Projektowanie in silico nowatorskiej poliwalentnej, wielopodjednostkowej szczepionki peptydowej wykorzystującej odporność krzyżową przeciwko ludzkiej leiszmaniozie trzewnej i skórnej: podejście immunoinformatyczne

Abstrakcyjny

Kontekst Leiszmanioza to grupa chorób zakaźnych przenoszonych przez wektory, wywoływanych przez ponad 20 patogennych gatunków Leishmania, które występują endemicznie w wielu krajach tropikalnych i subtropikalnych. Pojawienie się szczepów lekoopornych, niekorzystne skutki uboczne leków przeciw Leishmania i brak strategii szczepień zapobiegawczych zagrażają wrażliwej populacji. Ostatnio wiele grup badaczy wykorzystało dziedzinę wakcynologii odwrotnej do opracowania szczepionek, koncentrując się głównie na wywoływaniu odporności na leiszmaniozę trzewną lub skórną.

cistanche tubulosa – działa przeciwzapalnie

MetodyNiniejsza praca polega na pobraniu dwunastu potwierdzonych eksperymentalnie sekwencji białek antygenowych leiszmanii z bazy danych UniProt, a następnie ich profilowaniu antygenowości przy użyciu serwerów ANTIGENpro i Vaxijen 2.0. Epitopy wiążące MHC dla tego samego przewidywano przy użyciu serwerów NetCTL 1.2 i SYFPEITHI, natomiast epitopy dla komórek B obliczono przy użyciu serwerów ABCpred i BepiPred 2.0. Przeszukane epitopy o znacznie wyższych wynikach wykorzystano do zaprojektowania konstruktu szczepionki z odpowiednimi łącznikami i naturalnymi adiuwantami. Struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe syntetycznego peptydu określono odpowiednio za pomocą warunkowych pól losowych, płytkich sieci neuronowych i dopasowania gwintów profil-profil za pomocą iteracyjnych symulacji składania struktur. Model szczepionki 3-D został zweryfikowany poprzez udoskonalenie10-testowane przez CASP i serwer internetowy MolProbity. Aby przeanalizować najlepszy kompleks szczepionka-TLR, przeprowadzono symulację dokowania molekularnego i wieloskalową analizę w trybie normalnym. Wreszcie wyniki obliczeniowej symulacji immunologicznej ujawniły obiecujące komórkowe i humoralne odpowiedzi immunologiczne, co sugeruje, że zmodyfikowany chimeryczny peptyd jest potencjalną szczepionką o szerokim spektrum działania przeciwko leiszmaniozie trzewnej i skórnej.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Słowa kluczowe Leiszmanioza · Wakcynologia odwrotna · TLR · Szczepionka wieloepitopowa · Symulacja dynamiki molekularnej · Modelowanie homologii

Wstęp

Leiszmanioza to grupa chorób pasożytniczych wywoływanych przez różnych przedstawicieli rodzaju Leishmania, dymorficznego wewnątrzkomórkowego pierwotniaka pasożytniczego [1]. Leiszmanioza dotyka większość populacji z krajów o niskim statusie społeczno-ekonomicznym w krajach tropikalnych i subtropikalnych na całym świecie [2]. Jest to choroba przenoszona przez wektory, a pasożyty są przenoszone przez ugryzienie zakażonych samic flebotominy piaskowej (WHO, 2019). Według najnowszych raportów Światowej Organizacji Zdrowia co roku odnotowuje się od 700, 000 do 1 miliona nowych przypadków i około 26,000 do 65, 000 zgonów (WHO, 2019). W Afryce Wschodniej często występują ogniska leiszmaniozy trzewnej. We wschodnim regionie Morza Śródziemnego występuje 70% przypadków leiszmaniozy skórnej na całym świecie (WHO, 2019). W 2017 r. 20 792 z 22 145 (94%) nowych przypadków zgłoszonych do WHO miało miejsce w siedmiu krajach: Brazylii, Etiopii, Indiach, Kenii, Somalii, Sudanie Południowym i Sudanie (WHO, 2017). Ze względu na niepokojący scenariusz należy podkreślić także w naszym kraju działania mające na celu kontrolę i zwalczanie choroby. Leiszmanioza ma różnorodne objawy kliniczne i istnieją trzy główne postacie tej choroby – trzewna (znana również jako kala-azar i najcięższa postać choroby), skórna (najczęściej) i śluzówkowo-skórna (WHO, 2019). . Dowody na samoleczenie w kilku przypadkach leiszmaniozy skórnej (CL) i wynikającą z nich odporność na ponowne zakażenie pozwalają na ustalenie możliwego zakresu szczepień jako wykonalnej metody zwalczania leiszmaniozy w tym okresie [3]. Jednakże do chwili obecnej nie jest dostępna żadna zarejestrowana szczepionka przeciwko leiszmaniozie u ludzi. Chociaż kilka potencjalnych szczepionek-kandydatów przeszło do badań klinicznych, wiele z nich nadal znajduje się we wczesnej fazie badań i rozwoju [4]. Wytwarzanie szczepionek peptydowych jest dominującym i obiecującym obszarem badań w tej dziedzinie. W przeciwieństwie do całych żywych lub atenuowanych pasożytów lub szczepionek opartych na ich podjednostkach, syntetyczne peptydy mają kilka zalet, które obejmują brak potencjalnie szkodliwych materiałów, mniejszą złożoność antygenu, dobrą stabilność i niski koszt zwiększenia skali [1, 5]. Opracowywanie nowych szczepionek wymaga głębszego wglądu w immunologię, biologię molekularną i inżynierię chemiczną. Dlatego naukowcy ze wszystkich tych dziedzin współpracują nad projektowaniem i produkcją bezpiecznych i skutecznych szczepionek [6]. Idealna szczepionka przeciwko leiszmaniozie powinna wywoływać długotrwałą odporność i zrównoważoną odpowiedź immunologiczną zależną od TH-1 i TH-2- [4, 7]. Podejście immunoinformatyczne do projektowania takiej nowatorskiej szczepionki-kandydata to nowsza strategia, która wykorzystuje przede wszystkim narzędzia obliczeniowe do przewidywania w krótkim czasie strukturalnie stabilnej i immunogennej szczepionki peptydowej składającej się z wielu podjednostek. Najlepszymi możliwymi kandydatami na epitopy były białka, w przypadku których we wcześniejszych badaniach immunologicznych z udziałem eksperymentalnych modeli zwierzęcych lub innych analizach in silico stwierdzono przede wszystkim właściwości immunogenne niezbędne do nadania odporności na tę chorobę [1, 8–10]. Wśród badanych białek białko LACK (antygen kinazy C aktywowany przez Leishmania) jest wysoce konserwatywnym białkiem u gatunków Leishmania i jest uważane za realnego kandydata na szczepionkę przeciwko ludzkiej leiszmaniozie [11]. Udowodniono, że jest to kluczowy cel odpowiedzi immunologicznej u wrażliwych myszy BAL b/c [12]. KMP-11 (białko błony kinetoplastydowej-11) jest obecne we wszystkich pierwotniakach kinetoplastydowych i jest również uważane za potencjalnego kandydata na szczepionkę, która, jak wykazano, zwiększa poziom IL-10 w modelach mysich, co wskazuje na jej potencjał immunogenny [13]. Leiszmanolizyna, czyli GP63, jest proteinazą powierzchniową, postulowaną jako czynnik zjadliwości zaangażowany w bezpośrednią interakcję pasożyta z receptorem makrofaga gospodarza [14]. Stwierdzono również, że białka błonowe LCR1 i GP46 zwiększają wytwarzanie IFN-gamma i dlatego uważa się je za pomocne w opracowaniu ogólnej szczepionki przeciwko infekcjom Leishmania [5, 15]. Białka szoku cieplnego (HSP) to wysoce konserwatywne cząsteczki, które są wysoce immunogenne w indukowaniu szlaków odporności nabytej zarówno MHC-I, jak i MHCII i uważa się, że odgrywają istotną rolę w opracowywaniu szczepionki przeciwko leiszmaniozie zakaźnej [16]. Hydrofilowe acylowane białko powierzchniowe B Leishmania (HASP-B) ulega ekspresji jedynie w zakaźnych pasożytach, co sugeruje rolę w zjadliwości pasożyta i dlatego jest potencjalnym kandydatem na szczepionkę [17]. Białka Kinetoplastid Parafagellar Rod (PFR) mają również znaczenie terapeutyczne i profilaktyczne ze względu na ich ograniczoną dystrybucję ewolucyjną, organizację wyższego rzędu i wysoką immunogenność [18]. Podobnie proteazy cysteinowe i proteofosfoglikany działają również jako podstawowe czynniki zjadliwości pasożytów u ssaków-żywicieli i są atrakcyjnymi celami leków w przypadku leiszmaniozy [19–21]. Co więcej, białko beta-tubuliny również zostało wcześniej scharakteryzowane jako antygen stymulujący komórki T z Leishmania, chociaż jego skuteczność jako kandydata na szczepionkę nie została jeszcze wypróbowana [22]. Beta-tubulina L. donovani jest również uważana za potencjalny cel leku przeciwko leiszmaniozie trzewnej [23]. Wreszcie, wykazano, że białko czynnika translacji eIF5A z L. braziliensis indukuje heterologiczną ochronę przed leiszmaniozą u zwierząt, gdy jest podawane jako szczepionka w połączeniu z innym rekombinowanym białkiem. Zwiększa wydzielanie cytokin specyficznych dla pasożyta u zaszczepionych zwierząt. Białko eIF5A jest również konserwatywne u wszystkich eukariontów [24]. Wcześniej Khatoon i in. opisali immunoinformatyczne podejście do projektowania wielopodjednostkowej szczepionki peptydowej przeciwko leiszmaniozie trzewnej (VL) poprzez badanie białek wydzielniczych L. donovani [6]. Tutaj wybraliśmy różne antygeny leiszmanii u różnych zakaźnych gatunków pasożyta. Jednocześnie zidentyfikowano już wszystkie te białka (w badaniach in vitro na zwierzętach lub przy użyciu narzędzi obliczeniowych), które wywołują odpowiedź immunologiczną, wywołując odporność ochronną. Wybrane sekwencje białkowe należały do ​​któregokolwiek z pięciu patogennych gatunków Leishmania, mianowicie Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi i Leishmania amazonki, wśród których L. donovani jest głównym pasożytem wywołującym leiszmaniozę trzewną (VL), natomiast pozostałe są głównie odpowiedzialne za wywoływanie leiszmaniozy skórnej (CL) lub śluzówkowo-skórnej (MCL). Uzasadnieniem wyboru tak różnorodnych typów konserwatywnych i immunogennych białek dla różnych gatunków Leishmania było zaprojektowanie ogólnej szczepionki peptydowej, która zapewniałaby odporność krzyżową o szerokim spektrum działania przeciwko obu formom leiszmaniozy (VL i CL), które powszechnie atakują ludzi .

