Inaktywacja RPX1 w Arabidopsis nadaje oporność na Plutella Xylostella poprzez akumulację homoterpenu DMNT

Abstrakcyjny

Szkodnik roślin z rzędu łuskoskrzydłych Plutella xylostella powoduje poważne ograniczenia w uprawie roślin kapustnych. Tutaj przedstawiamy nową rolę RPX1 (odporność na P. xylostella) w odporności na tego szkodnika u Arabidopsis thaliana. Mutant rpx1-1 odstrasza larwy P. xylostella, a żerowanie na mutancie rpx1-1 poważnie uszkadza strukturę macierzy peritroficznej w jelicie środkowym larw, wpływając w ten sposób negatywnie na wzrost i przepoczwarzenie larw. Oporność ta wynika z akumulacji związków obronnych, w tym monoterpenu (3E)-4,8-dimetylo-1,3,7-nonatrienu (DMNT), w wyniku zwiększenia ekspresji PENTACYKLICZNEJ SYNTAZY TRITERPENU 1 (PEN1), która koduje kluczowy enzym biosyntezy DMNT. Inwazja i zranienia P. xylostella powodują degradację białka RPX1, co może powodować szybką reakcję na inwazję owadów. Inaktywacja RPX1 i nadekspresja PEN1 nie są powiązane z negatywnymi konsekwencjami dla wzrostu roślin, ale powodują znacznie wyższą produkcję nasion niż typ dziki w obecności inwazji P. xylostella. Badanie to oferuje nową strategię molekularnej hodowli roślin przeciwko P. xylostella.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

  SŁOWA KLUCZOWE

odporność na szkodniki, metabolizm wtórny, emisje lotne

1|WSTĘP

Szkodniki owadzie nie tylko zmniejszają plony, ale także wpływają na jakość produktów roślinnych (Johnson i Züst, 2018; Wu i in., 2016; Zhao i in., 2016). Wśród nich ćma diamentowa Plutella xylostella jest szeroko rozpowszechnionym i szkodliwym szkodnikiem z rzędu Lepidoptera, który żeruje na roślinach krzyżowych, takich jak kalafior i kapusta, powodując ogromne straty ekonomiczne. Obecnie w gospodarce rolnej zwalczanie szkodników za pomocą agrochemikaliów (np. pestycydów) jest bardzo skuteczne i szeroko stosowane, jednak podejście to staje się problematyczne ze względu na potencjalne skażenie środowiska i zagrożenia dla zdrowia ludzkiego (Shakeel i in., 2017). Alternatywnym podejściem do produkcji roślinnej jest wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych roślin uprawnych o zwiększonej odporności na szkodniki, na przykład w roślinach wykazujących ekspresję Bacillus thuringiensis (Jouzani et al., 2017) lub innych heterologicznych białek entomotoksycznych (Douglas, 2018). Podjęto szeroko zakrojone wysiłki w celu zidentyfikowania nowych podejść do zwalczania P. xylostella w rolnictwie; jednakże skuteczne geny, naturalne pestycydy i odporna plazma zarodkowa pozostają ograniczone (Zhou i Jander, 2021). W wyniku ciągłego wyścigu zbrojeń ze szkodnikami owadzimi rośliny rozwinęły różne zdolności do zwalczania ataków owadów. W związku z tym rośliny syntetyzują szereg metabolitów obronnych, takich jak benzoksazynoidy (Handrick i in., 2016; Varsani i in., 2019), benzoesan metylu (Feng i Zhang, 2017) i serotonina (Lu i in., 2018) w odpowiedzi na uszkodzenie przez szkodniki. Kwas jasmonowy (JA), zwany także „hormonem rany”, odgrywa kluczową rolę w różnych reakcjach na uszkodzenia związane z ranami, inicjowanych przez inwazję owadów (Lortzing i Steppuhn, 2016). Coraz więcej dowodów sugeruje, że JA działa synergistycznie i/lub antagonistycznie z innymi fitohormonami, takimi jak kwas salicylowy (SA) i etylen (Costarelli i in., 2020; Ma i in., 2019). Oprócz bezpośredniej obrony rośliny uszkodzone przez ataki owadów uwalniają różne lotne związki, które przyciągają naturalnych wrogów roślinożerców (Gols, 2014). Spośród tych złożonych lotnych mieszanek, związki homoterpenowe (3E)-4,8-dimetylo-1,3,7-nonatrien (DMNT) i (E, E)-4,8,12-trimetylo-1,3,7, 11-tridekatetraen (TMTT) opisano u wielu gatunków roślin, takich jak Arabidopsis (Lee i in., 2010; Sohrabi i in., 2015), ryż (Li i in., 2018), kukurydza (Gouinguené i in., 2005). ; Richter i in., 2016) oraz bawełny (Liu i in., 2018). Kilka badań wykazało również, że DMNT działa jako cząsteczka sygnałowa, która indukuje mechanizmy obronne przeciw roślinożercom podczas komunikacji między roślinami (Arimura i in., 2000; Meents i in., 2019). Na przykład po uszkodzeniu przez owady żujące niektóre słodkie ziemniaki wydzielają DMNT, co powoduje ogólnoustrojową indukcję skręcenia inhibitora proteazy w sąsiadujących roślinach słodkich ziemniaków i sprawia, że ​​są one niestrawne dla owadów (Meents i in., 2019). Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku roślin herbaty (Jing i in., 2020). Niedawno odkryliśmy, że DMNT odgrywa rolę w zabijaniu larw P. xylostella poprzez zakłócanie bariery macierzy peritroficznej (PM) w jelicie środkowym owada (Chen i in., 2021).

