Zakażenie in vitro komórek nerki bydlęcej Madin-Darby (MDBK) sporozoitami Eimeria Acervulina: analiza ilościowa inwazji komórkowej pasożyta i replikacji przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR)
Mar 17, 2022
Abstrakt
Kokcydioza drobiu powoduje znaczne straty ekonomiczne dla przemysłu hodowlanego. Pasożyty Eimeria są odpowiedzialne za tę chorobę. W skali globalnej E. acervulina i E. tenella należą do najczęstszych Eimeria spp. infekujących brojlery. E. tenella jest powszechnie stosowany jako model zakażeń in vivo i badań in vitro. Z drugiej strony, E. acervulina była ledwo badana w warunkach in vitro. Dobrze ugruntowanym i szeroko stosowanym modelem in vitro zakażenia E. tenella jest bydło Madin Darbynerkalinia komórkowa (MDBK); jednak niewiele wiadomo na temat przydatności komórek MDBK jako komórek gospodarza dla E. acervulina. Jednowarstwy MDBK zainfekowaliśmy dwiema różnymi dawkami, 5×104 i 2× 105, sporozoitów E. acervulina i oceniliśmy kultury po 24 i 96 godzinach po zakażeniu (hpi). Dla porównania przeprowadziliśmy identyczny test infekcji przy użyciu E. tenella sporozoites. Aby ocenić reprodukcję pasożytów, liczbę kopii DNA markera SCAR E. acervulina i genu E. tenella ITS-1 określono ilościowo za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Stwierdziliśmy, że liczba kopii E. acervulina znacznie wzrosła przy 24 HPI w porównaniu z E. tenella (p<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">
Słowa kluczowe:Kokcydioza; Eimeria acervulina; Eimeria tenella; Drób; Komórki MDBK; Nerka
CISTANCHE POPRAWI CHOROBĘ NEREK / NEREK
Wprowadzenie
Kokcydioza jest ekonomicznie ważną chorobą w przemyśle drobiarskim (Blake i in. 2020). Choroba jest wywoływana przez pasożyty apikompleksanu z rodzaju Eimeria. Zakażenie następuje poprzez doustne spożycie zarodnikowanych oocyst. Będąc w gospodarzu, oocysty uwalniają sporozoity, które atakują komórki nabłonka jelitowego. Wewnątrz komórek gospodarza sporozoity przechodzą bezpłciowe i płciowe cykle namnażania. Oocysty są w ten sposób wytwarzane, a w konsekwencji zrzucane w kale. Zakażone zwierzęta mogą wykazywać utratę wagi, biegunkę, niską produkcję jaj, a choroba może być śmiertelna w niektórych przypadkach (López-Osorio i in. 2020). Siedem gatunków Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox i E. tenella) jest odpowiedzialnych za kokcydiozę ptaków na całym świecie. Morfologia oocyst, patologia i nasilenie choroby są powszechnymi czynnikami różnicującymi wśród tych gatunków. Ze wszystkich siedmiu Eimeria, E. acervulina, E. tenella i E. maxima są najbardziej rozpowszechnione w gospodarstwach brojlerów (Jordan i in. 2018; Moraes i in. 2015; Györke i in. 2013). Z tych 3 gatunków, E. tenella jest uważana za wysoce patogenną, podczas gdy E. acervulina i E. maxima wykazują umiarkowaną patogeniczność (López-Osorio i in. 2020). Pomimo różnic w patogeniczności, umiarkowana patogenna Eimeria spp. taka jak E. acervulina może zwiększać nasilenie choroby podczas jednoczesnego zakażenia (Hiob i in. 2017). Modele zwierzęce są cennym elementem w badaniach nad infekcjami. Jednak badania in vitro pasożytów kokcydiowych mogą przyczynić się do podstawowego zrozumienia choroby na poziomie komórkowym (Marugán-Hernández et al. 2020, Bussite et al. 2018, Thabet et al. 2017). Ponadto mogą być użytecznym narzędziem dostarczającym danych wyjściowych dla przyszłych terapii (Thabet i in. 2017; Khalafalla i in. 2011). Ze względu na zdolność do wzrostu w nieptasich liniach komórkowych (Marugán-Hernández i wsp. 2020; Thabet et al. 2017), E. tenella jest szeroko stosowana jako organizm modelowy w badaniach in vitro (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet i in. 2019, 2017; Khalafalla i in. 2011) i znaczne wysiłki zostały skierowane na badania E. tenella in vitro i in vivo, w tym wykorzystanie podejść molekularnych, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet i in. 2019, 2017; Hiob i in. 2017; Raj i in. 2013). Mniej wysiłków odnotowano w przypadku innych gatunków Eimeria, w tym E. acervulina (Naciri-Bontemps 1976; Itagaki i in. 1974; Strout i wsp. 1965; Hiob i in. 2017). Celem pracy była ocena inwazji in vitro i replikacji sporozoitów E. acervulina w monowarstwach komórkowych MDBK przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.