Co robi ziele cistanche — Anti-zapalny

Materiały i metody

Selekcja i odzyskiwanie sekwencji białek antygenowych Leishmania

Kompletne sekwencje aminokwasowe dwunastu białek antygenowych specyficznych dla Leishmania pobrano z bazy danych Uniprot (Universal Protein Resource) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) w formacie FASTA (dostęp: 21.{{16} }3.2022). Jak stwierdzono wcześniej, wszystkie te białka zgłoszono jako immunogenne, wysoce konserwatywne i potencjalne kandydaci na szczepionki, jak stwierdzono w poprzednich badaniach immunologicznych z udziałem modeli zwierzęcych lub obliczeniowych metod przewidywania in silico. Antygenowość wybranych białek obliczono przy użyciu serwera ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/), który oblicza antygenowość wejściowej sekwencji białka, wykorzystując dwustopniowy klasyfikator oparty na SVM, zweryfikowany dziesięciokrotnie podejście oparte na walidacji krzyżowej [25]. Białka poddano następnie analizie peptydów sygnałowych przy użyciu serwera SignalP 4.1 (SignalP — 4.1 — Services — DTU Health Tech) w celu rozróżnienia pomiędzy klasycznymi białkami wydzielniczymi i niewydzielniczymi (przezbłonowymi). Metoda ta obejmuje przewidywanie miejsc rozszczepienia oraz przewidywanie peptydu sygnałowego/peptydu niesygnałowego w oparciu o kombinację kilku sztucznych sieci neuronowych [26]. Następnie przeprowadzono prognozy lokalizacji dla wszystkich białek przy użyciu DeepLoc (DeepLoc – 1.0 – Services – DTU Health Tech), algorytmu bez szablonów, który wykorzystuje głębokie sieci neuronowe do przewidywania lokalizacji subkomórkowej białek z wykorzystaniem jedynie informacji o sekwencji, uzyskując dobrą dokładność [27]. Wszystkie funkcjonalne sekwencje białek, otrzymane z serwera SignalP 4.1, poddano następnie badaniu w celu przewidzenia obecności determinantów antygenowych (epitopów), które będą rozpoznawane przez receptory komórek B i T. Dokonano tego, aby mieć pewność, że zaprojektowany konstrukt szczepionki zawiera wyłącznie epitopy komórek T i B dominujących w układzie odpornościowym, a zatem będzie w stanie wywołać skuteczną odpowiedź immunologiczną obejmującą zarówno humoralne, jak i komórkowe szlaki mechanizmów odpornościowych.

Przewidywanie epitopów cytotoksycznych limfocytów T (CTL).

Przewidywanie epitopu cytotoksycznego limfocytu T (CTL) jest istotnym aspektem projektowania idealnego peptydu [28]. Do przewidywania epitopów CTL dla wszystkich wybranych białek wykorzystano ogólnodostępny serwer sieciowy, mianowicie NetCTL1.2 (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL). Metoda integruje przewidywanie wiązania peptydu MHC klasy I, rozszczepienia terminala C w proteasomach i wydajności transportu TAP [29], a wszystkie te czynniki są podstawowymi cechami, jakie powinna posiadać sekwencja epitopu wiążącego CTL. Serwer umożliwia przewidywanie epitopów CTL ograniczonych do 12 nadtypów MHC klasy I, spośród których w niniejszym badaniu wykorzystano tylko nadtyp A1. Wiązanie MHC klasy I i cięcie proteasomów przeprowadza się przy użyciu sztucznych sieci neuronowych. Efektywność transportu TAP prognozuje się za pomocą macierzy wag [29]. Sekwencje o wyższych wynikach wiązania uważa się za silne epitopy CTL. Oprócz NetCTL 1.2, do przewidywania epitopów CTL z wszystkie wybrane białka Leishmania. Prognoza opiera się na opublikowanych motywach i uwzględnia aminokwasy w pozycjach kotwicy i pomocniczych oraz inne częste aminokwasy [30]. Z listy typów MHC udostępnionej na tym serwerze do przewidywania wybrano HLA-A*01, HLA-A*02:01 i HLA-A*03. Wyszukiwanie epitopów określono dla sekwencji nonamerowych w celu jednolitego porównania z wynikami podanymi przez serwer NetCTL 1.2. Do ostatecznego konstruktu szczepionki wybrano tylko wspólne epitopy z każdego białka (jeśli występują), które zostały przewidziane zarówno przez serwery NetCTL 1.2, jak i SYFPEITHI z kompatybilnymi wyższymi wynikami.

Przewidywanie epitopu limfocytu pomocniczego T (HTL).

Limfocyty T pomocnicze są najważniejszymi komórkami odpornościowymi, ponieważ są wymagane we wszystkich typach nabytych odpowiedzi immunologicznych. Przewidywanie epitopów HTL (głównie typu Th-1) staje się zatem istotnym elementem projektowania skutecznej szczepionki peptydowej. W bieżącym badaniu do przewidywania 15-meru HTL wykorzystano narzędzie do analizy wiązania MHC-II na serwerze IEDB (Immuno Epitope Datan Base and Analysis) (http://tools.iedb.org/mhcii/). epitopy dla zestawu trzech ludzkich alleli, mianowicie HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 i HLA-DRB1*01:03. Ludzkie allele HLA wybrano w celu bardziej realistycznego oszacowania powinowactwa wiązania MHC-II epitopów podczas projektowania szczepionki przeciwko ludzkiej leiszmaniozie. Przewidywany wynik podano w jednostkach IC50nM dla biblioteki kombinatorycznej i dopasowania SMM. Dlatego niższa liczba wskazuje na wyższe powinowactwo. W tym podejściu zastosowano metodę przewidywania zalecaną przez IEDB, w której niska skorygowana ranga wskazuje na odpowiednie środki wiążące MHC-II i dlatego można ją zdefiniować jako silne epitopy HTL.

Identyfikacja i selekcja epitopów HT indukujących cytokiny

Cytokiny mają ogromne znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania układu odpornościowego. Zestaw cytokin, takich jak IL-2, IL-4, IL-6 i interferon, może indukować zarówno odpowiedź immunologiczną zależną od CTL, jak i humoralną [31]. Zatem epitopy HTL, które mogą wyzwalać wytwarzanie cytokin, są preferowane do projektowania szczepionki immunoprofilaktycznej. W tym ujęciu serwer IFNepitope (http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/) wykorzystano do identyfikacji epitopów HTL mających zdolności indukowania cytokin. IFNepitope to internetowy serwer prognostyczny, którego celem jest przewidywanie peptydów na podstawie sekwencji białkowych, które mogą indukować IFN-gamma uwalniany z limfocytów T CD4+. Serwer WWW został opracowany na podstawie zbioru danych obejmującego indukujące i nieindukujące IFN-gamma wiązania MHC klasy II [32]. Epitopy HTL przewidywane przez serwer IEDB z wyższymi powinowactwami wiązania MHC-II (niższe dostosowane rangi) dostarczono jako dane wejściowe do sprawdzenia ich zdolności do wytwarzania cytokin przez serwer IFNepitope. Tak zidentyfikowane epitopy poddano następnie kolejnemu poziomowi analizy przez serwer IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in), a także przez serwer IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3 .php), aby mieć pewność, że wybrane epitopy HTL będą również wywoływać wydzielanie odpowiednio IL-4 i IL-10. Uwzględniają one także konserwację pozycyjną reszt aminokwasowych i skład aminokwasowy peptydy w celu dokładniejszego przewidywania. [33, 34]. Epitopy HTL wiążące MHC-II, które zgodnie z przewidywaniami wszystkich trzech serwerów miały być pozytywne, wybrano do włączenia do ostatecznego konstruktu szczepionki. Strategię tę przyjęto w celu poprawy skuteczności szczepionki, ponieważ mogła ona wywołać intensywna odpowiedź obejmująca szeroką gamę cytokin (IFN-gamma, IL-4 i IL-10), prowadząca do przyspieszonej i długotrwałej odporności.

Analiza zachowania epitopów

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (domyślnie).

Projektowanie sekwencji szczepionek wieloepitopowych

W oparciu o analizę immunoinformatyczną skonstruowano pierwotną sekwencję szczepionki podjednostkowej poprzez włączenie wybranych sekwencji epitopów CTL i HTL. Epitopy te połączono ze sobą odpowiednio łącznikami AAY i GPGPG [28, 31]. Linkery wprowadza się w celu prawidłowego oddzielenia poszczególnych epitopów, które są wymagane do skutecznego funkcjonowania konstruktu szczepionki [28, 36]. Po drugie, dodanie odpowiedniego adiuwanta ma kluczowe znaczenie w szczepionce podjednostkowej w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej [31]. Wybór odpowiedniego adiuwanta ma kluczowe znaczenie przy projektowaniu szczepionek do badań na ludziach. IL-12 wytwarzana przez różne komórki układu odpornościowego jest niezbędna w rozwijaniu odporności komórkowej przeciwko leiszmaniozie, a potencjał IL-12 jako adiuwanta w szczepionkach przeciwko leiszmaniozie opisano w modelach mysich [3, 37, 38]. Tę IL-12 wybrano jako adiuwant do zaprojektowania szczepionki, a jej sekwencję włączono na końcu N konstruktu szczepionki przy użyciu łącznika EAAK [28, 31]. Sekwencję łańcucha alfa ludzkiej IL-12 pobrano z bazy danych Uniprot (www.uniprot.org; nr dostępu P29459). Na koniec otrzymano konstrukt szczepionki peptydowej zawierający adiuwant, łącznik, epitopy CTL i epitopy HTL (z wewnątrzepitopowymi łącznikami AAY i GPGPG) w sekwencji przechodzącej od N-końca do C-końca.