W roślinach wyższych szlaki biosyntezy DMNT i TMTT zostały dobrze scharakteryzowane poprzez genetykę odwrotną i analizy biochemiczne. W kukurydzy DMNT i TMTT powstają w wyniku oksydacyjnej degradacji (E)-nerolidolu i (E, E)-geranylolinaloolu przez dwie monooksygenazy P450, CYP92C5 i CYP92C6 (Richter i in., 2016). U bawełny dwa geny CYP (GhCYP82L1 i GhCYP82L2) są odpowiedzialne za konwersję (E)-nerolidolu do DMNT i (E,E)-geranylolinaloolu do TMTT (Liu i in., 2018). W korzeniach Arabidopsis DMNT jest katalizowany z prekursora diolu triterpenowego C30, kanabidiolu, przez monooksygenazę cytochromu P450 kodowaną przez specyficzny dla korzenia gen CYP705A1 (Sohrabi i in., 2015). Badanie wykorzystujące drożdże jako organizm modelowy przedstawiło dowody na to, że kannabidiol jest wytwarzany z 2,3-oksydoskwalenu przez syntazę kanabidiolu PEN1 (Xiang i in., 2006), a której ekspresja jest synergistycznie związana z CYP705A1 (Sohrabi i in. ., 2015). Niemniej jednak regulacja kluczowych genów biosyntezy DMNT pozostaje w dużej mierze nieznana. Gen RPX1 opisany w tym badaniu koduje nowe białko wiążące czapeczkę (CBP), które należy do rodziny genów eukariotycznego czynnika inicjacji 4E (eIF4E). U roślin rodzina eIF4E składa się z eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E i nCBP, które odgrywają zasadniczą rolę w inicjacji zależnej od czapeczki translacji mRNA (Rhoads, 2009). Członkowie rodziny eIF4E są głównym źródłem recesywnej oporności na wirusa Y ziemniaka (PVY) – najbardziej szkodliwego patogenu wpływającego na plon i jakość ziemniaków, a zastosowanie technologii CRISPR-Cas9 ukierunkowanej na gen eIF4E1 rozszerza spektrum oporności wirusa Y ziemniaka Solanum tuberosum (Lucioli i in., 2022). Podobnie edycja izoform eIF4E manioku nCBP-1 i nCBP-2 za pośrednictwem CRISPR/Cas9 zmniejsza nasilenie i częstość występowania objawów spowodowanych chorobą brunatnych smug manioku (Gomez i in., 2019). Co więcej, badania Arabidopsis pokazują, że niedobór nCBP odgrywa rolę w ograniczaniu przemieszczania się wirusów roślinnych z komórki do komórki (Keima i in., 2017). Niemniej jednak nie opisano funkcji nCBP w obronie roślinożerców. W tym przypadku stosujemy podejście integracyjne do funkcjonalnego scharakteryzowania genu RPX1 Arabidopsis, który odgrywa ważną rolę w odporności roślin na P. xylostella. Nasze wyniki wskazują, że zniszczenie RPX1 skutkuje zróżnicowaną ekspresją genów (DEG) i akumulacją związków. Jednym z genów o zwiększonej ekspresji jest PEN1, który jest kluczowy dla biosyntezy DMNT. Inwazja mutanta rpx1 i akumulacja DMNT wpływają na strukturę PM P. xylostella i powodują defekty rozwojowe i śmierć larw. Dalsze dowody wskazują, że inwazja i zranienia P. xylostella indukują degradację białka RPX1, co z kolei może prowadzić do odporności roślin na owady.

2|MATERIAŁY I METODY

2.1|Materiały roślinne i warunki wzrostu

Nasiona Arabidopsis zamówiono w Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC, http://Arabidopsis.info/). Nasiona sterylizowano powierzchniowo, wysiewano na podłoże Murashige i Skoog (MS) i stratyfikacji w temperaturze 5 stopni w komorze wzrostowej w fotoperiodzie krótkiego dnia (8 godzin światła, 16 godzin ciemności) przez 3 dni. Następnie przeniesiono je do szklarni w temperaturze 22 stopni w ramach długotrwałego fotoperiodu (16 godzin światła, 8 godzin ciemności) przy normalnej pielęgnacji roślin.

2.2|Eksperymenty i testy biologiczne z wyborem (preferencją) i bez wyboru

Jaja P. xylostella zakupiono od Henan Jiyuan Baiyun Company (kot: HJB004, opracowany w 2009 r., rozmnażany do badań naukowych w kontrolowanym środowisku) i inkubowano w komorze wzrostowej ustawionej na 26 stopni, 16 godz. światła/8 godz. ciemności. W celu przeprowadzenia eksperymentów z wyborem przenieśliśmy 3-tygodniowe rośliny Arabidopsis (odpowiednio osiem roślin typu dzikiego i zmutowanych) do zbiorników testowych podłączonych do obu końców szklanej probówki, a pozostałe etapy eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem ( Chen i in., 2021). Wykorzystano larwy w czwartym stadium rozwoju, a do każdego powtórzenia eksperymentalnego włączono 15 larw.

W eksperymencie bez wyboru 3-tygodniowe rośliny typu dzikiego i zmutowane przeniesiono do oddzielnych i półotwartych szalek Petriego zawierających tę samą liczbę larw P. xylostella w 15 s-instar. Kolejne etapy przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (Chen i in., 2021).

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

2.3|Badania przesiewowe opornych mutantów Arabidopsis przeciwko P. xylostella

Zebraliśmy 179 mutantów insercyjnych T-DNA Arabidopsis do badań przesiewowych oporności na P. xylostalle. Mutanty hodowano na pożywce MS i przeszczepiano do doniczek P7 (rozmiar: 7 × 7 cm) w warunkach wzrostu przez długi dzień (22 stopnie, 16 godzin światła/8 godzin ciemności). Aby uniknąć potencjalnego wpływu na środowisko, codziennie przenosiliśmy i obracaliśmy doniczki. W celu wstępnego przeszukania mutantów przygotowaliśmy dwie repliki, hodując każdego mutanta w dwóch doniczkach, z roślinami Col-0 jako kontrolą. Po 2 tygodniach wzrostu po przeszczepieniu, wszystkie mutanty poddano testowi preferencji larw P. xylostella w trzecim stadium, porównując je z Col-0, jak opisano powyżej. Mutanty, które wykazywały inne preferencje larwalne niż Col-0, uznano za mutanty oporne lub wrażliwe i wybrano do dalszej walidacji eksperymentalnej i badań funkcjonalnych.

2.4|Konstrukcja plazmidu i transformacja genów

Dla konstruktu RPX1pro: RPX1, genomowy region kodujący RPX1 z sekwencją powyżej 1,6 kb i sekwencją poniżej 1 kb amplifikowano metodą PCR z genomowego DNA wyekstrahowanego z Col-0. Złożony fragment DNA sklonowano do wektora pGreenII-0179 i transformowano do mutanta rpx1-1 metodą zanurzania w kwiatach (Clough i Bent, 1998). Aby skonstruować RPX1pro: RPX1-GFP, promotor RPX1 (1,6 kb), region kodujący i nie podlegające translacji sekwencje 3' o wielkości 1 kb amplifikowano metodą PCR z genomowego DNA Col-0. Fragment GFP amplifikowano z plazmidu zawierającego sekwencje GFP. Te fragmenty DNA złożono w wektorze pGreenII-0179 przy użyciu metody cięcia i ligacji, a następnie transformowano do mutanta rpx1-1. Dla 35Spro: konstrukt RPX1-FLAG, sekwencje kodujące RPX1 amplifikowano metodą PCR z cDNA poddanego odwrotnej transkrypcji z mRNA Col-0. Fragment PCR sklonowano do wektora pCambia1300-FLAG metodą infuzji (Clontech) i transformowano do Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) i 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): Sekwencje kodujące tych genów amplifikowano metodą PCR z cDNA Col-0 i ligowano z wektorem pLGNL-35S. Sztuczny mikroRNA (amiR) ukierunkowany na PEN1 zaprojektowano zgodnie z wcześniejszym opisem (Schwab i in., 2006), amplifikowano przy użyciu plazmidu pRS300 jako matrycy i wligowano do zmodyfikowanej wersji wektora pCambia1300m. Wszystkie sekwencje starterów są wymienione w informacjach uzupełniających: Tabela S1.