CISTANCHE POPRAWI DIALIZĘ NEREK / NEREK
Materiały i metody
Przejście oocyst E. acervulina i E. tenella oocystsE. acervulina i E. tenella zostały oddzielnie przepuszczone u zdrowych 11-dniowych piskląt zgodnie ze zmodyfikowaną metodą Eckerta i in. (1995). Zarodnikowane oocysty zebrano i przechowywano w 4% roztworze dichromianu potasu w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.Oczyszczanie i oczyszczanie oocystOocysty obu gatunków Eimeria oczyszczono z 4% roztworu dichromianu potasu. Następnie sporozoity zostały wzbudzone i oczyszczone zgodnie ze zmodyfikowaną metodą opisaną przez Rentería-Solís et al. (2020) .Hodowla komórkowaBydło Madin-Darbynerka(MDBK) monowarstwy (DSMZ, Brunszwik, Niemcy) zostały użyte jako model infekcji. Komórki MDBK wysiewano (2 × 105 komórek / dołek) w płytkach 24-dołkowych z zmodyfikowaną pożywką Orła Dulbecco (DMEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną 100 j.m., 100 μg / ml streptomycyną i 2,5 μg / ml amfoterycyną i inkubowaną w temperaturze 37 ° C w atmosferze 5% CO2 w powietrzu, aż osiągnęły 80% zbieżności.Zakażenie komórek MDBK sporozoitami EimeriaZbieżne monowarstwy MDBK zaszczepiono sporozoitami E. acervulina. Przeprowadzono wstępne badania w celu dobrania dawki zakażenia w oparciu o różne wskaźniki wielokrotności zakażeń (MOI) (pasożyt: komórka): 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 i 5,0 (Taha i in. niepublikowane dane). Do zakażenia wybrano dwie oddzielne dawki: 5× 104 (MOI: 0,25) lub 2× 105 sporozoitów/studzienkę (MOI: 0,5). Kultury narażone na zakażenie inkubowano następnie w temperaturze 41 °C w pożywce DMEM z 2% FBS, 100 j.m. penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny. Zaimplementowano dwa różne czasy inkubacji: 24 h po zakażeniu (hpi) i 96 hpi. Identyczny zestaw dawek zakażeń i czasów inkubacji przeprowadzono dla E. tenella sporozoites. Wszystkie eksperymenty obejmowały jedną negatywną kontrolę składającą się z niezakażonych monowarstw MDBK (komórek niezakażonych NC). Wszystkie testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Po 24 hpi komórki przemyto trzykrotnie sterylnym PBS (pH 7,2) i dodano nową pożywkę do grupy 96 hpi, podczas gdy 24 hodowle hpi zakończono. Monowarstwy trypsynowano pod koniec każdego okresu inkubacji (odpowiednio 24 hpi lub 96 hpi).