Przewidywanie konformacyjne i liniowe epitopów komórek B

Odporność humoralna polega na syntezie i wydzielaniu swoistych przeciwciał przez aktywowane limfocyty B, co wymaga obecności determinant antygenowych rozpoznawanych przez receptory limfocytów B obecne na powierzchni limfocytów B. Idealna szczepionka peptydowa o działaniu ochronnym powinna zawierać takie składniki, aby wchodzić w interakcję z limfocytami B i w ten sposób je stymulować. Dlatego też do precyzyjnego przewidywania epitopów komórek B w sekwencji pierwszorzędowej zaprojektowanej szczepionki zastosowano dwa serwery, mianowicie ABCpred i BepiPred 2.0. Serwer ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html) to podejście oparte na sztucznej sieci neuronowej (ANN), które przewiduje epitopy komórek B w danej sekwencji antygenu za pomocą stałe parametry długości. Zestaw danych szkoleniowych stosowany w tej metodzie zawiera epitopy komórek B z bazy danych epitopów komórek B (BCIPEP). Serwer jest w stanie przewidzieć epitopy z dokładnością 65,93% przy użyciu rekurencyjnej sieci neuronowej [39]. Podstawową sekwencję końcowego konstruktu szczepionki dostarczono jako dane wejściowe w prostym formacie, a do wykonania wykorzystano domyślne parametry serwera ABCpred, w tym wartość progową 0,51 z oknem o długości 16 reszt aminokwasowych. przepowiednia. Z drugiej strony serwer BepiPred 2.0 (BepiPred — 2.0 — Services — DTU Health Tech) przewiduje sekwencyjne epitopy komórek B na podstawie sekwencji wejściowej za pomocą algorytmu losowego lasu wyszkolonego na epitopach i aminokwasy nieepitopowe określone na podstawie struktur krystalicznych, po których następuje sekwencyjne wygładzanie predykcyjne [40]. Jako dane wejściowe podano pierwotną sekwencję szczepionki w formacie FASTA. Zastosowanie dwóch różnych serwerów, które przewidują epitopy komórek B w oparciu o dwa różne algorytmy, czyni przewidywanie bardziej realistycznym. Większość determinant antygenowych rozpoznawanych przez receptor komórek B i przeciwciała ma charakter nieciągły, co oznacza, że ​​zawierają reszty aminokwasowe zlokalizowane odlegle w strukturze pierwszorzędowej immunogenu, ale zbliżają się do siebie podczas fałdowania białka [41]. Przewidywania takich nieciągłych epitopów komórek B w zweryfikowanej trzeciorzędowej strukturze szczepionki przeprowadzono przy użyciu serwera ElliPro (http://tools.iedb.org/ellip ro/) włączonego do portalu IEDB. ElliPro to ogólnodostępne narzędzie internetowe, które implementuje zmodyfikowaną metodę Throntona i uwzględnia środek masy każdej reszty, a nie atomy C. W ten sposób każdy z epitopów zostaje przypisany do przypisanej punktacji zdefiniowanej jako PI (wskaźnik protruzji) uśredniony względem reszt epitopu. Nieciągłe epitopy określa się w oparciu o ich odpowiednie wartości PI i grupuje w oparciu o odległość pomiędzy środkami masy reszt (R). Większe wartości R korelują z przewidywaniem większej liczby znaczących nieciągłych epitopów [42]. Jednocześnie za pomocą ElliPro można również przewidzieć i wizualizować liniowe epitopy komórek B w modelu białka wejściowego. Wykrywanie zarówno liniowych, jak i nieciągłych epitopów komórek B w udoskonalonym modelu 3D szczepionki zapewnia skuteczną strategię projektowania szczepionki.

Profilowanie antygenowości, alergenności i toksyczności konstruktu szczepionki

Antygenowość jest zasadniczym kryterium szczepionki immunoprofilaktycznej. Aby mieć pewność, że zaprojektowany konstrukt szczepionki wywoła długotrwałą odpowiedź immunologiczną poprzez interakcję z receptorami komórek B i T, oceniono jej antygenowość przy użyciu serwerów ANTIGENpro i VaxiJen 2.0. Serwer ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) poprawnie klasyfikuje 82% znanych antygenów ochronnych po przeszkoleniu przy użyciu wyłącznie zbiorów danych z mikromacierzy białkowej. Dokładność połączonego zbioru danych szacuje się na 76% na podstawie dziesięciokrotnych eksperymentów z walidacją krzyżową, które umożliwiają znacznie lepsze rozpoznawanie peptydów antygenowych. Działa w oparciu o architekturę dwustopniową, obejmującą klasyfikator drugiego stopnia oparty na SVM. W przypadku nowej wejściowej sekwencji białka prawdopodobieństwo obliczone przez predyktor SVM drugiego etapu jest ostatecznym wynikiem przewidywania ANTIGENpro [25]. VaxiJen2.0 (http://www.dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) to kolejny publicznie dostępny serwer internetowy, który ocenia antygenowość sekwencji białkowej metodą bez dopasowania, opartą na na transformacji auto-kowariancji krzyżowej (ACC) sekwencji białek w jednolite wektory o głównych właściwościach aminokwasów i umożliwia klasyfikację antygenów wyłącznie w oparciu o różne właściwości fizykochemiczne białka, bez odwoływania się do dopasowania sekwencji [43]. Po drugie, aby wykluczyć jakąkolwiek możliwość, że konstrukt szczepionki może wywołać reakcję alergiczną u danej osoby, wykorzystano serwer AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) do określić jego alergenność. Narzędzie serwerowe zapewnia różnorodne podejścia, w tym mapowanie epitopów IgE, motyw MEME/MAST, metodę SVM opartą na składzie dipeptydów i BLAST ARP, z których wszystkie są wykorzystywane do dokładnego przewidywania. Próg ustawiono na 0,4 (domyślnie), aby zapewnić większą precyzję przewidywania. Dodatkowo zastosowano AllerTop v.2.{{20}} (https://www.dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), ogólnodostępne narzędzie oparte na serwerze WWW w celu potwierdzenia niealergicznego charakteru konstruktu szczepionki. Metoda ta opiera się na transformacji autokowariancji (ACC) sekwencji białkowych w jednolite wektory o równej długości. Zastosowano ją do ilościowych badań zależności struktura-aktywność (QSAR) peptydów o różnej długości, a białka są klasyfikowane za pomocą algorytmu k-najbliższego sąsiada [44]. Ewentualną toksyczność przewidywano przy użyciu serwera ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). To narzędzie przewidywania działa w oparciu zarówno o technikę uczenia maszynowego, jak i metodę ilościową, która jest szkolona na zestawie danych różnych toksycznych i nietoksycznych peptydów uzyskanych od SwissProt i TrEMBL [45]. Profilowanie toksyczności ma kluczowe znaczenie dla oceny bezpieczeństwa szczepionki i innych peptydów immunoterapeutycznych przeznaczonych do badań na ludziach. Analizę przeprowadzono, wybierając podejście oparte na SVM (TrEMBL) + motyw przy progu wartości E wynoszącym 10,0 dla metody opartej na motywie i progu SVM wynoszącym 0,1.

Ocena właściwości fizykochemicznych

Opisanie cech fizycznych i chemicznych peptydu chimerycznego staje się istotne, ponieważ podawany jako szczepionka powinien być w stanie wywołać właściwą odpowiedź immunologiczną. Serwer ProtParam dostępny w portalu ExPASY (Expert Protein Analysis System) (https://web.expasy.org/program/) został wykorzystany do obliczenia różnych parametrów fizykochemicznych pierwotnego konstruktu szczepionki, które obejmowały takie cechy, jak masa cząsteczkowa, teoretyczne pI, wskaźnik niestabilności, indeks alifatyczny, okres półtrwania in vivo i in vitro, wielka średnia hydrofobowości (GRAVY) i inne.

Przewidywanie struktury wtórnej peptydu szczepionkowego

Drugorzędne elementy strukturalne zaprojektowanego konstruktu szczepionki przewidywano, stosując serwer PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) i serwer właściwości RaptorX (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ przewidywać/), z których oba są ogólnodostępnymi serwerami analizy struktury białek online. Jako dane wejściowe podano pierwotną sekwencję peptydu szczepionkowego. PSIPRED przewiduje drugorzędową strukturę wejściowej sekwencji białka, wykorzystując dwie sieci neuronowe ze sprzężeniem zwrotnym, które działają w oparciu o macierze punktacji specyficzne dla pozycji (PSSM) generowane przez PSI-BLAST [46]. Obejmuje identyfikację sekwencji homologicznych do naszego konstruktu szczepionki za pomocą PSI-BLAST, a następnie wygenerowanie PSSM. Stwierdzono, że wersja PSIPRED 3.2 i nowsze uzyskały średni wynik w trzecim kwartale wynoszący 81,6%, jak oceniono za pomocą rygorystycznej metody trzykrotnej walidacji krzyżowej, co czyni to podejście znacznie precyzyjnym i dokładnym. Serwer WWW RaptorX wykorzystuje najnowszą technikę uczenia maszynowego zwaną DeepCNF (głębokie splotowe pola neuronowe) do jednoczesnego przewidywania różnych cech, takich jak struktura drugorzędowa, dostępność rozpuszczalnika i nieuporządkowane obszary. DeepCNF to zintegrowane podejście łączące zarówno warunkowe pola losowe (CRF), jak i płytkie sieci neuronowe, które modeluje złożone relacje sekwencja-struktura za pomocą głębokiej architektury hierarchicznej i może uzyskać około 84% dokładności Q3 dla struktury drugorzędnej klasy 3- [47] .

Przewidywanie struktury trzeciorzędowej

Trzeciorzędową strukturę końcowego peptydu szczepionkowego przewidywano przy użyciu internetowego serwera internetowego I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER to podejście do hierarchicznego modelowania struktury białek oparte na dopasowaniu gwintu profil-profil (PPA) i iteracyjnych symulacjach składania struktury, a następnie udoskonalaniu struktury na poziomie atomowym. Działa w trzech etapach: identyfikacja szablonu konstrukcyjnego, iteracyjny montaż struktury i adnotacja funkcji oparta na strukturze. Najwyżej ocenione modele konstrukcji z globalnymi i lokalnymi szacunkami dokładności są zwracane z ich reprezentatywnymi wynikami C i TM, które są skorelowane z jakością przewidywanego modelu. Program I-TASSER stanowi jedną z najskuteczniejszych metod zademonstrowanych w CASP do automatycznego przewidywania struktury i funkcji białek [48, 49].

Udoskonalenie trzeciorzędowej struktury szczepionki

Samo konwencjonalne modelowanie obliczeniowe struktury białka nie gwarantuje autentyczności i dokładności przewidywanego modelu, ponieważ takie strategie modelowania w dużej mierze zależą od stopnia prawdopodobieństwa danych wejściowych (celu) z dostępnymi strukturami szablonowymi. Uznano zatem, że konieczne jest podniesienie jakości modelu opartego na matrycy poza dokładność, a można to osiągnąć poprzez udoskonalenie całej struktury białka. Z tej perspektywy trójwymiarowy model wyjściowy z serwera I-TASSER z najlepszym wynikiem C został poddany dalszemu udoskonalaniu przez serwer GalaxyRefne (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} DOKONAJ). Jest to metoda udoskonalania sprawdzona przez CASP10-, w której najpierw odbudowuje się łańcuchy boczne białek, a następnie przepakowywanie łańcuchów bocznych i ogólną relaksację struktury przeprowadza się za pomocą symulacji dynamiki molekularnej. Prowadzi to do precyzyjnej poprawy zarówno lokalnych, jak i globalnych struktur trzeciorzędowych białek docelowych [50].

Korzyści z suplementu Cistanche — Anti-zapalny

Walidacja trzeciorzędowej struktury szczepionki

Należało zweryfikować udoskonaloną trzeciorzędową strukturę szczepionki, aby wykryć potencjalne błędy, które mogą wystąpić w przewidywanym modelu 3D. Jako strukturę wejściową w formacie a.pdb dostarczono dopracowany model uzyskany z serwera GalaxyRefne. Poza tym wykres Ramachandrana jest kolejnym bardzo użytecznym podejściem do wizualizacji energetycznie dozwolonych i zabronionych obszarów kątów dwuściennych phi (ϕ) i psi (ψ) łańcuchów bocznych aminokwasów, które są uważane za kluczowe elementy do walidacji struktury białka. Dlatego też wykorzystano serwer MolProbity [Strona główna – MolProbity (duke.edu)], który wygenerował wykres Ramachandrana dla danego modelu szczepionki w oparciu o walidację Phenix w stylu MolProbity w języku Python [51]. Następnie wykorzystaliśmy serwer ERRAT [SAVESv6.0 — Structure Validation Server (UCLA.edu)], który analizuje statystyki niezwiązanych interakcji między różnymi atomami w modelu i wykreśla wartość funkcji błędu w funkcji {{ 6}}pozostałości przesuwają się [52]. Wykorzystano w tym celu serwer WWW ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), interaktywną platformę internetową opartą na standardowym programie ProSA [53]. Ten etap przeprowadzono w celu uzyskania bardziej wyrafinowanej i precyzyjnej walidacji modelowanej struktury.