2,5|Oznaczenia aktywności s-transferazy glutationowej (GST) i cytochromu P450 (CYP450) u larw P. xylostella

Po tym, jak larwy P. xylostella w drugim stadium larwalnym karmiono sadzonkami Col-0 lub rpx1-1 przez 72 godziny, zebrano je i zmielono na drobny proszek w ciekłym azocie. Testy przeprowadzono przy użyciu zestawów do analizy aktywności GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, kat. A004) i CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company, kat. P450), zgodnie z instrukcjami producenta. Każdy test miał trzy powtórzenia biologiczne i każde powtórzenie zawierało 30 larw P. xylostella.

2.6|Testy Smerfa

Do karmienia larw P. xylostella w drugim stadium wykorzystano trzytygodniowe sadzonki Col-0 lub rpx1-1. Test przeprowadzono w sposób opisany wcześniej z niewielkimi modyfikacjami (Chen i in., 2021). Zastosowano sześć replik biologicznych, a każda replika zawierała 15 larw P. xylostella.

2.7|Mikroskopowa obserwacja struktury PM larw

Analizę anatomiczną struktury PM larw i analizę przekroju parafinowego jelita larwalnego przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (Chen i in., 2021).

2.8|Analiza ekspresji genów i sekwencjonowanie transkryptomu (sekwencja RNA)

Siewki Col-{{0}} i rpx1-1 hodowano w warunkach wzrostu przez długi dzień (16 godzin światła, 8 godzin ciemności) w temperaturze 22 stopni. Do sekwencjonowania transkryptomu wykorzystano dwutygodniowe sadzonki Col-0 i rpx1-1. Każda próbka zawierała trzy repliki biologiczne. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN, numer katalogowy: DP441). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano metodą odwrotnej transkrypcji przy użyciu systemu One-Step RT (Takara Bio) zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadzono qRT-PCR ze starterami specyficznymi dla genu wymienionymi w informacjach uzupełniających: Tabela S1 na instrumencie Roche Light Cycler 480. Konstrukcję i sekwencjonowanie bibliotek seq RNA przeprowadzono przy użyciu Biomarker (Pekin, Chiny) na platformie Illumina HiSeq. Na koniec wykorzystaliśmy EdgeR do przeprowadzenia analizy wyrażeń różnicowych (ustawiono próg istotnej różnicy:|log2foldchange|Większy lub równy 1, p < 0,05). Przeprowadzono trzy repliki biologiczne dla Col-0 i rpx1-1, a geny ulegające różnej ekspresji wymieniono w zestawie danych S1.

2.9|Analiza ekstrakcyjna, chromatografia gazowa i spektrometria mas (GC-MS) DMNT i DMNT-2H w Arabidopsis

Ekstrakcję i analizę DMNT przeprowadzono w sposób opisany wcześniej z niewielkimi modyfikacjami (Sohrabi i in., 2015). W testach do ekstrakcji i pomiaru DMNT użyto 2 g 3-tygodniowych sadzonek Arabidopsis.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|Wytwarzanie i charakterystyka DMNT

DMNT zsyntetyzowano w sposób opisany wcześniej, z niewielkimi modyfikacjami (HJ Huang i Yang, 2007). W skrócie, do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml, wyposażonej w mieszadło magnetyczne pokryte teflonem, załadowano 1 g (6,48 mmol) alkoholu allilowego i 50 ml dichlorometanu. Roztwór energicznie mieszano i dodano 3,6 g aktywnego dwutlenku manganu, a następnie co 2-3 godziny dodawano 1–2 g utleniacza, aż do zakończenia reakcji. Produkt następnie wykorzystano do wytworzenia pożądanego związku w drodze reakcji rozmyślnej. Strukturę i czystość DMNT potwierdzono metodami spektroskopowymi 1H jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) i 13C NMR.

2.11|Leczenie DMNT P. xylostella

Testy przeprowadzono na szalkach Petriego pokrytych przezroczystą, przylegającą folią z tworzywa sztucznego z wieloma otworami. DMNT rozcieńczono w oleju parafinowym (Sigma-Aldrich) do żądanej dawki (2,5 nmol/L-25 μmol/L) i wstrzyknięto do paszy zgodnie z opisem w tekście. Wszystkie testy przeprowadzono w sześciu powtórzeniach biologicznych, przy czym każde powtórzenie składało się z 15 larw. Rozwój larw rejestrowano w dokumentacji fotograficznej. Jako kontrolę zastosowano paszę, na którą nastrzyknięto taką samą objętość rozpuszczalnika w postaci oleju parafinowego.

2.12|Pomiar zawartości JA i SA w sadzonkach Arabidopsis

Testy przeprowadziła firma Nanjing Convinced-test Technology Company. Dwutygodniowe sadzonki Col-{{0}} i rpx1-1 zakażono larwami P. xylostella w 15 s-instar, z niezakażonymi siewkami jako kontrolą. Umieściliśmy po dwie larwy na każdej roślinie z grupy porażenia, aby mieć pewność, że wszystkie rośliny zostały zainfekowane. Po 24 godzinach pobrano próbki roślin i szybko zamrożono w ciekłym azocie w celu oznaczenia JA i SA. Próbki zmielono na drobny proszek w ciekłym azocie i ekstrahowano roztworem ekstrakcyjnym izopropanol-woda-kwas solny, a następnie dodano 8 ul deuterowanego kwasu salicylowego (D-SA) i kwasu dihydrojasmonowego (2HJA) (1 ug /ml każdy) jako standardy wewnętrzne. Następnie dodano dichlorometan i roztwór dobrze mieszano na rotatorze przez 30 min. Po otrzymaniu dolnej fazy organicznej przez odwirowanie przy 13,{{1{{20}}}} obr/min przez 5 min, przedmuchano ją azotem i ponownie rozpuszczono w metanolu (0 ,1% kwasu mrówkowego), a następnie odwirowano przy 13,000 g przez 10 min. Na koniec supernatant przefiltrowano przez organiczną membranę filtracyjną o średnicy porów 0,22 µm i analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas (HPLC-MS/MS). Wszystkie etapy ekstrakcji przeprowadzono w temperaturze 4 stopni. Tożsamość JA i SA określono na podstawie czasu szczytu substancji docelowych i stosunku masy do ładunku (m/z) odpowiednich jonów. Kwantyfikację JA i SA dopasowano przy użyciu równania regresji liniowej uzyskanego z wewnętrznych krzywych wzorcowych. W celu uzyskania krzywej wzorcowej wewnętrznej przygotowano roztwory wzorcowe SA i JA o gradientach 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 i 200 ng/ml, stosując metanol (0,1% kwas mrówkowy) jako rozpuszczalnik, i do rzeczywistego wykresu dodano roztwory wzorców wewnętrznych o końcowym stężeniu 20 ng/ml. Z równań krzywych standardowych usunięto anomalie liniowości. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|Analiza transportu DMNT u Arabidopsis