Ekstrakcja DNA i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)DNA zostało wyekstrahowane z trypsynizowanych komórek za pomocą zestawu DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. RT-qPCR wykonano w celu ilościowego określenia kopii markera Ac-R01-1731 charakteryzującego się amplifikacją regionu E. acervulina (SCAR), a dla E. tenella wewnętrznie transkrybowaną przekładkę 1 genu rybosomalnego DNA (ITS-1) jako korelację replikacji pasożyta. Testy RT-qPCR przeprowadzono zgodnie z metodami opisanymi odpowiednio przez Blake'a i in. (2008) oraz Kawaharę i in. (2008), z pewnymi modyfikacjami. Krótko mówiąc, reakcja objętościowa 20 μl zawierała 10 μl SYBR Green® master mix (Thermo Scientific, Dreieich, Niemcy), 500 nM starterów do przodu i do tyłu (Tabela 1), 2 μl szablonu DNA i 7 μl wody wolnej od nukleazy. Do każdego testu dodano kontrolę nieszablonową (NTC) składającą się z wody wolnej od nukleazy. Reakcje RTqPCR zostały wzmocnione w trzech egzemplarzach i przeprowadzone na Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Feldkirchen, Niemcy). Warunki RT-qPCR wynosiły 95 °C przez 5 minut, a następnie 40 cykli 95 °C przez 30 s. Wyżarzanie przeprowadzono w temperaturze 59,8 °C i 58 °C przez 20 s, odpowiednio dla E. acervulina i E. tenella, po czym nastąpił jeden cykl przedłużania wynoszący 20 s w temperaturze 72 °C. Zastosowano program krzywej topnienia obejmujący zakres temperatur od 60 do 95 °C w celu utworzenia krzywej dysocjacji. Wreszcie E. acervulina i E. Standardowe krzywe tenella zostały wygenerowane odpowiednio przez seryjne rozcieńczenie genomowego DNA i seryjne rozcieńczenie sklonowanych fragmentów genu ITS-1 (zgodnie z Thabet et al. 2015).
Analiza statystyczna
Testy normalności D'Agostino-Pearsona i Shapiro-Wilka wykorzystano do określenia normalnego rozkładu danych. Dwukierunkowy test ANOVA wykorzystano do porównania reprodukcji z uwzględnieniem punktów czasowych, dawek infekcji i gatunków Eimeria. Różnice uznano za statystycznie istotne, gdy p>0,05. Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane w oprogramowaniu GraphPad Prism 9 (San Diego, CA, USA).
Wyniki i dyskusja
Kopie genów markera SCAR E. acervulina i genu E. tenella ITS-1 zostały z powodzeniem wzmocnione i wykryte przez RT-qPCR w każdej reakcji. Po okresie inkubacji 24 hpi liczba kopii wykrytych po podaniu dawki 5× 104 sporozoitów była istotnie wyższa (p = 0,0002) dla E. acervulina (1,88× 105±5,56× 104 ) niż dla E. tenella (3,60× 104±5,37× 103 ) (ryc. 1). Podobnie, znacznie wyższą (p=0,0002) liczbę egzemplarzy uzyskano dla E. acervulina (4,82× 105±8,50× 104 ) niż dla E. tenella (1,27×105±9,32×103 ) 24 hpi po zastosowaniu 2×105 sporozoitów (rys. 1). Natomiast 96 hpi po zakażeniu 5 × 104 sporozoitami, liczba kopii w zakażonych kulturach E. acervulina była istotnie (p = 0,0044) niższa (6,96 × 103 ± 3,87 × 103 ) w porównaniu do E. tenella (1,24 × 105 ± 1,01 × 105 ). Podobnie wyższa dawka 2× 105 sporozoitów inkubowanych monowarstwami przez dłuższy okres 96 hpi spowodowała znacznie (p = 0,0044) mniejsze ilości kopii E. acervulina (3,35× 104±1,53× 104 ) w porównaniu z E. tenella (4,98× 105±1,28× 105 ) (ryc. 1).