Inżynieria dwusiarczkowa peptydu szczepionkowego

Wiązania dwusiarczkowe przyczyniają się do stabilności białka poprzez obniżenie entropii konformacyjnej, a także zwiększenie energii swobodnej stanu zdenaturowanego. Wprowadzenie nowych wiązań dwusiarczkowych uznano za kluczowe narzędzie biotechnologiczne poprawiające termostabilność natywnych, sfałdowanych białek. Serwer Disulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12 zastosowano w celu zwiększenia ogólnej stabilności strukturalnej zaprojektowanej szczepionki poprzez wprowadzenie wiązań dwusiarczkowych. Metoda ta wykorzystuje natywną geometrię i oblicza wartość energii dla każdego potencjalnego disiarczku, zapewniając w ten sposób sposób na uszeregowanie potencjalnych wiązań disiarczkowych. Wiązania dwusiarczkowe, które zapewniają maksymalną stabilność, były kandydatami o wysokiej wartości chi3, energii wiązania i współczynniku B [54]. Elastyczne regiony peptydu wybrano w oparciu o wspomniane wcześniej parametry i utworzono odpowiednie mutacje stabilizujące poprzez utworzenie wiązań dwusiarczkowych pomiędzy wybranymi parami reszt.

Molekularne dokowanie konstruktu szczepionki z receptorami immunologicznymi (ludzkie TLR‑2, 4, 5, 8 i mysi TLR‑9)

Receptory Toll-podobne (TLR) to główne cechy komórkowej odpowiedzi immunologicznej, które rozpoznają wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) i wywołują wrodzoną odpowiedź immunologiczną przeciwko infekcjom. Później doniesiono o bezpośredniej aktywacji TLR-2 przez składniki Leishmania [55]. W innych powiązanych badaniach eksperymentalnych brak TLR-4 skutkował zwiększonym rozwojem pasożytów i opóźnionym gojeniem zmian skórnych spowodowanych infekcjami L. major, co wskazuje na prawdopodobną rolę TLR-4 w wywoływaniu odporności przeciwko Leishmania [56 ] Z drugiej strony stwierdzono, że TLR-2, 4 i 9 biorą udział w spektrum immunopatologicznym CL wywoływanego przez L. braziliensis i L. amazonensis [57]. Oceniono także TLR-9 jako kluczowy czynnik aktywacji komórek dendrytycznych w patogenezie VL u ludzi [58]. W większości badań przeprowadzonych w tej dziedzinie wykazano, że niektóre składniki pochodzące z Leishmania aktywują TLR-2, 4 i 9. Obserwacje te podkreślają fakt, że różne receptory TLR biorą udział w wywoływaniu odporności ochronnej przeciwko Leishmania. Dlatego też uznano, że interakcja pomiędzy receptorami TLR a zaprojektowanym konstruktem szczepionki jest konieczna do uzyskania skutecznej odporności na zakażenia Leishmania. Sprawdzono to poprzez dokowanie molekularne wieloepitopowego peptydu szczepionkowego z ludzkimi TLR-2, 4, 5, 8 i mysim TLR-9 przy użyciu serwera PatchDock [PatchDock Server (tau.ac.il )]. Algorytm PatchDock składa się z trzech głównych etapów, a mianowicie reprezentacji kształtu molekularnego, dopasowywania plam powierzchniowych oraz filtrowania i oceniania. Jest to algorytm dokowania molekularnego oparty na geometrii, który działa głównie na zasadzie komplementarności kształtów molekularnych pomiędzy receptorem i ligandem. Dopasowuje się poprawki uzupełniające i generowane są potencjalne transformacje. Każda z tych transformacji jest dalej klasyfikowana poprzez przypisanie funkcji punktacji, która uwzględnia zarówno energię atomową desolwatacji, jak i ft geometryczny [59, 60]. W naszym badaniu ludzki TLR-2 (identyfikator PDB: 6NIG), TLR-4 (identyfikator PDB: 4G8A), TLR-5 (identyfikator PDB: 3J0A), i TLR-8 (identyfikator PDB: 4QC0) i mysi TLR-9 (identyfikator PDB: 3WPF) wybrano jako receptory, a ich oddzielne pliki PDB pobrano z Protein DataBank (www .rcsb.org). Udoskonalony model 3D peptydu szczepionkowego wykorzystano jako ligand we wszystkich symulacjach dokowania. Serwer PatchDock miał ustawione parametry domyślne (klastrowanie RMSD: 4.0). Następnie przeanalizowaliśmy najlepszy model dokowania przy użyciu serwera Cluspro w oparciu o możliwy algorytm rotacji wiązań, a wiązania oceniano za pomocą oprogramowania PyMOL [61].

Optymalizacja kodonów, przewidywanie struktury mRNA i klonowanie in silico w celu ekspresji białka szczepionki

Optymalizacja kodonu jest wymagana, aby osiągnąć maksymalną ekspresję obcych genów w organizmie gospodarza, gdy wykorzystanie kodonu przez gospodarza różni się znacząco od tego u gospodarza natywnego, z którego wyselekcjonowano oryginalne sekwencje ostatecznego konstruktu szczepionki. Do translacji odwrotnej i optymalizacji kodonów wykorzystano narzędzie JCat (Java Codon Adaptation Tool), dostępne publicznie pod adresem (http://www.jcat.de/), poprzez dostarczenie jako danych wejściowych sekwencji pierwszorzędowej końcowego konstruktu szczepionki. Użycie kodonów zoptymalizowano pod kątem najbardziej sekwencjonowanego organizmu prokariotycznego, E. coli K12 [6]. Wybrano trzy dodatkowe opcje udostępniane przez narzędzie, aby uniknąć niezależnych od rho terminatorów transkrypcji, prokariotycznych miejsc wiązania rybosomów i niepożądanych miejsc rozszczepiania restrykcyjnego. Wskaźnik adaptacji kodonów (CAI) i zawartość GC obliczone za pomocą narzędzia JCat wskazują, jak dobra była optymalizacja. Lepsza optymalizacja zapewnia wyższą ekspresję białka szczepionki. Ponadto, miejsca restrykcyjne dla enzymów XhoI i NdeI włączono do zoptymalizowanej sekwencji cDNA dostarczonej przez narzędzie JCat w celu ułatwienia klonowania. Zmodyfikowaną sekwencję (z miejscami restrykcyjnymi) wstawiono następnie do wektora plazmidowego pET 28-a(+) E. coli przy użyciu modułu do klonowania restrykcyjnego narzędzia SnapGene [6, 31, 62, 63]. Oprogramowanie SnapGene jest dostępne w Internecie pod adresem (https://www.snapgene.com/). Poza tym wykorzystaliśmy także serwer internetowy mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) do przewidywania drugorzędowej struktury mRNA kodowanego przez geny chimerycznego peptydu. Jako dane wejściowe podano zoptymalizowaną sekwencję poddanej odwrotnej translacji uzyskaną z narzędzia JCat. Program mfold opiera się na podstawowym algorytmie, który przewiduje minimalną energię swobodną, ​​∆ G i minimalną energię swobodną dla fałdowań zawierających dowolną konkretną parę zasad. Do dokładnego przewidywania energii składania stosowane są również różne ograniczenia składania. Energia fałdowania RNA jest ustalona na 37 stopni, podczas gdy warunki jonowe są ustalone na [Na+]=1 M i [Mg++]=0 [64].

Symulacja immunologiczna oparta na C-immsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) to oparte na serwerze narzędzie do przewidywania odpowiedzi immunologicznej, które wykorzystuje klasę opartą na agentach i jego przewidywanie opiera się na sieciach neuronowych. Potrafi przewidzieć zarówno humoralną, jak i komórkową odpowiedź immunologiczną. C-immsim wykorzystuje model Celdy Seiden, model sieci poliklonalnej ciągów bitowych i indeks Simpsona do scharakteryzowania przewidywania komórek aktywnych, spoczynkowych i pamięci oraz ich trwałości. Pomaga przewidzieć profil cytokin danej reakcji i ocenić odpowiedź zapalną [65].

Ekstrakt Cistanche w proszku

Symulacja dynamiki molekularnej

Symulację dynamiki molekularnej przeprowadzono w celu oceny stabilności naszego najlepszego kompleksu, tj. TLR, z proponowaną szczepionką przy użyciu serwera iMOD (strona główna iMod Server (csic.es). Ten serwer internetowy wykorzystuje ulepszoną analizę trybu normalnego (NMA). do charakteryzowania różnych właściwości dynamicznych biomolekuł, takich jak elastyczność i stabilność białek, za pomocą wewnątrzatomowego pola siłowego.W tym bieżącym badaniu przeanalizowaliśmy deformacje głównego łańcucha, współczynnik B, wartości własne, współczynnik kowariancji i model sieci elastycznej jako standardowe parametry NMA do oceny kompleksów białkowo-białkowych otrzymywane metodami in silico [66–69].

Wyniki

Selekcja i odzyskiwanie sekwencji białek antygenowych Leishmania

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), co odzwierciedla ich większą skuteczność w projektowaniu szczepionek (Tabela 1). Białka rozróżniano jako wydzielnicze i niewydzielnicze w oparciu o przewidywanie miejsc rozszczepienia peptydu sygnałowego przez serwer SignalP 1.4. Dwa z wybranych białek Leishmania, tj. Stwierdzono, że proteinaza cysteinowa A L. mexicana (identyfikator Uniprot: P25775) i glikoproteina powierzchniowa GP-46/M2 L. amazoensis (identyfikator Uniprot: P21978) zawierają peptydy sygnałowe, a zatem przewidywano je jako białka wydzielnicze. W pozostałych dziesięciu antygenach Leishmania nie stwierdzono żadnego peptydu sygnałowego wskazującego na ich niewydzielniczy charakter. Analiza lokalizacji przewidywała, że ​​proteinaza cysteinowa A L. mexicana (identyfikator Uniprot: P25775) będzie zlokalizowana w lizosomie/wakuoli, białka leiszmanolizyna C1 i proteofosfoglikan L. mexicana (odpowiednio identyfikatory Uniprot: P43150 i Q9TW13) będą białkami błonowymi , BRAK antygenu ochronnego L. donovani (identyfikator Uniprot: Q9BIJ5) znajdującego się w jądrze i białka 1 związanego z szokiem cieplnym 70 L. major (identyfikator Uniprot: P12076) zlokalizowanego w mitochondriach. Wszystkie pozostałe białka przewidywano jako cytoplazmatyczne (Tabela 1). Oprócz tego z bazy danych Uniprot (identyfikator Uniprot: P29459) uzyskano także sekwencję aminokwasową łańcucha alfa ludzkiej IL-12 do zastosowania jako adiuwant w ostatecznym konstrukcie szczepionki.