DMNT rozpuszczono w DMSO i dodano do pożywki MS bez glukozy. Trzytygodniowe rośliny Arabidopsis przeniesiono do probówek, a ich korzenie zanurzono w pożywce MS z dodatkiem DMNT lub DMSO (kontrola). Aby zapobiec zanieczyszczeniu, probówki przykryto dwiema warstwami parafilmu, a w folii wykonano niewielki otwór, przez który korzenie roślin umieszczano w pożywce MS w celu dalszego wzrostu. Po 24 godzinach usunięto korzenie traktowanych roślin, a ich liście wykorzystano do karmienia P. xylostella, a następnie analizowano przeżywalność larw i tempo przepoczwarzenia. Ten sam eksperyment powtórzono z pożywką wzrostową zawierającą DMNT znakowany 2H lub DMSO jako kontrolę. Po 24 godzinach inkubacji zebrano liście i poddano analizie GC-MS. Aby wykluczyć możliwość ulatniania się DMNT z podłoża DMNT do części nadziemnych i powodowania zanieczyszczenia śladowego, grupę kontrolną utworzono w ten sam sposób, ale korzenie roślin zasypano wilgotną bawełną i nie zanurzono w podłożu DMNT. Po 24 godzinach części nadziemne zebrano do dalszych testów biologicznych lub wykrywania DMNT przy użyciu GC-MS.

Korzyści z cistanche tubulosa-wzmocnić układ odpornościowy

2.14|Ekstrakcja białka i analiza immunoblottingu RPX1 w Arabidopsis po zakażeniu P. xylostella i leczeniu ran

Ustaliliśmy dwa rodzaje zabiegów na transgenicznym RPX1pro: RPX1-GFP i 35Spro: RPX1-FLAG Sadzonki Arabidopsis: inwazja i rany P. xylostella. W przypadku inwazji larwnej hodowaliśmy sadzonki Arabidopsis przez 2 tygodnie i karmiliśmy nimi larwy w drugim stadium rozwojowym (umieść co najmniej jedną larwę na każdą sadzonkę), po 15-120 minutach larwy usuwano, a zaatakowane sadzonki wybierano i zbierano do dalsze eksperymenty. Aby imitować zranienie, użyliśmy igły 1 ml strzykawki, aby zrobić dziurę w każdym liściu Arabidopsis. Siewki zebrano po 15−120 minutach wzrostu.

Aby określić, czy rośliny zakażone P. xylostella mogą indukować degradację RPX1, zakażaliśmy sadzonki Col-0 P. xylostella przez 15-120 min i testowaliśmy jego wpływ na RPX1-GFP w roślinach transgenicznych. Wszystkie próbki zmielono na proszek w ciekłym azocie, a następnie równe ilości zakażonego i niezainfekowanego Col-0 oddzielnie zmieszano z taką samą ilością tkanek RPX1-GFP i inkubowano w roztworze w temperaturze 4 stopni przez 15 minut. Na koniec mieszaninę odwirowano, a supernatant poddano analizie immunoblottingu. Do analizy Western blot białka całkowite ekstrahowano buforem do ekstrakcji białek [50 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 2,5 mmol/l EDTA pH 8,0, 150 mmol/l NaCl, 1/1000 IGPAL ( v/v), 10% glicerol (v/v), 7% 2-merkaptoetanol (v/v), 1 mmol/l PMSF i 1x koktajl inhibitorów proteinaz (Roche)]. Ekstrakt białkowy zastosowano następnie do rozdziału PAGE i analizy immunoblot z przeciwciałami przeciwko GFP (Roche, rozcieńczenie: 1/1000) i FLAG (Abcam, rozcieńczenie: 1/2000). Obrazy wykonano przy użyciu systemu analizy chemiluminescencji Tanon 5200.

3|WYNIKI

3.1|Mutant rpx1 Arabidopsis ma zwiększoną odporność na P. xylostella

Aby zidentyfikować geny odpowiedzialne za oporność na P. xylostella, zebraliśmy 179 mutantów Arabidopsis i hodowaliśmy je w kontrolowanej szklarni. Dwa tygodnie po przeszczepieniu przeprowadziliśmy test preferencji larw P. xylostella w trzecim stadium, w odpowiedzi na każdy zmutowany i dziki typ Col-0. W tym eksperymencie przesiewowym 15 mutantów wykazało różny wpływ na preferencje larw (dane nie pokazane), a jeden z nich został wybrany do tego badania i oznaczony jako rpx1-1 (oporność na P. xylostella). RPX1 koduje nowe białko wiążące czapeczkę (nCBP) (Ruud i in., 1998). Mutantem insercyjnym T-DNA był SALK_131503, a ekspresja genu RPX1 została znacznie obniżona w porównaniu z Col-0 typu dzikiego (Rysunek 1a, Informacje uzupełniające: Rysunek S1a, Informacje uzupełniające: Tabela S1). Posadzone w pobliżu rośliny rpx1-1 wykazywały znacznie niższy poziom uszkodzeń przez larwy P.xylostella w porównaniu z roślinami typu dzikiego (Informacje dodatkowe: rysunek S1b).

FIGURA 1 Inaktywacja RPX1 nadaje oporność na Plutella xylostella u Arabidopsis. (a) Struktura genu RPX1 (At5g18110). Pomarańczowe prostokąty wskazują eksony, a linie ciągłe przedstawiają introny i regiony nie podlegające translacji. Insercja T-DNA w SALK_131503, nazwana rpx1-1, znajduje się na czwartym eksonie. (b) Larwy P. xylostella preferencyjnie przemieszczają się w kierunku linii komplementacyjnych Col-0 typu dzikiego i RPX1 (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1com) w porównaniu do rpx1-1. (c) Porównanie Col- Liście 0, rpx1-1 i RPX1com zakażone P. xylostella. (d) Larwy P. xylostella były poważnie dotknięte przez rpx1-1 w porównaniu z larwami na liniach Col-0 typu dzikiego i RPX1com, pod względem wzrostu, wielkości i koloru larw. (e, f) Larwy P. xylostella karmione rpx1-1 wykazują wyższą śmiertelność (e) i niższy wskaźnik przepoczwarzania (f) w porównaniu z liniami Col-0 i RPX1com typu dzikiego. (g, h) Larwy P. xylostella karmione roślinami rpx1-1 mają zwiększoną aktywność S-transferazy glutationowej (GST, g) i cytochromu P450 (CYP450, h), podczas gdy u larw karmionych RPX1com aktywność nie różniła się od tych na Col-0. W (b, e–h) dane przedstawiono jako średnią ± sem. Różne litery przy każdym zabiegu wskazują na istotną różnicę (jednokierunkowa analiza wariancji, n=3 dla b, g, h, n {{ 36}} dla e, f).

