Ulepszone działanie przeciwutleniające i przeciwutleniające polisacharydu z nasion Cuscuta Chinensis Lam po hydrolizie enzymatycznej

Abstrakcyjny

Polisacharyd Cuscuta chinensis (CPS) ekstrahowano gorącą wodą i enzymatycznie zhydrolizowany polisacharyd C. chinensis (ECPS) wytworzono w procesie enzymatycznej hydrolizy mannanazy. Celem pracy było zbadanie antymelanogennego działania ECPS i CPS w komórkach czerniaka B16F10. Aktywność przeciwutleniającą in vitro oceniano na podstawie ich mocy redukującej żelazo żelazowe i aktywności wychwytywania wolnych rodników DPPH. Rozkład masy cząsteczkowej polisacharydów określono stosując SEC-MALLS-RI. CPS z powodzeniem degradowano enzymatycznie przy użyciu mannozy, a średnie ważone masy cząsteczkowe CPS i ECPS wynosiły 434,6 kDa i 211,7 kDa. Wyniki testów aktywności biologicznej sugerowały, że enzymatycznie zhydrolizowany polisacharyd miał lepszą aktywność antymelanogenną i działanie przeciwutleniające niż oryginalny polisacharyd. ECPS wykazywał działanie przeciwmelanogenne poprzez regulację w dół ekspresji tyrozynazy, MITF i TRP-1 bez działania cytotoksycznego w komórkach czerniaka B16F10. Podsumowując, ECPS ma potencjał, aby stać się produktem wybielającym skórę. Według odpowiednich badań,cistanchejest pospolitym ziołem znanym jako „cudowne zioło przedłużające życie”. Jego głównym składnikiem jest cistanozyd, który ma różne działanie, takie jak przeciwutleniacz, działanie przeciwzapalne i promowanie funkcji odpornościowych. Mechanizm pomiędzycistancheIWybielanie skórypolega na działaniu przeciwutleniającym glikozydów cistanche.Melaninaw ludzkiej skórze powstaje w wyniku katalizowanego przez utlenianie tyrozynytyrozynaza, a reakcja utleniania wymaga udziału tlenu, więc wolne rodniki tlenowe w organizmie stają się ważnym czynnikiem wpływającym na produkcję melaniny. Cistanche zawiera cistanoside, który jest przeciwutleniaczem i może w ten sposób zmniejszać wytwarzanie wolnych rodników w organizmiehamowanie produkcji melaniny.

Wstęp 

regulator genów biosyntezy melaniny. MITF bierze również udział w regulacji pigmentacji, proliferacji i różnicowania melanocytów (5). sygnalizacja receptora a-MSH-melanokortyny 1 występuje w specyficznych enzymach melanogennych, w tym TRP-1; tyrozynaza jest również regulowana przez MITF (5). Wiele środków wybielających skórę wywiera działanie antymelanogenne poprzez regulację ekspresji tyrozynazy lub działanie hamujące aktywność tyrozynazy. Ponadto wewnątrzkomórkowy poziom przeciwutleniaczy i produkcja wolnych rodników również wpływają na zawartość melaniny (6). Dlatego inhibitory tyrozynazy i związki przeciwutleniające są często wybierane jako środki wybielające skórę. Cuscuta chinensis Lam., zwana po chińsku TuSiZi, to tradycyjna chińska medycyna powszechnie stosowana jako żywność funkcjonalna i znana ze zwiększania zdolności układu rozrodczego (7). W ostatnich latach niektóre doniesienia wskazywały na jego zastosowanie w leczeniu piegów i bielactwa (8). Inne doniesienia wykazały, że wywiera pozytywny wpływ na ochronę skóry (9) oraz indukuje hamowanie aktywności tyrozynazy (10).