Przewidywanie epitopów CTL i HTL

Ze wszystkich badanych białek łącznie zidentyfikowano 59 powszechnych nieamerycznych epitopów CTL za pomocą serwerów NetCTL 1.2 i SYFPEITHI. Każdemu z przewidywanych epitopów CTL przypisano konkretny wynik obliczony przez odpowiednie serwery. Wybrano tylko 26 z tych powszechnych 9-merowych motywów CTL ze względu na ich wyższe wyniki (wskazujące wyższe powinowactwo wiązania MHC I). Te dwadzieścia sześć epitopów CTL powszechnie identyfikowanych przez oba serwery ze zgodnymi wyższymi wynikami włączono do końcowego konstruktu szczepionki (tabela uzupełniająca S1). Podobnie narzędzie do analizy wiązania MHCII IEDB przewidziało 15-mer epitopy HTL ze wszystkich wybranych białek w porównaniu z zestawem trzech ludzkich alleli HLA (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 i HLADRB1* 01:03). Przewidywane epitopy HTL z najniższą skorygowaną rangą dla każdego z tych alleli udokumentowano jak w dodatkowej tabeli S2. Z tej puli wybrano całkowitą liczbę dziewięciu sekwencji na podstawie ich niskich skorygowanych rang (Tabela 2), które czynią te epitopy HTL najsilniejszymi czynnikami wiążącymi MHC-II dla dowolnego z trzech alleli HLA. Wybrane epitopy HTL poddano następnie dalszej analizie obliczeniowej w celu przewidzenia ich zdolności do wytwarzania cytokin.

Tabela 1 Do skonstruowania szczepionki wykorzystano dwanaście potencjalnych peptydów antygenowych z różnych gatunków Leishmania i wybrano je na podstawie ich wysokiego wyniku antygenowego przewidywanego przez serwer ANTIGENpro

Skrining pod kątem epitopów HTL o zdolnościach indukowania cytokin

Wszystkie dziewięć wybranych epitopów HTL (Tabela 2) oceniano pod kątem ich zdolności do wytwarzania interferonu, stosując serwer IFNepitope. Serwer przewidział (IFN- w porównaniu z nonIFN, przy użyciu SVM i analizy hybrydowej opartej na motywach) tylko trzy takie peptydy, jak FRRLYKTLGQLVYKK z białka pręcika parafagellar 2C L. major, DNGAYLGMEPSSVAA z proteofosfoglikanu L. mexicana i RLHFFMMGFAPLTSR z łańcucha beta tubuliny L. mexicana jako „dodatni” z wynikami mniejszymi niż 1.0 (Tabela 3). Te trzy peptydy sprawdzono dalej pod kątem ich zdolności do wytwarzania IL-4 i IL-10-przy użyciu odpowiednio serwera IL4pred i serwera IL10pred. Obydwa serwery wykorzystują klasyfikator SVM i uwzględniają w przewidywaniu różne parametry wejściowe SVM, takie jak skład aminokwasów, skład dipeptydów, skłonność do aminokwasów i właściwości fizykochemiczne [32, 33]. Odpowiednie serwery przewidziały, że te trzy epitopy wytwarzające 15-mer IFN- -były również induktorami IL-4 i IL-10 (tabela uzupełniająca S3). W związku z tym te trzy 15-merowe epitopy HTL wiążące MHC-II zostały ostatecznie wybrane do konstrukcji szczepionki, biorąc pod uwagę ich zdolność do wywoływania wytwarzania cytokin IFN-, IL-4 i IL{{24 }}, pośrednicząc w ten sposób w zwiększonej odpowiedzi immunologicznej.

Analiza zachowania epitopów

Wykorzystano moduł IEDB „konserwacja w obrębie antygenu” dostępny na serwerze IEDB w celu ustalenia stopnia konserwacji wybranych epitopów CTL i HTL, które zostaną włączone do końcowego konstruktu szczepionki. Każdy z dwudziestu sześciu epitopów CTL i trzech epitopów HTL badano indywidualnie pod kątem specyficznego zestawu homologicznych sekwencji białkowych uzyskanych za pomocą Uniprot BLAST. Wyniki projektu BLAST wykazały wysoki stopień zachowania wybranych białek u różnych gatunków Leishmania, a także u innych pokrewnych pierwotniaków pasożytniczych, głównie Trypanosoma. Stwierdzono, że wszystkie epitopy HTL są wysoce konserwatywne (100%) w zestawie pokrewnych białek Leishmania zastosowanych w analizie, podczas gdy zakres konserwacji wybranych epitopów CTL wahał się od 0 do 100% (tabela uzupełniająca S4). Włączenie takich konserwatywnych epitopów CTL i HTL do końcowego konstruktu szczepionki zapewniłoby odporność krzyżową o szerokim spektrum przeciwko wielu gatunkom patogennej Leishmania, która powszechnie zakaża ludzi.

Tabela 2 Szczegóły wybranych epitopów HTL (15 merów) z ich białkami źródłowymi, odpowiednimi allelami wiążącymi i dostosowanymi rangami przewidywanymi za pomocą narzędzia wiązania IEDB MHC-II

Tabela 3 Serwer IFNepitope przewidział epitopy indukujące MHC II, które są zdolne do wytwarzania interferonu

Konstrukcja sekwencji szczepionki wieloepitopowej

Podstawową sekwencję wielopodjednostkowej szczepionki peptydowej skonstruowano przez połączenie sekwencji dwudziestu sześciu epitopów CTL i trzech epitopów HTL wybranych na podstawie ich antygenowości, powinowactwa wiązania MHC i zdolności indukowania cytokin. Poszczególne epitopy CTL i HTL połączono przy użyciu odpowiednio łączników AAY i GPGPG, a całkowita długość powstałego peptydu szczepionkowego wynosiła 369 aminokwasów. Adiuwant, łańcuch alfa ludzkiej IL-12 o długości 219 aminokwasów (identyfikator Uniprot: P29459), dodano do końca N zaprojektowanego peptydu za pomocą łącznika EAAK. Dodatek IL-12 jako naturalnego adiuwanta miał zwiększyć skuteczność szczepionki poprzez przyspieszenie odpowiedzi immunologicznej, co zostało już potwierdzone w badaniach na zwierzętach [3, 37]. Ponadto do końca C peptydu dodano również znacznik 6XHis, aby ułatwić identyfikację i oczyszczanie białka po jego wytworzeniu technologią rekombinacji DNA. Po dodaniu łączników, adiuwanta i znacznika histydynowego stwierdzono, że długość końcowego peptydu szczepionkowego wynosi 598 reszt aminokwasowych (ryc. 1).

Przewidywanie liniowego, ciągłego i nieciągłego epitopu komórek B

Obecność determinantów antygenowych w sekwencji pierwszorzędowej zaprojektowanej szczepionki zidentyfikowano, stosując dwa różne serwery, mianowicie ABCpred i BepiPred 2.0, w celu skuteczniejszego przewidywania. Serwer ABCpred przewiduje epitopy komórek B przy użyciu wytrenowanej rekurencyjnej sieci neuronowej i reprezentuje sekwencje kandydujące jako 16-peptydy merowe uszeregowane według ich wyników wiązania (tabela uzupełniająca S5). Wyższy wynik peptydu oznacza większe prawdopodobieństwo, że jest epitopem. Stwierdzono, że zaprojektowany peptyd szczepionkowy zawiera siedem nienakładających się na siebie 16-peptydów merowych z przewidywanymi wynikami 0,90 i wyższymi przy domyślnej wartości progowej wynoszącej 0,51 , co odzwierciedla ich bardzo dużą siłę wiązania i stymulacji limfocytów B. Drugi serwer, BepiPred 2.0, przewiduje prawdopodobieństwo, że każda reszta aminokwasowa w sekwencji wejściowej będzie częścią epitopu limfocytów B i przedstawia wynik jako ilustrację z pomarańczową gradacją koloru wskazującą stopień prawdopodobieństwo. Przewidywane reszty należące do epitopów komórek B oznaczono jako „E”. Serwer zidentyfikował dużą liczbę reszt jako liniowe epitopy komórek B z dużym prawdopodobieństwem w obrębie reszt o długości 380–53{{20}} pozycji peptydu (ryc. 2), gdy próg epitopu ustawiono na 0,5 (domyślnie). Zatem identyfikacja determinant antygenowych receptorów komórek B przez dwa niezależne serwery ustaliła fakt, że peptyd podany jako szczepionka będzie w stanie stymulować wytwarzanie przeciwciał przez komórki B w celu ochrony osobników przed infekcjami Leishmania. Kombinezon Ellipro (dostępny w portalu IEDB) przewidział łącznie 323 reszt aminokwasowych zlokalizowanych w ośmiu nieciągłych epitopach komórek B w udoskonalonej trzeciorzędowej strukturze szczepionki peptydowej, z punktacją w zakresie od 0,509 do 0,802. Wśród nich największy epitop konformacyjny zawierał 107 reszt aminokwasowych z przewidywaną oceną 0,772. Do analizy wykorzystano domyślne parametry serwera. Ellipro przewidział również dwanaście liniowych epitopów dla komórek B o łącznej liczbie 324 reszt w zakresie punktacji 0, 535–0, 885 (tabela uzupełniająca S6 i obraz uzupełniający M1).

Profilowanie antygenowości, alergenności i toksyczności konstruktu szczepionki

Antygenowość końcowej sekwencji szczepionki (z adiuwantem) oceniano za pomocą serwerów ANTIGENpro i VaxiJen 2.0. Serwer ANTIGENpro przewidział, że jest to prawdopodobny antygen z wynikiem antygenowości 0.745396. Serwer VaxiJen 2.0 ocenił peptyd szczepionkowy jako prawdopodobny antygen z wynikiem 0,5325 przy progu {{10}},5, gdy organizm docelowy został wybrany jako pasożyt (Tabela 4). Jednakże, gdy oryginalna sekwencja szczepionki bez adiuwanta została przeanalizowana przez VaxiJen 2.0, ona również została przewidziana jako prawdopodobny antygen z wynikiem 0.5768 w modelach pasożytów. Wynik przewidywania ANTIGENpro dla oryginalnej sekwencji wyniósł 0.714582. Zatem stwierdzono, że obie skonstruowane sekwencje szczepionki (z adiuwantem i bez niego) mają charakter antygenowy, co potwierdza fakt, że składniki peptydowe szczepionki same w sobie były antygenowe, nawet przy braku dodanego adiuwanta (Tabela 4). Jeśli chodzi o alergenność, AlgPred stwierdził, że ostateczna sekwencja szczepionki nie zawiera alergenów, z przewidywaną oceną 0,4018 przy progu 0,4. Ponadto nie stwierdzono, aby sekwencja białka zawierała jakikolwiek udowodniony eksperymentalnie epitop IgE i nie stwierdzono żadnych trafień w wynikach testu BLAST dla peptydów reprezentujących alergeny (ARP), co wskazuje na niealergenowy charakter szczepionki. Serwer AllerTOP v.2.0 również zdefiniował białko jako prawdopodobnie niebędące alergenem. Analiza toksyczności przeprowadzona przez serwer ToxinPred przewidywała, że ​​peptyd będzie nietoksyczny, gdy przyjęto podejście oparte na SVM (TrEMBL) + motyw przy progu SVM wynoszącym 0,1, a wartość odcięcia wartości E dla opartej na motywie ustalono na 10,0. Zatem wygenerowaną sekwencję szczepionki przewidywano jako prawdopodobny antygen, niealergen i nietoksyczny, a wszystkie te kryteria są ważnymi kryteriami idealnej szczepionki peptydowej składającej się z wielu podjednostek.