Aby określić mechanizm leżący u podstaw oporności rpx1-1 na inwazję P. xylostella, przeprowadziliśmy testy preferencji i braku wyboru. W eksperymentach preferencji larwy P. xylostella umieszczono na środku szklanej probówki, w równej odległości od sadzonek Col-0 i rpx1-1, po 10–6{{11} } min, po stronie Col-0 zebrało się znacznie więcej larw niż po stronie rpx1-1 (Rysunek 1b). W eksperymentach bez wyboru karmiliśmy oddzielnie siewki Col-0 i rpx1-1 larwom P. xylostella i zaobserwowaliśmy, że Col-0 stracił więcej tkanek liści niż mutant rpx1-1 (ryc. 1c). Aby potwierdzić, że RPX1 był genem sprawczym obserwowanej oporności, wprowadziliśmy konstrukt komplementacyjny RPX1 do mutanta rpx1-1. Te linie komplementacji RPX1 (RPX1pro: RPX1/rpx1-1, RPX1com) były podatne na inwazję P. xylostella, jak określono w testach preferencji i braku wyboru (ryc. 1b, c), które sugerują, że RPX1 bierze udział w oporności Arabidopsis na P.xylostella.

3.2|Mutacja rpx1-1 negatywnie wpływa na wzrost larw P. xylostella

Aby zbadać reakcję fizjologiczną P. xylostella na żerowanie mutantami rpx1-1, sprawdziliśmy rozwój larw po karmieniu 3-tygodniowymi roślinami linii Col-0, rpx1-1 i RPX1com. Larwy karmione roślinami rpx1-1 wykazywały poważnie upośledzony rozwój pod względem wielkości ciała. Kolor ciała larw był również inny niż u larw karmionych roślinami Col-0. Nie zaobserwowaliśmy jednak takich zmian u larw karmionych sadzonkami RPX1com (ryc. 1d). Dalsza analiza fenotypowa wykazała, że ​​larwy P. xylostella karmione rpx1-1 charakteryzowały się znacznie wyższą śmiertelnością i niższym wskaźnikiem przepoczwarzenia niż larwy karmione Col-0 lub RPX1com (ryc. 1e, f). Ponadto larwy karmione rpx1-1 wykazywały wyższą aktywność enzymatyczną GST i CYP450, które są biomarkerami uszkodzenia narządów lub tkanek (Cheng i in., 2018; Mikstacki i in., 2015), niż larwy na Col-0 i RPX1com (ryc. 1g, h), co sugeruje, że tkanka larwalna może zostać uszkodzona przez żerowanie rpx1-1.

3.3|Jelito środkowe larw P. xylostella ulega uszkodzeniu po żerowaniu roślinami rpx1-1

Zaobserwowaliśmy, że larwy karmione rpx1-1 zjadały mniej tkanek roślinnych i wytwarzały znacznie mniej odchodów niż larwy karmione Col-0 typu dzikiego; dlatego postawiliśmy hipotezę, że może to mieć wpływ na trawienie larw karmionych rpx1-1. Aby sprawdzić, czy w jelitach larw karmionych rpx1-1 nastąpił wyciek, przeprowadziliśmy „test Smerfa”. Larwy karmione dzikimi liniami Col-0 i RPX1com wypróżniły barwnik i w ciele larwy nie pozostał żaden barwnik, podczas gdy larwy karmione rpx1-1 zachowały znaczną ilość barwnika w organizmie jelito środkowe i otaczające je tkanki, a larwy zmieniły kolor na niebieski (ryc. 2a). Ilościowa analiza larw niebieskich („Smurf”) i normalnych („bez Smerfów”) wykazała, że ​​żerowanie roślin rpx1-1 spowodowało, że u osobników stwierdzono ponad trzykrotnie występowanie „Smerfa” w porównaniu z osobnikami karmionymi Col-{{ 14}} lub RPX1com (rysunek 2b). Wyniki te sugerują, że żerowanie rpx1-1 może powodować uszkodzenia i większą przepuszczalność jelita środkowego larw.

3.4|Macierz perytroficzna P. xylostella ulega uszkodzeniu w wyniku żerowania sadzonek rpx1-1

Następnie wypreparowaliśmy i wyizolowaliśmy macierz peritroficzną (PM) z larw karmionych sadzonkami Col-{{0}}, rpx1-1 i RPX1com do analizy strukturalnej pod mikroskopem stereoskopowym. W porównaniu z nienaruszonym i pionowym PM larw karmionych Col-0 i RPX1com, larwy karmione rpx1-1 wykazywały cechy uszkodzeń i były cienkie, luźne i nieciągłe (ryc. 2c – f). Aby dodatkowo potwierdzić charakterystykę uszkodzeń PM, uzyskaliśmy przekroje poprzeczne próbek larw. Wyniki barwienia hematoksyliną-eozyną (HE) wykazały, że PM larw karmionych Col-0 był gruby i nienaruszony oraz że pomiędzy PM a komórkami naskórka środkowego jelita istniała przestrzeń ektoperitroficzna (ryc. 2g). Natomiast PM w jelicie środkowym larw karmionych rpx1-1 zostało poważnie zakłócone, a zawartość jelit znajdowała się blisko ściany jelita (brak es, ryc. 2h). Kiedy larwy karmiono sadzonkami RPX1com, ich PM i ES nie uległy znaczącym zmianom (ryc. 2i, j). Wyniki te potwierdzają, że knockdown RPX1 szkodzi PM larw P. xylostella.

3,5|Nagromadzenie zawartości DMNT w rpx1-1 nadaje odporność na larwy P. xylostella

Aby zbadać, czy zniszczenie RPX1 zmienia kształt metabolitów Arabidopsis i prowadzi do oporności na larwy P. xylostella, porównaliśmy lotne związki organiczne (LZO) uwalniane z roślin rpx1-1 i roślin Col-0 typu dzikiego. Cztery LZO (heksanol, 3-etylo-5metyl, oktanan, 2,6-dimetyl, Nonan, 2,6-dimetyl i DMNT) akumulowały się w różny sposób pomiędzy rpx1-1 i Col-0 (Rysunek 3a). Aby dokładniej zbadać mechanizm molekularny rpx1-1 w oporności P. xylostella, przeprowadziliśmy analizę RNA-seq. W porównaniu z Col-0, mutant rpx1-1 wykazywał 211 genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) (informacje dodatkowe: zestaw danych S1). Analiza wzbogacenia KEGG wykazała, że ​​te DEG należały do ​​ponad 20 różnych szlaków metabolicznych, w tym biosyntezy seskwiterpenoidów i triterpenoidów, metabolizmu kwasu alfa-linolenowego i szlaków metabolizmu tyrozyny (Rysunek 3b, Informacje uzupełniające: Tabela S2). Warto zauważyć, że najbardziej wzbogaconym szlakiem była biosynteza seskwiterpenoidów i triterpenoidów, która składała się z trzech DEG: At4g15340, At5g42600 i At5g48010 (rysunek 3b, informacje uzupełniające: rysunek S2a – c). Doniesiono, że At4g15340 koduje PEN1, cyklazę oksydoskwalenu, która przekształca 2,3-oksydoskwalen w arabidiol i prowadzi do syntezy bioaktywnego DMNT poprzez CYP705A1 (Field i Osbourn, 2008; Sohrabi i in., 2015). At5g42600 koduje syntazę mineralną 1 (MRN1), która jest kluczowym składnikiem biosyntezy minerałów. At5g48010 koduje syntazę talianolu (THAS), enzym biorący udział w biosyntezie talianolu. Donoszono, że marneral i talianol biorą udział w utrzymaniu rozwoju roślin (Field i Osbourn, 2008; Go i in., 2012) (Informacje dodatkowe: Rysunek S3). Zbadaliśmy potencjalną rolę MRN1 i THAS w oporności owadów, badając preferencje, śmiertelność i wskaźniki przepoczwarzenia P. xylostella poprzez karmienie ich transgenicznymi sadzonkami Arabidopsis z nadekspresją MRN1 (35Spro: MRN1) i THAS (35Spro: THAS) (wsparcie Informacje: Rysunek S4a,b). Nie wykryto istotnej różnicy między dwoma transgenami a Col-0 typu dzikiego (informacje uzupełniające: rysunek S4c – n), co sugeruje, że oporność owadów rpx1-1 prawdopodobnie nie jest zależna od tych dwóch genów.