Przetestowaliśmy zdolność E. acervulina do inwazji na monowarstwy MDBK, a następnie do pomnożenia ponad 24 i 96 hpi. Wcześniejsze próby oceny hodowli E. acervulina zostały przeprowadzone ze zmiennymi wynikami. Strout i in. (1965) zainfekowali różne pierwotne (zarodek kurczakanerkai fibroblasty) oraz stałe linie komórkowe (fibroblasty myszy, komórki HeLa). Strout i in. (1965) donieśli o rozpoznawalnej infekcji komórkowej przy 24 hpi we wszystkich liniach komórkowych. Co ciekawe, nie zaobserwowali wzrostu pasożytniczego w okresach powyżej 24 hpi w żadnym z badanych modeli komórkowych (Strout i in. 1965), co jest zgodne z naszymi obserwacjami zmniejszającej się liczby genów.
kopie 96 hpi. Naciri-Bontemps (1976) doniósł o wzroście E. acervulina u kurczątnerkakomórki do 93 hpi i obserwowane tworzenie się oocysty po inokulacji merozoitów. Jednak według naszej najlepszej wiedzy odkrycia te nie zostały potwierdzone przez późniejsze publikacje Opublikowano tylko jeden artykuł na temat monowarstw MDBK zakażonych sporozoitami E. acervulina (Talebi 2001). Krótko mówiąc, autor wystawił komórki MDBK wcześniej leczone hiperimmunologicznymi surowicami kurczaka lub królika na E. acervulina sporozoity przez 24 hpi. Kultury barwiono, a wewnątrzkomórkowe sporozoity liczono mikroskopowo. Niestety, badanie przedstawia wyłącznie procenty hamowania pasożytów przez surowicę (Talebi 2001), a zatem wnioski dotyczące skuteczności infekcji w tym modelu nie mogą być łatwo wyciągnięte. Według naszej wiedzy nie zgłoszono dalszych prób wykorzystania komórek MDBK jako modeli infekcji E. acervulina. Zgodnie z odkryciami Strout et al. (1965), zaobserwowaliśmy szczytową reprodukcję pasożytów przy 24 hpi i wyraźny spadek później reprezentowany przez niską liczbę kopii przy 96 hpi. Strout et al. (1965) i Naciri-Bontemps (1976) przedstawili dane jakościowe, które pochodziły wyłącznie z analizy mikroskopowej. Jednak RT-qPCR jest dokładniejszym i bardziej czułym środkiem do oceny reprodukcji pasożytów. W rzeczywistości RT-qPCR jest obecnie powszechnie stosowany do oceny ilościowej i został z powodzeniem ustanowiony do oceny reprodukcji kokcydiów (np. Marugán-Hernández et al. 2020, RenteríaSolís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Hiob et al. 2017, Thabet et al. 2017, Raj et al. 2013, Khalafalla et al. 2011)
Jednak mikroskopia elektronowa może dostarczyć cennych danych do analizy wewnątrzkomórkowego rozwoju E. acervulina w komórkach MDBK. Dlatego też należy rozważyć przeprowadzenie dalszych badań in vitro E. acervulina. Teoretycznie ptasie linie komórkowe byłyby preferowane jako model infekcji in vitro dla Eimerii kurczaka, ponieważ pochodzą od naturalnego gospodarza i mogą pozwolić na bardziej reprezentatywny wgląd w interakcje między pasożytem a gospodarzem niż hodowle komórkowe pochodzące od ssaków. Jednak większość kultur komórek kurzych odpowiednich do badań nad kokcydiozą drobiu to linie pierwotne (Bussiere i in. 2018, Strout i in. 1965; Naciri-Bontemps 1976). Komórki pierwotne mają kilka ograniczeń w porównaniu z kulturami stałymi. Jednym z nich jest ogólna potrzeba świeżej tkanki zwierzęcej do rozpoczęcia eksperymentów laboratoryjnych, co może być związane z ryzykiem zanieczyszczenia (Verma i in. 2020). Ponadto, aby uzyskać komórki pierwotne, zwierzęta muszą być składane w ofierze, co jest sprzeczne z względami etycznymi. Wreszcie, standaryzacja pierwotnych linii komórkowych może być związana z trudnościami.