Kliknij na korzyści Rou Cong Rong dla wybielania

Zapytaj o więcej:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Polisacharydy są głównymi składnikami ekstraktu wodnego C. chinensis Lam. nasion, które uważa się za mające działanie antyapoptotyczne (11) i immunologiczne (12). Poprzednie wyniki analityczne wskazywały, że C. chinensis Lam. polisacharyd składa się z fruktozy, mannozy, ksylozy i arabinozy; mannoza jest głównym składnikiem cukru (13). Wielu badaczy wykazało, że lepkość (14), rozkład masy cząsteczkowej (Mw) (15) i udział monosacharydów (16) polisacharydów mają ogromny wpływ na ich bioaktywność. Co więcej, ostatnie badania wykazały, że zdegradowane polisacharydy o niskiej Mw wykazują wyższą aktywność przeciwutleniającą i hamującą tyrozynazę niż oryginalny polisacharyd (17). Zatem wytwarzanie polisacharydu o niskiej Mw z C. chinensis Lam. nasiona są niezbędne do poprawy jego bioaktywności. Wśród różnych procesów degradacji, główne zalety degradacji enzymatycznej to specyficzność substratowa, wysoka selektywność i łagodne warunki, które dają hydrolizaty o dobrze zdefiniowanej strukturze (18).

Na podstawie tych badań farmakologicznych spekulowaliśmy, że polisacharyd C. chinensis (CPS) i enzymatycznie hydrolizowany polisacharyd C. chinensis (ECPS) mogą być skutecznymi lekami botanicznymi poprawiającymi przebarwienia. Mannazę zastosowano do uzyskania ECPS o niskiej Mw z nasion. Ponadto oszacowano aktywność przeciwmelanogenną i przeciwutleniającą polisacharydów o różnych Mw oraz zbadano zależność między bioaktywnościami a Mw polisacharydów.

Materiał i metody

Odczynniki

Chemikalia do działania enzymów i przeciwutleniaczy zakupiono od Sigma Co. (USA). Wszystkie inne odczynniki i chemikalia zakupiono od firmy Aladdin (Chiny).

Przygotowanie CPS i ECPS

Materiały lecznicze nasion Cuscuta chinensis Lam zostały dostarczone przez firmę Guang Dong Feng Chun Pharmaceutical CO., LTD (Chiny). Około 500 g suchych materiałów sproszkowano i nasączono 1200 ml 80% etanolu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej w celu usunięcia lipidów, oligosacharydów i kolorowych materiałów. Wstępnie potraktowane próbki infiltrowano szmatką, a następnie wysuszoną pozostałość trzykrotnie ekstrahowano 3000 ml wody w temperaturze 90 stopni. Wodne ekstrakty oddzielono od pozostałości przez odwirowanie (4000 g przez 5 min w 22 stopniach), a następnie zatężono w 70 stopniach pod zmniejszonym ciśnieniem; kondensat wytrącano 60% etanolem w 3 stopniach przez 24 godziny. Ostatecznie osad odbiałczono metodą Sevag, dializowano przez membranę 3500 Da, liofilizowano, a następnie znakowano polisacharydem C. chinensis (CPS).

Enzymatycznie zhydrolizowany polisacharyd C. chinensis (ECPS) otrzymano przez hydrolizę z mannozą (0,1 procent w buforze octanu sodu) w stosunku mannozy do substratu 5:1 (obj./wag.) w temperaturze 60 stopni, pH 4,5 przez 6 godz. Następnie reakcję katalizy zakończono we wrzącej wodzie na 10 minut. Roztwór reakcyjny wirowano przy 10, 000 g przez 15 minut (4 stopnie), a supernatant zbierano do dializy w temperaturze 3 stopni przez 3 dni z membraną 3500 Da w celu usunięcia substancji małocząsteczkowych i liofilizowano.

Pomiar SEC-MALLS-RI

Hodowla komórkowa i test żywotności

Mysie komórki czerniaka B16F10 zakupiono od firmy Biochemistry and Cell Biology (Chiny). Komórki utrzymywano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 mg/ml streptomycyny i 100 IU/ml penicyliny w 37 stopniach w wilgotnych warunkach zawierających 5% CO2. Komórki wysiano na płytki hodowlane i uzupełniono różnymi stężeniami próbek i hormonem stymulującym melanocyty (a-MSH) przez 72 godziny w celu zmierzenia wewnątrzkomórkowej aktywności tyrozynazy i ilościowego określenia zawartości melaniny.