FIGURA 2 Inaktywacja RPX1 uszkadza strukturę macierzy peritroficznej (PM) w jelicie środkowym larw. (a) Reprezentatywne obrazy larw karmionych liniami Col-0, rpx1-1 i RPX1com, wykazujące zatrzymywanie barwnika, o czym świadczy ich niebieski wygląd, jak postać z kreskówki Smerf. (b) Kwantyfikację wyników pokazano w (a). Dane przedstawiono jako średnią ± sem; różne litery wskazują na znaczącą różnicę (jednokierunkowa analiza wariancji, n=6). (c – f) Ultrastruktura PM larw karmionych liniami Col-0 (c), rpx1-1 (d) i RPX1com (e, f). Należy zauważyć, że PM larw karmionych Col-0 i RPX1com jest pulchny i ​​nienaruszony, ale PM larw karmionych rpx1-1 jest cienki, delikatny i nieciągły w niektórych regionach. (g – j) Przekrój poprzeczny i barwienie hematoksyliną-eozyną pokazują uszkodzenie PM z larw karmionych liniami Col-0 (g), rpx1-1 (h) lub RPX1com (i, j). [Kolorową figurę można obejrzeć na stronie wileyonlinelibrary.com]

Wzbogacenie biosyntezy terpenoidów w analizie KEGG (ryc. 3b) i zróżnicowana akumulacja DMNT wykryta w rpx1-1 (ryc. 3a) sugerują, że DMNT może być jednym ze związków zaangażowanych w odporność roślin na P. xylostella. Podobnie jak w poprzednich raportach, w których ledwo wykryto DMNT za pomocą analizy GC-MS w Col-0 (Liu i in., 2018; Sohrabi i in., 2015), mogliśmy wykryć śladowe ilości DMNT w niezakażonych Col-0 (Rysunek 4a, b). Natomiast poziomy DMNT były silnie wzbogacone (~8 ng/g) w rpx1-1, a linie RPX1com wykazywały bardzo niski poziom DMNT, podobny do tego w roślinach Col-0 (Rysunek 4). Ponadto po inwazji P. xylostella poziom DMNT wzrósł (~20 ng/g) w rpx1-1, co było wyższe niż w liniach Col-0 i RPX1com (Rysunek 4). . Zsyntetyzowaliśmy DMNT in vitro, stosując zmodyfikowaną metodę (Chen i in., 2021). Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami (Chen i wsp., 2021), DMNT hamował wzrost P. xylostella, o czym świadczy preferencja (2,5 μmol/l) i działanie bez wyboru (0,25–25 μmol/l) ( Informacje dodatkowe: Rysunek S5a,b). Co więcej, wyniki barwienia HE ujawniły, że PM larw kontrolnych był gęsty i nienaruszony (informacje uzupełniające: Rysunek S5c), podczas gdy PM larw traktowanych 2,5 μmol/l DMNT przez 48 godzin był cienki i nieciągły w niektórych regionach (Informacje uzupełniające: Rysunek S5d). Podsumowując, nasze odkrycia sugerują, że mutacja rpx1-1 powoduje akumulację DMNT, co przyczynia się do zabijania larw P. xylostella u Arabidopsis. JA i SA to roślinne metabolity wtórne, które są ściśle związane ze stresem biotycznym. Aby określić, czy substancje te przyczyniają się do odporności rpx1-1 na owady, sprawdziliśmy poziomy Col-0 i rpx1-1 JA i SA przed i po zakażeniu P. xylostella. W warunkach nietraktowanych nie było znaczącej różnicy w poziomach JA i SA między roślinami rpx1-1 i Col-0 (informacje uzupełniające: Rysunek S6), a poziomy obu hormonów znacząco wzrosły po 24 godzinach od zakażenia P. xylostella . Warto zauważyć, że po porażeniu zawartość SA była znacznie niższa w rpx1-1 w porównaniu z Col-0, podczas gdy zawartość JA była znacznie wyższa w rpx1-1 niż w Col-0 (Informacje dodatkowe: Rysunek S6).

RYSUNEK 3 Porównanie lotnych związków i ekspresji genów wzbogaconej w różny sposób pomiędzy Col-0 i rpx1-1. (a) Różnie wzbogacone lotne związki w Col-0 i rpx1-1 wykryto metodą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS). Dane przedstawiono jako średnią ± sem; gwiazdki wskazują znaczącą różnicę (*p < 0.05, **p < 0.01, dwustronny niesparowany test t). (b) Analiza transkryptomiczna Col-0 i rpx1-1. Analiza KEGG wzbogacenia szlaku z genów o różnej ekspresji pomiędzy Col-0 i mutantem rpx1-1. Jeden wzbogacony szlak (czerwona strzałka) jest związany z biosyntezą seskwiterpenoidów i triterpenoidów i składa się z trzech genów, jak pokazano na rysunku. [Kolorową figurę można obejrzeć na stronie wileyonlinelibrary.com]