CISTANCHE POPRAWI ZAKAŻENIE NEREK/NEREK
Dlatego stosowanie unieśmiertelnionych linii komórkowych jest powszechną praktyką w większości grup badawczych pracujących nad hodowlą in vitro ptasich kokcydiów. Ogólnie rzecz biorąc, wybiera się stałe kultury pochodzące od ssaków, ponieważ są one łatwo dostępne ze źródeł komercyjnych i ustala się narzędzia, takie jak przeciwciała, markery, opublikowane protokoły, sekwencje genomowe itp., Podczas gdy nie zawsze ma to miejsce w przypadku rzadziej stosowanych linii komórek kurzych. Komórki MDBK są stałą linią pochodzącą od bydła stosowaną jako model in vitro do szerokiej gamy zastosowań. Komórki MDBK są dobrze ugruntowane w badaniach in vitro na E. tenella (Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería-Solís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Thabet et al. 2017, Khalafalla et al. 2011). Na przykład Marugán-Hernández i in. (2020) przeprowadzili kompleksowy opis wewnątrzkomórkowego rozwoju E. tenella w komórkach MDBK. W tym badaniu autorzy śledzili poprzez RT-qPCR i odwrotną transkryptazę w czasie rzeczywistym podział komórkowy PCR oraz etap rozwoju transgenicznych szczepów E. tenella.
Naszym celem było ilościowe określenie namnażania E. acervulina w komórkach MDBK za pomocą technologii PCR. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, takie dane nie były wcześniej publikowane. Analiza morfologiczna nie była brana pod uwagę w naszym eksperymencie. Jednak było to wielokrotnie (Marugán-Hernández i wsp. 2020, Thabet et al. 2017 oraz Raj et al. 2013) wykazały, że wzrost liczby kopii genów jest w rzeczywistości związany z namnażaniem podczas merogony. Rozwój poza tą fazą bezpłciowego namnażania jest raczej mało prawdopodobny w warunkach podanych w naszym eksperymencie. Odkryliśmy, że w porównaniu do E. tenella, sporozoity E. acervulina atakują komórkę i rozmnażają się z większą szybkością podczas pierwszych 24 hpi. Jednak liczba kopii genów znacznie spada o 96 hpi, wykazując dynamikę namnażania pasożytów dla E. acervulina, która wyraźnie różni się od E. tenella. Wydaje się zatem prawdopodobne, że różne gatunki Eimeria zachowują się inaczej w hodowli in vitro i że ogólne wnioski uzyskane z E. tenella jako jedynego ustalonego organizmu modelowego powinny być wyciągane z ostrożnością. Dodanie większej liczby punktów czasowych może być pomocne w bardziej szczegółowej ocenie dynamiki mnożenia in vitro. Dodatkowe techniki można zastosować w celu wyjaśnienia, co dzieje się w tym okresie i czy praktyczne zastosowania przyszłych terapii mogą wynikać z tych wyników.
Niemniej jednak wykazaliśmy sukces inwazji pasożytów w tej linii komórkowej. Dlatego komórki MDBK mogą być dalej wykorzystywane jako modele infekcji inwazji komórek sporozoitowych E. acervulina. Zaleca się również stosowanie RT-qPCR i innych wrażliwych narzędzi. Co ważniejsze, ta linia komórkowa wspiera również infekcję E. tenella. Można to przełożyć na badania porównawcze obu gatunków Eimeria. Należy przeprowadzić dalsze szczegółowe analizy ilościowe i jakościowe w celu oceny przydatności hodowli MDBK jako matrycy in vitro dla E. acervulina i stadiów rozwojowych innych gatunków kurcząt Eimeria. pomoc; jesteśmy również wdzięczni M. Fritsche, B. Schneidewindowi i R. Schumacherowi (Instytut Parazytologii, Uniwersytet w Lipsku) za ich doskonałą pomoc jako opiekunów zwierząt. Wielkie podziękowania również dla R. Zhang (College of Animal and Veterinary Sciences, Southwest Minzu University) za jej cenną pomoc podczas pracy laboratoryjnej. Autorzy pragną również podziękować R. Schmäschke (Instytut Parazytologii, Uniwersytet w Lipsku) za jego cenną pracę nad przygotowaniem zezwoleń na zwierzęta.