Test bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,{5}}difenylotetrazoliowego (MTT) przeprowadzono w celu zbadania żywotności komórek (20). Pokrótce, 96-dołkowe płytki wysiano mysimi komórkami czerniaka B16F10. Objętość 50 µl 2 mg/ml MTT przeniesiono do każdej studzienki po potraktowaniu 100 µl różnych stężeń próbek przez 24 godziny. Po 4-h inkubacji reakcję zakończono i dodano sulfotlenek dimetylu w celu rozpuszczenia nierozpuszczalnego produktu. Absorbancję mierzono przy 590 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Pomiar zawartości melaniny

Oznaczenie zawartości melaniny przeprowadzono nieco zmodyfikowaną metodą (21). Po przemyciu lodowatym PBS, komórki czerniaka (2 x 104 komórek na studzienkę) wysiano na 96- płytce studzienkowej i inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 48 godzin. Następnie do każdej studzienki dodano 100 ml NaOH (1N) w celu rozpuszczenia komórek czerniaka w temperaturze 80 stopni przez 30 minut. Lizat wirowano przy 15, 000 g przez 15 minut (4 stopnie). Następnie zmierzono absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy 405 nm. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

Test wewnątrzkomórkowej aktywności tyrozynazy

Żelazo żelazowe zmniejsza moc

Test mocy redukującej żelazo żelazowe przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą z niewielkimi modyfikacjami (23). Różne stężenia próbek (2 ml) lub Vc (kontrola pozytywna) zmieszano z 2 ml żelazicyjanku potasu (1 procent, W/V) i 2 ml buforu fosforanowego (0,2 M, pH 6,8). Po inkubacji w 5 {19}} stopniach przez 3 0 min, 2 ml kwasu trichlorooctowego (10 procent, wag./obj.) przeniesiono do mieszaniny reakcyjnej i wirowano przy 4000 g przez 15 min (22 stopnie). Supernatant (2 ml) zmieszano z mieszaniną zawierającą 2 ml wody destylowanej i 0,4 ml FeCl3 (0,1 procent, wag./obj.). Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37°C zmierzono absorbancję czytnikiem mikropłytek przy 700 nm.

Test aktywności wychwytywania rodników DPPH

Analiza ekspresji białka metodą Western blot

Po traktowaniu różnymi stężeniami ECPS przez 72 godziny, komórki przemyto PBS i poddano lizie w buforze RIPA (150 mM NaCl w 50 mM pH 8.0 Tris-HCl , 0,5% dezoksycholanu sodu, 1,0% nondiet P-40 i 0,1% dodecylosiarczanu sodu). Po odwirowaniu w 10,000 g przez 25 min (4 stopnie), zebrano supernatant lizatów. Białka poddano 12% SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu. Blokowanie przeprowadzono w soli fizjologicznej buforowanej Tris z Tween{20}} i 2% odtłuszczonym mlekiem w proszku (TBST), a następnie inkubowano przez 12 godzin w 4 stopniach. Zastosowanymi przeciwciałami pierwotnymi były: anty-aktyna (1:5000), anty-TRP{28}} (1:500), anty-tyrozynaza (1:500) i anty-MITF (1:1000). Pierwszorzędowe przeciwciała usunięto, a membrany dwukrotnie przemyto TBST. Następnie błony z drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z peroksydazą chrzanową (Santa Cruz, USA) inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Prążki białkowe ponownie przemyto TBST i wizualizowano za pomocą zestawu ECL (Amersham Pharmacia Biotech, USA) przy użyciu systemu obrazowania UVP (UVP, USA).

Analiza statystyczna

Wszystkie wyniki podano jako średnie ± SD, a eksperymenty powtórzono trzykrotnie. Porównania między grupami oszacowano za pomocą ANOVA, a następnie testu Dunnetta. Pojedynczych porównań między dwiema grupami dokonano za pomocą testu t-Studenta. Wszystkie analizy statystyczne wykonano przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 16.{2}}). Po{3}},05 zwykle uznawano za statystycznie istotne.