3,6|RPX1 reguluje akumulację DMNT w zależności od PEN1

Aby zbadać udział PEN1 w akumulacji DMNT regulowanej przez rpx1-1, wygenerowaliśmy konstrukt zawierający sztuczne miRNA (PEN1amiR) i przekształciliśmy go w mutanty rpx1-1. Wygenerowaliśmy także konstrukt nadekspresji PEN1, który został przekształcony w Col-0 (35pro: PEN1/Col-{{10}}). Analiza ekspresji genów wykazała, że ​​PEN1 został obniżony (4-7 razy) w PEN1amiR/rpx1-1 w porównaniu z rpx1-1 i uległ nadekspresji (~2,5 razy) w 35Spro: PEN1 w porównaniu z Col-0 (Rysunek 5a). W tych liniach transgenicznych na ekspresję RPX1 nie miał wpływu knockdown ani nadekspresja PEN1 (Figura 5b). Po porażeniu P. xylostella przez 6-24 godziny, ekspresja PEN1 została znacząco zwiększona w Col-0 i rpx1-1, a znacznie wyższą ekspresję PEN1 uzyskano w rpx1-1 po 24 godzinach od porażenia (ryc. 5c) . Następnie zmierzyliśmy zawartość DMNT w Col-0, rpx1-1, PEN1amiR/rpx1-1 i 35Spro: PEN1/Col-{{50}}. Bez inwazji P. xylostella, rpx1-1 wytwarzał wyższy poziom DMNT niż Col-0 (ryc. 5d, e, f, k, l), a gdy PEN1 został znokautowany przez sztuczne mikroRNA w rpx1-1 (PEN1amiR /rpx1-1), poziomy DMNT zostały obniżone, wykazując znacznie niższy poziom niż w rpx1-1 (Rysunek 5d, g, h, m, n). Po inwazji larw poziom DMNT w siewkach Col-0 i rpx1-1 uległ znacznemu zwiększeniu, ale w siewkach PEN1amiR/rpx1-1 poziom DMNT nie mógł zostać wywołany i był znacznie niższy niż w rpx1-1 (Rysunek 5d, g, h, m, n), co sugeruje, że PEN1 może odgrywać ważną rolę w biosyntezie DMNT regulowanej przez RPX1, jak pokazano w informacjach uzupełniających: rysunek S3. Zgodnie z tym, DMNT był silnie akumulowany w sadzonkach 35Spro: PEN1/Col-0 (ryc. 5d, i,j,o,p).

RYCINA 4 Utrata RPX1 zwiększa akumulację dimetylo-1,3,7-nonatrienu (DMNT). (a) analiza DMNT za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) w liniach Col-0, rpx1-1 i RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1). Standard DMNT pokazano na dole. (b) Całkowita chromatografia jonowa (TIC) DMNT wychwyconego z Col-0, rpx1-1 i RPX1com. (c) Zawartość DMNT wzrasta w mutancie rpx1-1, ale powraca do poziomu typu dzikiego w roślinach transgenicznych RPX1com. Dane przedstawiono jako średnią ± sem; różne litery wskazują na znaczącą różnicę (jednokierunkowa analiza wariancji, n=3). [Kolorową figurę można obejrzeć na stronie wileyonlinelibrary.com]

3,7|PEN1 przyczynia się do zabijania P. xylostella w rpx1-1

Biorąc pod uwagę obserwację, że knockdown PEN1 może osłabić akumulację DMNT indukowaną przez inaktywację RPX1 (ryc. 5), przeprowadziliśmy testy biologiczne na transgenicznym Arabidopsis z nokautem PEN1 i nadekspresją, aby wykazać jego rolę biologiczną. Odkryliśmy, że larwy P. xylostella nie wykazywały preferencji dla roślin amiR-PEN1/rpx1-1 w porównaniu z Col-0 (informacje dodatkowe: Rysunek S7). Tymczasem larwy P. xylostella karmione PEN1-amiR/rpx1-1 wykazywały znacznie niższą śmiertelność i wyższy współczynnik przepoczwarzania niż rpx1-1, podczas gdy larwy karmione 35Spro: PEN1/Col-0 wykazywały wyższą śmiertelność i mniejsze przepoczwarczenie niż te karmione Col-0 (Rysunek 6a, b). Zgodnie z tymi wynikami, dalsze „test Smurfa” i eksperymenty z transsekcją wykazały, że PEN1-amiR/rpx1-1 miał normalne i nienaruszone jelita i PM w porównaniu z larwami karmionymi rpx1-1 (Rysunek 6c, d, g, h), a nadekspresja PEN1 spowodowała poważne uszkodzenie jelita środkowego i PM larw P. xylostella (ryc. 6c, d, i, j). Wyniki te sugerują, że wyłączenie PEN1 może stłumić negatywny wpływ na wzrost larw spowodowany inaktywacją RPX1, odgrywając w ten sposób ważną rolę w toksycznym wpływie rpx1-1- na larwy P. xylostella.

3,8|DMNT transportuje z korzeni do nadziemnych części Arabidopsis 

Donoszono, że PEN1 ulega ekspresji głównie w korzeniach Arabidopsis (AC Huang i in., 2019; Sohrabi i in., 2015) (Informacje uzupełniające: Rysunek S8a), co różni się od wyników, które wykazały nadziemne części rpx1-1 toksyczność dla P. xylostella w sposób zależny od PEN1 (ryc. 6). Dlatego sformułowaliśmy hipotezę alternatywną: rośliny syntetyzują DMNT głównie w korzeniach i transportują go do części nadziemnych, gdzie sprzyja odporności na owady. Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadziliśmy dwa testy transportu DMNT. W pierwszym teście (ryc. 7a) inkubowaliśmy korzenie 3-3-tygodniowych sadzonek Arabidopsis w płynnej pożywce wzrostowej dla roślin zawierającej 2,5 μmol/l DMNT, stosując DMSO jako kontrolę. Po 24-godzinnej hodowli wycięliśmy liście Arabidopsis i podaliśmy je larwom P. xylostella. W porównaniu z kontrolą DMSO, liście roślin traktowanych DMNT powodowały znacznie wyższą śmiertelność larw i niższe wskaźniki przepoczwarzenia niż kontrola (Rysunek 7b, c). W drugim eksperymencie mającym na celu dalszą niezależną walidację transportu DMNT, znakowaliśmy DMNT 2H i dodaliśmy DMNT-2H do płynnej pożywki wzrostowej dla roślin. Po 24 godzinach inkubacji DMNT-2H był silnie wzbogacony w liściach (ryc. 7d – i). Aby wykluczyć możliwość ulatniania się DMNT z płynnego podłoża wzrostowego do powietrza i skażenia nadziemnych części roślin, przeprowadziliśmy kontrolę równoległą, którą przeprowadzono w taki sam sposób jak na ryc. 7a, z tą różnicą, że korzenie Arabidopsis nie były zanurzane w płynie podłoże wzrostowe. Wyniki pokazały, że w nadziemnych częściach roślin nie wykryto DMNT-2H (informacje dodatkowe: rysunek S8b, c). Dlatego proponujemy, aby DMNT przemieszczał się z korzeni, gdzie jest wytwarzany, do liści Arabidopsis, gdzie powoduje śmierć szkodników.