Ryc. 1 Schematyczne przedstawienie zaprojektowanej wieloepitopowej szczepionki peptydowej zawierającej łącznie 598 sekwencji aminokwasowych reprezentujących możliwy konstrukt szczepionki z N-końcowym naturalnym adiuwantem (zielony) połączonym z EAAK (fioletowy) z 26 CTL (pomarańczowy) przy użyciu łącznika AAY (niebieski) i 3HTL (żółty) są połączone z łącznikiem GPGPG (czerwony). Kończy się 6-Jego tagiem na terminalu C w celach oczyszczania

Ryc. 2 Epitop komórek B przewidywany przez serwer Bepipred 2.0. Przewidywano rozciąganie w różnych punktach od 1 do 590 sekwencji aminokwasowych z potencjalnym epitopem powyżej domyślnego poziomu progowego. Pierwsza linia oznaczona jako E pokazuje przewidywaną lokalizację epitopu

Ocena parametrów fizykochemicznych

Parametry fizykochemiczne ostatecznego konstruktu szczepionki zostały obliczone przez serwer Protparam na podstawie reszt aminokwasowych występujących w podanej sekwencji. Masę cząsteczkową (MW) zaprojektowanego peptydu obliczono na 65,68 kDa, co czyni go odpowiednim do indukowania odpowiedzi immunogennej. Teoretyczny pI (punkt izoelektryczny) obliczono jako 5,98, co oznacza, że ​​peptyd ma charakter lekko kwaśny. Całkowita liczba reszt naładowanych dodatnio i ujemnie w peptydzie wynosiła odpowiednio 48 i 55. Okres półtrwania obliczono na 30 godz. w retikulocytach ssaków in vitro, ponad 20 godz. w drożdżach i ponad 10 godz. w E. coli in vivo. Trwałość białka przez 30 godzin w komórkach ssaków (w tym ludzi) była wystarczająca do wywołania pożądanej odpowiedzi immunologicznej, ponieważ mechanizm wymaga przetwarzania i prezentacji białka przez komórki odpornościowe. Przewidywano, że indeks alifatyczny (względna objętość zajmowana przez alifatyczne łańcuchy boczne) wyniesie 78,34, co wskazuje, że białko jest z natury termostabilne, ponieważ indeks alifatyczny można uznać za pozytywny czynnik przyczyniający się do wzrostu termostabilności białek globularnych. Wskaźnik niestabilności obliczono na 47,10. Przewidywano, że przewidywana średnia wartość hydropatii (GRAVY) konstruktu szczepionki wyniesie -0,140; wartość ujemna definiuje go jako hydrofilowy i będzie oddziaływać z cząsteczkami wody [28, 70–72]. Podsumowując, analiza immunoinformatyczna przewidywała, że ​​zaprojektowany konstrukt peptydowy będzie antygenowy, termostabilny, trwały w komórkach ssaków i hydrofilowy. Wszystkie te czynniki wpływają na skuteczność konstruktu jako prawdopodobnego kandydata na szczepionkę.

Przewidywanie struktury wtórnej

Przewidywanie struktury drugorzędowej chimerycznego peptydu o długości 592 reszt przez serwer PSIPRED ujawnia obecność 45,77% helisy alfa, 4,89% arkusza beta i 49,32% cewek, jak pokazano na poniższej ryc. 3. Ponadto struktura RaptorX serwer predykcyjny przeanalizował odpowiednią dostępność rozpuszczalnika dla peptydu, w którym przewidywano, że 36% reszt będzie odsłoniętych, 28% przewidywano jako zakopane w podłożu, a 35% reszt było zakopanych, co wskazuje, że białko będzie miało ogólnie dobry kontakt wodą (rozpuszczalnikiem). Serwer RaptorX przewidywał, że tylko 32 reszty (5% peptydu) będą znajdować się w nieuporządkowanej domenie białka.

Przewidywanie struktury trzeciorzędowej

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 oznacza model z prawidłowym zagięciem. Wynik TM to parametr niezależny od długości sekwencji, służący do pomiaru podobieństwa strukturalnego przewidywanego modelu z innymi identycznymi białkami w tej samej rodzinie fałd SCOP/CATH [47].

Tabela 4 Wyniki antygenowości obliczone na serwerze ANTIGENpro i serwerze Vaxijen2.0 z antygenem i bez niego

Ryc. 3 Przewidywanie struktury wtórnej liniowej sekwencji szczepionki przez serwer PSIPRED

Ryc. 4 Przewidywanie i udoskonalanie struktury trzeciorzędowej 3-Modelowanie D struktury szczepionki zgodnie z przewidywaniami serwera I-TASSER. b Udoskonalenie surowego modelu 3-D przez serwer GalaxyRefne

Udoskonalenie i walidacja modelu 3-D szczepionki

„Prosty” trzeciorzędowy model szczepionki peptydowej udoskonalono następnie poprzez przetwarzanie go na serwerze GalaxyReone. GalaxyRefne dostarczyło pięć modeli, z których model 1 został uznany za najlepszy po ocenie i porównaniu powiązanych parametrów, takich jak GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbity (2,398); wynik starcia (21,1); słabe rotamery (0.6); i region preferowany przez Ramę (88,8) z resztą modeli (ryc. 4b). Wykres Ramachandrana wygenerowany przez serwer MolProbity pokazał, że dopracowany model 3-D ma 88,8% reszt w preferowanym regionie, 98,6% reszt w dozwolonym regionie i tylko 0,013% wartości odstających. Dla kontrastu, stwierdzono, że początkowy surowy model zawierał 77,1%, 94,2% i 0,057% reszt odpowiednio w regionach preferowanych, dozwolonych i odstających. Wyniki te wyraźnie wskazują, że jakość udoskonalonego modelu trzeciorzędowego uległa znacznej poprawie. Do dodatkowej walidacji dopracowanego modelu wykorzystano także serwer ERRATA. Serwer ERRATA przeanalizował model pod kątem ogólnego współczynnika jakości wynoszącego 43,542, co w rzeczywistości reprezentuje procent modelu białka wejściowego, który spada poniżej limitu odrzuceń wynoszącego 95%. W ten sposób z powodzeniem uzyskaliśmy znacznie udoskonaloną i zwalidowaną strukturę trzeciorzędową konstruktu szczepionki. Udoskonaloną trzeciorzędową strukturę szczepionki wraz z wykresami uzyskanymi z serwerów MolProbity i serwerów ERRAT przedstawiono na ryc. 5. Serwer sieciowy ProSA wykazał wynik Z wynoszący -1,08 (obraz dodatkowy M2), na którym negatyw wartość wskazuje, że model wykracza poza zakres punktacji podobnych białek o porównywalnych rozmiarach, których strukturę określono metodą dyfrakcji promieni rentgenowskich lub metodą NMR [51].

Inżynieria dwusiarczkowa peptydu szczepionkowego

Serwer Disulfide by Design 2.12 zwrócił 45 par reszt aminokwasowych, które są prawdopodobnymi miejscami tworzenia wiązań dwusiarczkowych. Zidentyfikowaliśmy cztery najważniejsze pary reszt kandydujących, które mogą znajdować się w regionie elastycznej pętli białka szczepionki w oparciu o ich wysoką energię wiązania i wartości Chi3 (tabela uzupełniająca S7). Te reszty, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54) i TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75) zastąpiono cysteiną w udoskonalonym trzeciorzędowym modelu końcowego białka szczepionki, poprawiając w ten sposób stabilność termiczną peptydu (ryc. 6). Jednak dokładność współczynnika B ogranicza się do tłumienia rozpraszania neutronów lub promieniowania rentgenowskiego przez ruch termiczny cząsteczek w krystalografii białek. W związku z tym rygorystycznie wybraliśmy wysoką energię wiązania i wartości Chi3 w stosunku do współczynnika B dla tego udoskonalonego modelu szczepionki wspomaganego komputerowo [73, 74].

Analiza interakcji dokowania peptydu szczepionkowego z receptorami TLR

Interakcje peptydu chimerycznego z receptorami immunologicznymi (ludzkie TLR{0}}, 4, 5, 8 i mysi TLR-9) badano, przeprowadzając analizę dokowania przy użyciu serwera PatchDock, w którym wiązanie oceniano powinowactwo szczepionki (liganda) do różnych receptorów TLR (receptorów). Brano pod uwagę dziesięć najlepszych modeli wygenerowanych przez PatchDock dla każdego dokowania, spośród których dla każdego przypadku wybrano najlepiej oceniane modele z najwyższymi wynikami dokowania. Wyniki odzwierciedlały kształt i uzupełnienie elektrostatyczne pomiędzy receptorami i ligandami. Największą komplementarność stwierdzono w przypadku ludzkiego TLR-2 (identyfikator PDB: 6NIG) z wynikiem 18 714, polem powierzchni 3963,10 i energią kontaktu atomowego (ACE) 217,99 (ryc. 7a) . Szczepionka wykazywała także skuteczne wiązanie z TLR-5 (identyfikator PDB: 3J0A) i TLR-9 (identyfikator PDB: 3WPF) z wynikiem dokowania wynoszącym 18 258; powierzchnia 2879,80 i ACE -666,94 oraz wynik dokowania 18164; oraz powierzchnia odpowiednio 4090,70 i ACE 495,74. Dokowanie z innymi TLR wykazało słabsze powinowactwo wiązania, co odzwierciedlały niższe wyniki dokowania wygenerowane przez PatchDock, 16 708 dla TLR-4 (identyfikator PDB: 4G8A) i 17 800 dla TLR-8 (identyfikator PDB: 4QC0). Zatem konstrukt naszej szczepionki był w stanie wiązać się z różnymi receptorami odpornościowymi z różnym powinowactwem wiązania. Byłoby to wysoce pożądane w przypadku skutecznej szczepionki pod względem wywoływania właściwej i podwyższonej odporności w celu zapobiegania infekcjom Leishmania. Ponadto do udoskonalenia i ponownej oceny najlepszego kompleksu (kompleksu szczepionek TLR-2) wykorzystano narzędzie internetowe FireDock, które udoskonaliło go przy minimalnej energii globalnej wynoszącej –19,01, asocjacji Van Der Waalsa (-25,74), kontakcie atomowym energia (-0,03) i wiążąca energia swobodna (-24,26). Wyniki te potwierdzają fakt, że peptyd szczepionkowy najskuteczniej oddziałuje z ludzkim TLR-2 i w ten sposób tworzy w miarę stabilny kompleks, który może wywołać wyraźną odpowiedź immunologiczną przeciwko pasożytom Leishmania. Oprócz tego dalej badamy łączenie TLR-2 ze szczepionką; przy użyciu serwera sieciowego Cluspro wybierany jest najlepszy model (ryc. 7b) w oparciu o rotacyjną FFT 5D i CAPRI (krytyczną ocenę przewidywanych interakcji) ze zrównoważonym ważonym wynikiem -1192,5 o największym rozmiarze klastra wynoszącym 42 członków. Tabela 5 zawiera listę 10 oddziałujących reszt aminokwasowych z Fig. 7b, które tworzą stabilny kompleks receptor-ligand.

