumabu CL264-ISAC lub odpowiedniego izotypu-ISAC, co 5 dni, łącznie 6 zabiegów. (e) ekspresję rHER2 mierzono na komórkach guza CT26-rHER2 w hodowli przed implantacją (lewy wykres przepływu) oraz w guzach dziewięć dni po implantacji (prawy wykres przepływu) za pomocą cytometrii przepływowej z fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem anty-rHER2 (czerwony) lub kontrola izotypu (niebieski). (f) Myszom Balb/c wszczepiono linię komórek nowotworowych CT26-rHER2 i poddano randomizacji, gdy objętość guza osiągnęła 50mm3. Myszy następnie leczono przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 10 mg/kg mysiego środka przeciw szczuromHER2 lub mysie przeciwciało przeciw szczurzemu HER2 CL264-ISAC co 5 dni, łącznie 6 zabiegów. Przedstawione dane pochodzą z 1 eksperymentu z 8 myszami na ramię i są reprezentatywne dla 3 eksperymentów.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 dni po ostatnim leczeniu poddano prowokacji liniami komórek macierzystych CT26 (lewy bok) i 4T1 (prawy bok), z lub bez deplecji limfocytów T CD4 i CD8 (n =3 każdy). Myszy bez nowotworu (n=6) prowokowane rodzicielskimi liniami komórkowymi CT26 i 4T1 włączono jako kontrole. (ai) Przedstawiono dane z indywidualnych eksperymentów z 3-6 myszami na ramię i są reprezentatywne dla 1-4 eksperymentów z co najmniej 3 myszami na ramię w każdym eksperymencie. Dane są pokazane jako średnia z SEM, a statystyki są pokazane z *P<><0.01,><0.001, and=""><>

50. Vogelpoel LT i in. Przenikanie FcgammaRIIa z receptorami TLR, IL-1R i IFNgammaR selektywnie moduluje wytwarzanie cytokin w ludzkich komórkach szpiku. Immunobiology 220, 193-199, doi:10.1016/j.imbio.2014.07.016 (2015). [PubMed: 25108563]51. Daley JM, Thomas AA, Connolly MD, Reichner JS i Albina JE Zastosowanie przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla Ly6G do zubożenia neutrofili u myszy. J Leukoc Biol 83, 64-70, doi: 10,1189/jlb.0407247 (2008). [PubMed: 17884993]52. Broz ML i in. Preparowanie przedziału szpikowego guza ujawnia rzadkie aktywujące komórki prezentujące antygen, krytyczne dla odporności komórek T. Cancer Cell 26, 938, doi:10.1016/j.ccell.2014.11.010 (2014).53. Spranger S, Dai D, Horton B i Gajewski TF Rezydujące w guzie komórki dendrytyczne Batf3 są wymagane do transportu komórek efektorowych T i adaptacyjnej terapii komórkami T. Cancer Cell 31, 711-723 e714, doi:10.1016/j.ccell.2017.04.003 (2017). [PubMed: 28486109]54. Zunder ER i in. Oparte na palladzie kody kreskowe komórek znaczników masy ze schematem filtrowania podwójnego i algorytmem dekonwolucji pojedynczej komórki. Nat Protoc 10, 316–333, doi: 10.1038/nprot.2015.020 (2015). [PubMed: 25612231]