Wyniki

Mw i suma polisacharydów ECPS i CPS

Całkowita zawartość polisacharydów w ECPS i CPS mierzona w teście fenolo-kwas siarkowy wynosiła odpowiednio 89,17 i 90,26%. Tymczasem Mw ECPS i CPS mierzono za pomocą SEC-MALLS-RI. Mw ECPS wynosiła 211,7 kDa, czyli mniej niż CPS (434,6 kDa). Figura 1A przedstawia względną intensywność (RI) dla ECPS i CPS; po hydrolizie enzymatycznej przez mannozę, czas retencji piku dla ECPS był dłuższy niż dla CPS. Jak pokazano na fig. 1B, różne frakcje wagowe polisacharydów przedstawiono jako funkcję masy molowej próbek. Rozkład masy molowej polisacharydów zmienił się znacząco w wyniku hydrolizy enzymatycznej. Zróżnicowana frakcja wagowa ECPS w regionie o niskiej Mw wzrosła, co sugerowało, że CPS został enzymatycznie zdegradowany do polisacharydu o niskiej Mw.

Działanie przeciwutleniające polisacharydów

Zdolność ECPS i CPS do wychwytywania wolnych rodników przez DPPH przedstawiono na rycinie 2A. Aktywność zmiatania wolnych rodników próbek polisacharydów i Vc wykazywała aktywność zależną od dawki. W obecnym badaniu zdolność CPS do usuwania wolnych rodników była niższa niż ECPS. Jednak obie wykazywały mniejszy efekt wychwytywania wolnych rodników niż próbka dodatnia. Wartości IC50 ECPS i CPS wynosiły odpowiednio 0,39 i 0,51 mg/ml. Jak pokazano na rycinie 2B, całkowitą aktywność przeciwutleniającą można ocenić, badając zdolność redukującą żelazo żelazowe. Stężenia wahały się od 0,1 do 1 mg/ml; zarówno próbki polisacharydu, jak i Vc wykazywały aktywność przeciwutleniającą w sposób zależny od dawki. Ponadto wartość absorbancji ECPS była zawsze wyższa niż CPS przy tym samym stężeniu.

Wpływ ECPS i CPS na aktywność tyrozynazy grzybów i żywotność komórek

Jak pokazano na fig. 2C, hamująca tyrozynazę aktywność polisacharydów (0.1B1 mg/ml) przedstawia zależność zależną od dawki. Co więcej, efekt hamujący ECPS był zawsze wyższy niż CPS przy tym samym stężeniu. Test MTT przeprowadzono w celu oceny efektów cytotoksycznych ECPS i CPS w komórkach czerniaka B16F10. Jak pokazano na Figurze 2D, nie było znaczących zmian w żywotności komórek B16F10 przy różnych stężeniach (0B320 mg/ml) ECPS i CPS. Na podstawie tych wyników zastosowaliśmy te zakresy stężeń w

Wpływ ECPS i CPS na aktywność tyrozynazy wewnątrzkomórkowej i zawartość melaniny

Wpływ ECPS na poziom tyrozynazy, MITF i białka TRP-1 w komórkach B16F10

Dyskusja

Naturalnym polisacharydom z C. chinensis zwrócono uwagę ze względu na ich dobry wpływ na hamowanie tyrozynazy, wychwytywanie wolnych rodników i ochronę skóry (25-27). Jednak niewiele badań koncentrowało się na aktywności antymelanogenezy enzymatycznej modyfikacji polisacharydów. Wcześniejsze badania wykazały, że polisacharydy zdegradowane w procesie hydrolizy enzymatycznej wykazywały lepsze działanie wychwytujące wolne rodniki (28). Ponadto aktywność biologiczna polisacharydów jest ściśle związana z ich rozkładem Mw. Teoretycznie polisacharydy o niskiej Mw są bardziej aktywne niż polisacharydy o wysokiej Mw ze względu na ich wysoką zdolność penetracji błon komórkowych (29,30). Jednak efekt antymelanogenezy ECPS na komórki B16F10 nie był jeszcze badany. Polisacharyd o niskiej Mw wytworzono przez hydrolizę enzymatyczną mannozą.