Ryc. 5 wykres Ramachandrana dla modelu GalaxyRefne. b Serwer ERRAT przewidział ocenę jakości struktury białka

Ryc. 6 Projekt dwusiarczkowy 2.0 przewidywał cztery (oznaczone strzałką) potencjalne tworzenie się wiązań dwusiarczkowych w celu poprawy stabilności termicznej końcowego konstruktu szczepionki

Optymalizacja kodonów i klonowanie in silico w celu ekspresji białka szczepionki

Próbując przezwyciężyć problem błędu systematycznego kodonów, do optymalizacji kodonów wykorzystano narzędzie JCat, które zwróciło wejściową sekwencję aminokwasową peptydu szczepionkowego w postaci sekwencji cDNA poddanej odwrotnej translacji ze zoptymalizowaną wartością CAI wynoszącą 1. Wartość ta leży w przyjętym zakresie wartości CAI 0.8–1.0 [28], zapewniającym wysoki stopień ekspresji genu w organizmie gospodarza, E. coli K12. Im wyższa wartość CAI, tym lepszy będzie stopień ekspresji obcego genu. Ponadto stwierdzono, że zawartość GC w ulepszonej sekwencji wynosiła 51,85%, co wskazuje na dobrą optymalizację kodonów. Dla lepszej ekspresji genów wymagana jest zawartość GC na poziomie 35–70% [63]. Na końcach 5/ i 3/ sekwencji utworzono miejsca restrykcyjne dla enzymów XhoI i NdeI, po czym zmodyfikowaną sekwencję wstawiono do wektora pET28 a(+). Sklonowana wstawka, zaznaczona kolorem czerwonym, znajduje się pomiędzy określonymi miejscami restrykcyjnymi w wektorze. Na obu końcach sklonowanej sekwencji znajduje się również odcinek sześciu reszt histydynowych, aby ułatwić proces oczyszczania po wytworzeniu rekombinowanego białka szczepionki [6, 31]. Rozmiar końcowego konstruktu wektora plazmidowego z wstawionym fragmentem genu wynosił około 7 kb (ryc. 8). Serwer sieciowy mfold przewidział całkowitą liczbę pięćdziesięciu konformacji zwijania mRNA, spośród których wybrano górną strukturę ze względu na jej najniższy wynik energetyczny (ΔG= -492,50). Przewidywano, że ta szczególna złożona konformacja będzie zawierać pojedynczą pętlę zewnętrzną i cztery stosy z minimalnymi energiami swobodnymi wskazującymi stabilność konformacji. Pętla została utworzona z 21 jednoniciowych zasad i dwóch zamykających helis. Wykres punktowy energii obliczył, że optymalna energia (δG) wynosi 494,4 kcal/mol. Różne kolorowe kropki w polu odnoszą się do różnych stopni energii konkretnej pary zasad obecnej w mRNA, biorąc pod uwagę δG obliczone przez serwer [64]. Zgodnie z wykresem, energie swobodne większości par zasad mieszczą się w przedziale -487,5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Tabela 5 PyMOL wygenerował dziesięć oddziałujących reszt aminokwasowych receptora i liganda z ryc. 7b, a liczba w () wskazuje odpowiednią pozycję aminokwasów w receptorze i ligandzie

Symulacja immunologiczna

Symulacja odporności in silico przy użyciu serwera internetowego C-immsim przewidywała, że ​​liczba antygenów osiągnie aż do 6,9× 105 /ml w ciągu 2 dni od wstrzyknięcia początkowej dawki, a poziom antygenu spadnie do 0 czwartego dnia i później. Ten wzrost liczby antygenów jest skorelowany z niezwykłym wzrostem stężenia zarówno poziomu IgM IgM, jak i samego poziomu IgM podczas wczesnego okresu infekcji i osiągania maksymalnego poziomu w przybliżeniu w ciągu 12 dni od cyklu infekcji w dowolnej skali. Poziom innych podtypów IgG1+IgG2 i IgG1 znacznie wzrasta w wyniku wtórnej odpowiedzi odpornościowej (ryc. 9a). Profile cytokin wykazują mediatory stanu zapalnego, takie jak INF, osiągające poziomy do 4×106 ng/ml w 12 dniu, podczas gdy poziomy innych cytokin pozostają dość niskie (ryc. 9b). Komórkowa odpowiedź immunologiczna sugerowana obecnością aktywnych i spoczynkowych cytotoksycznych limfocytów T wzrasta po 2–3 dniach od pierwszego wstrzyknięcia. Wyraźna była także obecność proliferacyjnych limfocytów T pomocniczych pamięci (ryc. 9c i d). Całkowita populacja komórek B również wzrasta w ciągu 2–3 dni, wraz z wytwarzaniem komórek B pamięci po 1 tygodniu podawania dawki pierwotnej (ryc. 9e).

Ryc. 8 System ekspresji szczepionki Leishmania z wykorzystaniem wektora pET28 a(+), czerwony region wskazuje wprowadzoną sekwencję kwasu nukleinowego szczepionki flankowaną przez miejsca restrykcyjne NdeI i XhoI

Interpretacja symulacji dynamiki molekularnej

Najlepszy wynik dokowania uzyskany przez kompleks szczepionek TLR2-poddano dalszej analizie za pomocą symulacji dynamiki molekularnej wspomaganej przez NMA. Odkształcalność łańcucha głównego reprezentują wysokie przeguby (rys. 10a), co oznacza dużą odkształcalność. Za pomocą NMA obliczono współczynnik B (ryc. 10b), który oznacza elastyczność białka w oparciu o parametry przemieszczenia atomowego [73]. Wartość własna (rys. 10c) określa energię potrzebną do odkształcenia konstrukcji. Kompleks szczepionek TLR-2 wykazuje wartość własną około 7,778×10-7. Wariancja (ryc. 10d) jest odwrotnie proporcjonalna do wartości własnej. Macierz kowariancji (ryc. 10e) ilustruje, czy pary reszt są skorelowane (czerwony), nieskorelowane (biały) czy antyskorelowane (niebieski). Model sieci elastycznej (ryc. 10f) oblicza sprężyny pomiędzy odpowiednimi parami atomów, kropki na wykresie reprezentowane przez gradient kolorów wskazujący sztywność lub elastyczność sprężyny, a ciemniejszy kolor odzwierciedla sztywniejszą sprężynę. Zatem wyniki symulacji dynamiki molekularnej sugerują, że proponowana przez nas szczepionka peptydowa jest stabilna.

Dyskusja

Leiszmanioza uznawana jest za jedną z najbardziej zaniedbanych chorób tropikalnych, która dotyka przede wszystkim ludzi zamieszkujących ubogie obszary krajów rozwijających się, w tym Indii [2]. Według raportów WHO Indie są endemiczne dla obu postaci choroby, CL i VL. CL wywołana przez L. tropica i L. major występuje w północno-zachodnich stanach Indii, a jej ogniska obejmują Pendżab i Radżastan (https://www.who.int/leishmaniasis/load/Leishmaniasis_Indie/en/ ). Co więcej, wraz ze wzrostem występowania epidemii ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) na całym świecie, leiszmanioza stała się powracającym patogenem oportunistycznym u pacjentów z AIDS, co czyni sytuację jeszcze bardziej przerażającą [22, 38]. W bieżącym badaniu naszym celem było zaprojektowanie nowej, poliwalentnej szczepionki ogólnej przeciwko leiszmaniozie, która mogłaby zapewnić heterologiczną ochronę przed powszechnymi patogennymi gatunkami pasożytów. Wybraliśmy dwanaście białek specyficznych dla Leishmania, obejmujących pięć patogennych szczepów pasożyta powodujących zakażenia VL i CL u ludzi. Białka te zostały już ocenione pod kątem ich roli w zjadliwości i immunogenności oraz ich potencjału jako kandydatów na szczepionki w różnych badaniach immunologicznych[1, 8–10, 75). Dlatego też konstrukt szczepionki zaprojektowany in silico poprzez włączenie tak dobrze scharakteryzowanych i wysoce konserwatywnych białek immunogennych z różnych patogennych gatunków Leishmania może zapewnić odporność krzyżową przeciwko wszystkim postaciom ludzkiej leiszmaniozy (głównie VL i CL), a zatem mógłby być stosowany w leczeniu ogólny program szczepień mających na celu zapobieganie zakażeniom Leishmania u ludzi. Wybrane białka badano przede wszystkim pod kątem obecności potencjalnych epitopów CTL i HTL. Wykrywanie epitopów komórek T jest ważne, ponieważ komórki T mogą rozpoznawać antygeny jedynie wtedy, gdy są przetwarzane na szlaku endogennym lub egzogennym, w kompleksie z cząsteczkami MHC klasy I lub MHC klasy II, a następnie są prezentowane receptorom komórek T przez komórki prezentujące antygen ( APC). MHC-I jest specyficzny dla CD8+CTL, podczas gdy MHC-II wiąże się specyficznie z receptorami CD4+HTL. Identyfikację epitopów CTL przeprowadzono rygorystycznie, stosując jednocześnie dwa niezależne serwery. Ostatecznie do peptydu szczepionkowego włączono tylko te epitopy przewidywane przez oba serwery, które miały znacznie wyższe powinowactwa wiązania MHC. Zidentyfikowane epitopy HTL poddano dalszej ocenie pod kątem ich zdolności do indukowania cytokin, wykorzystując trzy serwery internetowe. Do zaprojektowania chimerycznej szczepionki peptydowej wybrano te, które mogą stymulować produkcję szerokiej gamy cytokin, a mianowicie IFN-, IL{{20}} i IL-10, aby zapewnić, że pobudziłoby to produkcję wszystkich tych cytokin specyficznych dla pasożyta u żywiciela. Ma to ogromne znaczenie, ponieważ Kedzierski i współpracownicy zaproponowali, że wydzielanie IL-10 jest równie ważne jak wydzielanie IFN – w celu ustalenia, czy szczepionka może wywołać ochronną odpowiedź immunologiczną i czy w przypadku IL nie zostanie wywołana właściwa odporność Poziomy -10 nie są proporcjonalnie podwyższone [8, 75]. Następnie wyłączne epitopy CTL i HTL poddano fuzji przy użyciu łączników AAY i GPGPG w celu skonstruowania chimerycznego peptydu. Donoszono już, że łączniki AAY i GPGPG są przydatne w projektowaniu szczepionek wieloepitopowych, ponieważ umożliwiają minimalną immunogenność połączeń i ułatwiają przetwarzanie i prezentację wybranych epitopów przez MHC-II [6, 28, 71]. Łańcuch alfa adiuwanta ludzkiej IL-12 połączono z końcem N powstałego peptydu poprzez łącznik EAAK. Na adiuwant wybrano IL-12, ponieważ jest to jeden z najskuteczniejszych adiuwantów szczepionki Leishmania w modelach zwierzęcych, co udokumentowano w poprzednich badaniach immunogennych [3, 37, 71]. Ponieważ szczepionka jest przeznaczona do podawania ludziom, oczekuje się, że włączenie ludzkiej IL-12 jako naturalnego adiuwantu zamiast jakiegokolwiek syntetycznego agonisty TLR zwiększy odporność bez powodowania niepożądanych skutków ubocznych. Podkreślona jest także rola IL-12 jako ogólnego adiuwanta w szczepionkach ze względu na jej siłę wzmacniania odpowiedzi przeciwciał na szczepionki zarówno białkowe, jak i polisacharydowe oraz wywoływania odpowiedniego miejscowego stanu zapalnego, który umożliwia wysięk IgG prowadzący do wzmożonej odpowiedzi immunologicznej [72]. Łącznik EAAK dodano w celu osiągnięcia wyższego stopnia ekspresji i promowania funkcji biologicznej peptydu fuzyjnego poprzez ograniczenie interakcji między domenami szczepionki [76, 77]. Analiza immunoinformatyczna wykazała, że ​​nasz konstrukt szczepionki zawiera wiele liniowych epitopów dla limfocytów B, które są wysoce pożądane w przypadku szczepionki przeznaczonej do stosowania immunoprofilaktycznego. Ponownie użyliśmy dwóch różnych narzędzi do dokładniejszych przewidywań. Obydwa serwery przewidziały wystarczającą liczbę epitopów komórek B w sekwencji szczepionki. Przewidywano, że zaprojektowana szczepionka nie będzie alergenem, nietoksyczna i wystarczająco immunogenna, aby wywołać właściwą reakcję immunologiczną. Późniejsza analiza fizykochemiczna wykazała, że ​​peptyd szczepionkowy jest lekko kwaśny (pI 5,98) ze znacznie wyższym indeksem alifatycznym (78,34), co sugeruje jego termostabilny charakter. Ujemna wartość GRAVY (-0,14) wskazuje, że peptyd jest hydrofilowy, co dodatkowo zwiększa jego skuteczność jako szczepionki. Wtórne elementy strukturalne szczepionki określono za pomocą serwera PSIPRED v 4.0, który jest jedną z najdokładniejszych i powszechnie stosowanych metod obliczeniowych do przewidywania drugorzędowej struktury białek. Ponadto przewidziano również strukturę 3D zaprojektowanego peptydu za pomocą serwera I-TASSER, który dostarczył szczegółowych informacji o współrzędnych ważnych reszt białka, co ma ogromne znaczenie w badaniu dynamiki, bioaktywności i interakcji szczepionki z innymi ligandami. Początkową strukturę trzeciorzędową udoskonalono i sprawdzono, wykorzystując narzędzia do walidacji struktury białek w celu zlokalizowania i skorygowania potencjalnych błędów w łańcuchu bocznym lub szkielecie przewidywanego modelu. Analiza wykresu Ramachandrana wykazała, że ​​ponad 90% reszt dopracowanego modelu mieści się w dozwolonym obszarze z niewielkim odsetkiem wartości odstających, podczas gdy serwer ERRAT wykazał współczynnik jakości 43,542, co oznacza zadowalającą jakość modelu. Serwer ElliPro stwierdził, że zatwierdzony model 3D zawiera odpowiednią liczbę konformacyjnych epitopów dla komórek B, co sugeruje, że może on generować pożądaną odpowiedź komórek B i stymulować wytwarzanie specyficznych przeciwciał u gospodarza. Aktywacja komórek B ma również kluczowe znaczenie dla pamięci immunologicznej i odpowiada za długotrwałą odporność u zaszczepionych osób. Oceniono także interakcję szczepionki z receptorami immunologicznymi (TLR), przeprowadzając analizę dokowania. Stwierdzono, że peptyd szczepionkowy ma najwyższe powinowactwo do TLR-2, a następnie TLR-5, chociaż w mniejszym stopniu był w stanie wiązać się z innymi receptorami TLR. Interakcja z receptorami TLR jest niezbędna do wywołania odporności ochronnej, ponieważ poprzednie badania na modelach zwierzęcych udokumentowały, że różne gatunki Leishmania lub ich składniki antygenowe oddziałują z różnymi receptorami TLR, prowadząc do intensywnej odpowiedzi immunologicznej u poddanych prowokacji żywicieli. Aby spełnić wymagania dotyczące zadowalającej ekspresji rekombinowanego białka szczepionki w układzie gospodarza E. coli (K12), przeprowadzono optymalizację kodonów za pomocą narzędzia JCat, które dostosowywało zawartość CAI i GC w sekwencji, czyniąc ją odpowiednią do ekspresji w E coli. Klonowanie in silico przeprowadzono również przy użyciu wektora ekspresyjnego opartego na plazmidzie pET28a(+), aby wykazać wykonalność sekwencji do klonowania i nadekspresji w celu uzyskania zwiększonej produkcji rekombinowanego białka szczepionki. Przewidywano drugorzędową strukturę mRNA kodowanego przez chimeryczną sekwencję genu, aby wykazać stabilność złożonej konformacji mRNA, która będzie miała wpływ na efektywny proces translacji w gospodarzu bakteryjnym. Mutacje stabilizujące utworzono poprzez dodanie nowych wiązań dwusiarczkowych do białka szczepionki, ponieważ przyczyniłoby się to do wzmocnienia białka natywnego, czyniąc je podatnym na dodatkowe badania biochemiczne, immunologiczne i biotechnologiczne.

Ryc. 9 Symulacja odporności oparta na serwerze C-immsim. a Całkowita generacja antygenu i odpowiedniego przeciwciała, b Profil produkcji cytokin, c i d wytwarzanie pomocniczych limfocytów T i całkowita (aktywna i spoczynkowa) liczba cytotoksycznych limfocytów T, e Odpowiedź komórek B po podaniu szczepionki

Rys. 10 Symulacja dynamiki molekularnej. a Odkształcalność głównego łańcucha wskazywana przez zawiasy, b Wygenerowany przez NMA współczynnik B pokazujący stabilność białka, c Wartość własna deformacji struktury kompleksu dokującego, d indywidualny (fioletowy) % wariancji i skumulowany (zielony) struktury, e skorelowana macierz kowariancji (czerwony), nieskorelowany (biały) lub antyskorelowany (niebieski) między parami atomów, model sieci f elastycznej pokazujący połączone sprężyny między parami atomu, ciemniejszy szary oznaczał sztywne sprężyny i odwrotnie

Cistanche suplement korzyści-zwiększają odporność

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Wniosek

W niniejszej pracy wykorzystaliśmy podejście wakcynologii odwrotnej do zaprojektowania in silico poliwalentnej, wielopodjednostkowej szczepionki peptydowej przeciwko ludzkiej leiszmaniozie (zarówno trzewnej, jak i skórnej), która mogłaby zapewnić heterologiczną ochronę przed pospolitymi pasożytami Leishmania zakażającymi ludzi, a także, zatem można je uznać za mające charakter o szerokim spektrum. To samo można zastosować w ogólnym programie szczepień w celu kontroli i wyeliminowania choroby jako strategię uzupełniającą wraz z obecnie dostępnymi środkami chemioterapeutycznymi. Ponadto zastosowaliśmy IL-12 jako naturalny adiuwant zamiast jakiegokolwiek niehumanizowanego syntetycznego peptydu. Zastosowanie IL-12 jako adiuwanta zwiększy immunogenność szczepionki, nie powodując żadnych niepożądanych skutków ubocznych w organizmie gospodarza. Pod warunkiem, że peptyd szczepionkowy składa się z różnych wysoce konserwatywnych i potencjalnie immunogennych peptydów uzyskanych z pięciu gatunków patogennej Leishmania, pomocne jest wywołanie odporności krzyżowej u zaszczepionych osób, co ma również zalety terapeutyczne i profilaktyczne. Różne rygorystyczne analizy immunoinformatyczne z wykorzystaniem kilku narzędzi obliczeniowych wykazały, że proponowana szczepionka jest immunogenna, stabilna i odtwarzalna jako białko rekombinowane oraz bezpieczna do badań na ludziach. Niemniej jednak należy przeprowadzić weryfikację eksperymentalną, aby zagwarantować właściwe wywołanie ochronnej i długotrwałej odporności oraz wykluczyć toksyczność.

Bibliografia

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM i in. (2018) Szczepionki peptydowe przeciwko leiszmaniozie. Przedni Immunol 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) Społeczne i ekonomiczne obciążenie leiszmaniozą człowieka. Am J Trop Med Hyg 94 (3): 489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Status badań nad szczepionkami i rozwój szczepionek na leiszmaniozę. Szczepionka 34(26):2992–2995. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI i Dube A (2014) Leiszmanioza trzewna: postępy w opracowywaniu szczepionek poprzez podejścia klasyczne i molekularne. Przedni Immunol 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) Badanie białek wydzielniczych Leishmania w celu zaprojektowania wieloepitopowej szczepionki podjednostkowej komórek B i T z wykorzystaniem podejścia immunoinformatycznego. Nauka Rep 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS i wsp. (2011) KSAC, pierwszy zdefiniowany kandydat na szczepionkę polibiałkową przeciwko leiszmaniozie trzewnej. Immunol szczepionki Clin 18(7):1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Szczepionka na leiszmaniozę: gdzie jesteśmy dzisiaj? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Kandydaci na szczepionki przeciwko leiszmaniozie: przegląd. Int Immunopharmacol 11(10):1464–1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Szczepionki drugiej generacji przeciwko leiszmaniozie. Trendy Parasitol 21(5):244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M i in. (2018) Antigenicity of Leishmania-activated c-kinase antigen (LACK) in human mononuklearnej krwi obwodowej komórek oraz działanie ochronne szczepionki pierwotnej przypominającej pCI-neo-LACK plus atenuowane wirusy krowianki wyrażające LACK u chomików. Przedni Immunol 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) Główny antygen LACK Leishmania jest wymagany do skutecznego pasożytowania kręgowców. J Exp Med 198 (11): 1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Białko błonowe kinetoplastidu-11 jako kandydat na szczepionkę i czynnik zjadliwości w Leishmania. Przedni Immunol 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Ukierunkowana delecja genu u Leishmania major identyfikuje leiszmanolizynę (GP63) jako czynnik zjadliwości. Mol Biochem Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL i wsp. (1993) Rekombinowane wirusy krowianki eksprymujące GP46/M-2 chronią przed infekcją Leishmania. Zainfekować odporność 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) Promastigoty wzbogacone białkiem szoku cieplnego Leishmania major indukujące odpowiedź immunologiczną Th2 u myszy BALB/c. Iran Biomed J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Exploring the Leishmania hydrofilowy acylowany powierzchniowy białko B (HASPB) eksportu metodami obrazowania żywych komórek. Metody Mol Biol 1459:191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) Przegląd na temat pręta parafagellarnego kinetoplastydu. J Parasit Dis 39(4):589–595. https://doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: proteazy cysteinowe są niezbędne dla wzrostu i patogeniczności. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Role of Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote cysteina proteaza w przeżyciu pasożyta podróżującego: badania przez zakłócenie genu i hamowanie antysensownego mRNA. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) Rola proteofosfoglikanów leishmania w przenoszeniu much piaskowych i zakażaniu żywiciela ssaka. Przedni Mikrobiol 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Identyfikacja nowych antygenów Leishmania donovani, które pomagają zdefiniować korelaty ochrony za pośrednictwem szczepionki w leiszmaniozie trzewnej. PLoS One 4(6):e5820. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) Badanie in silico Leishmania donovani – tubulina i inhibitory. J Chem. https://doi.org/10.1155/2014/492579