RYSUNEK 5 PEN1 odgrywa ważną rolę w akumulacji dimetylo-1,3,7-nonatrienu (DMNT) w rpx1-1. (a) Analiza ekspresji PEN1 w Col-0, rpx1-1, knockdown PEN1 w tle rpx1-1 (PEN1-amiR/rpx1-1) i nadekspresji PEN1 (35Spro:PEN1/Col-{{2{{ 22}}}}) linie. (b) Wyrażenie RPX1 w Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 i 35Spro:PEN1/Col-0. (c) Ekspresja PEN1 jest indukowana przez inwazję Plutella xylostella w Col-0 i rpx1-1. (d) Porównanie akumulacji DMNT pomiędzy Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 i 35Spro:PEN1/Col-0. (e–j) chromatografia gazowa – spektrometria mas (GC-MS) analiza substancji lotnych emitowanych z Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) i 35Spro: linie PEN1/Col-0 (i, j). (k – p) TIC DMNT przechwycone z linii Col-0 (k), rpx1-1 (l), PEN1-amiR/rpx1-1 (m, n) i 35Spro: linie PEN1/Col-0 (o, p) , odpowiadające danym w (e – j). W (a – d) dane przedstawiono jako średnią ± sem; różne litery wskazują na znaczącą różnicę (jednokierunkowa analiza wariancji, n=3). [Kolorową figurę można obejrzeć na stronie wileyonlinelibrary.com]

3,9|RPX1 ulega degradacji w wyniku inwazji P. xylostella i leczenia ran

Pokazaliśmy, że ekspresja PEN1 została zwiększona w sadzonkach rpx1-1 i Arabidopsis zakażonych larwami P. xylostella (ryc. 5a, c), co zwiększa możliwość, że RPX1 może również reagować na inwazję larw. Aby potwierdzić tę prognozę, zbadaliśmy potencjalną reakcję RPX1 na inwazję P. xylostella. Analiza ekspresji genów wykazała, że ​​RPX1 ulegał ekspresji w różnych tkankach (informacje uzupełniające: rysunek S9a), ale nie miał znaczącej odpowiedzi na inwazję larw trwającą 6–24 godzin (informacje uzupełniające: rysunek S9b). Dlatego sprawdziliśmy poziomy białka RPX1 w roślinach transgenicznych RPX1pro: RPX1-GFP, wykonując immunoblot. Wyniki pokazały, że bez inwazji larw RPX1-GFP był stabilny przez 0-12{{40}} min; przeciwnie, po inwazji larw przez 15 minut, RPX1-GFP zaczął ulegać degradacji; po 120 minutach poziom białka RPX1-GFP spada w sposób ciągły do ​​około 6% punktu początkowego (Rysunek 8a, Informacje dodatkowe: Rysunek S10a). Jako kontrolę, w siewkach Arabidopsis zawierających transgen GFP, GFP był stosunkowo stabilny po inwazji larw (Figura 8b). Aby wykluczyć możliwy wpływ znacznika GFP na stabilność RPX1, wygenerowaliśmy transgeniczne rośliny RPX1 ze znacznikiem FLAG (35Spro: RPX1-FLAG) w celu przeprowadzenia eksperymentów z inwazją larw, które wykazały spójne wyniki, że RPX1-FLAG może być również degradowany przez larwy inwazja, podobna do RPX1-GFP (ryc. 8c). Inwazja owadów często powoduje zranienia roślin, a uszkodzenia fizyczne mogą częściowo symulować proces żerowania owadów roślinożernych. Aby wykazać, czy zranienie może wywołać degradację RPX1, użyliśmy igły do ​​utworzenia dziur w liściach roślin, aby imitować zranienie, i odkryliśmy, że RPX1-GFP uległ degradacji po 30 minutach zabiegów (Rysunek 8d, Informacje dodatkowe: Rysunek S10b). Aby lepiej zrozumieć przyczynę degradacji RPX1 po inwazji P. xylostella, inkubowaliśmy tkanki roślin transgenicznych RPX1-GFP razem w roztworze przez 15 minut z tkankami Col-0, które zostały zakażone P. xylostella przez 15–120 minut lub tkanki Col-0 bez porażenia. Analiza immunoblottingu wykazała, że ​​poziom RPX1-GFP w próbkach inkubowanych z wstępnie zakażoną Col-0 był znacznie niższy niż w próbkach z niezakażoną Col-0 (ryc. 8e), co sugeruje, że inwazja P. xylostella indukowała pewne czynniki lub sygnały w Col-0 co może prowadzić do degradacji RPX1.

3.10|Mutacja rpx1-1 zapewnia przewagę w rozwoju i rozmnażaniu roślin

Wspólną cechą reakcji obronnych specyficznych dla roślinożerców jest kompromis pomiędzy odpornością na szkodniki a wzrostem i rozmnażaniem roślin (Li i in., 2018). Aby ustalić, czy genotyp w locus RPX1 podlega takim kompromisom, porównaliśmy produkcję nasion u mutantów Col-{{10}} i rpx1-1. W przypadku braku inwazji P. xylostella, plon nasion na roślinę był podobny w przypadku obu genotypów (informacje uzupełniające: rysunek S11). Dla kontrastu, wystawienie 3-tygodniowych roślin rpx1-1 i Col-0 na inwazję P. xylostella w 15. stadium rozwoju tylko przez 72 godziny zmniejszyło końcowy plon nasion Col-0 trzykrotnie, podczas gdy plon nasion w rpx1-1 nie był znacząco zmieniony. Co więcej, plon nasion RPX1com był podobny do plonu Col-0, ale znacznie niższy niż rpx1-1, co sugeruje, że inaktywacja RPX1 zapewnia przewagę w produkcji nasion w przypadku inwazji larw (Informacje dodatkowe: rysunek S11). Oceniliśmy także produkcję nasion u 35Spro: transgenicznego Arabidopsis PEN1 i zaobserwowaliśmy, że nadekspresja PEN1 dawała wyższy plon nasion zarówno w warunkach porażonych larwami, jak i niezarażonych (Informacje uzupełniające: Rysunek S11). Wyniki te sugerują, że mutacja rpx1-1 i wyższa ekspresja PEN1 nadają oporność na P. xylostella przy braku typowo powiązanego kompromisu w zakresie wzrostu, co podkreśla potencjał RPX1 i PEN1 w programach hodowli molekularnej mających na celu poprawę produkcji roślinnej.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

4|DYSKUSJA

Szkodniki drastycznie obniżają plony i jakość agronomiczną, czyniąc ochronę roślin priorytetem i długoterminowym celem rolników i hodowców. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy mutanta Arabidopsis rpx1-1, który wykazywał wysoką odporność na P. xylostella, ważnego szkodnika roślin uprawnych z rzędu Lepidoptera. Nasza analiza wykazała, że ​​mutacja rpx1-1 skutkowała wyższym poziomem transkryptu PEN1, akumulacją DMNT i zwiększoną odpornością roślin na szkodniki. Pokazaliśmy również, że białko RPX1 może ulec degradacji w wyniku inwazji larw i leczenia ran.

RYSUNEK 6 PEN1 przyczynia się do zwiększonej odporności rpx1-1 na Plutella xylostella. (a, b) Transgen PEN1-amiR znacząco łagodzi oporność rpx1-1 na inwazję P. xylostella, podczas gdy 35Spro: PEN1 wzmaga efekt oporności, o czym świadczy śmiertelność (a) i przepoczwarzenie (b) larw P. xylostella . (c) Reprezentatywne obrazy larw karmionych Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 i 35Spro: Sadzonki PEN1 wykazujące trwałość barwnika, o czym świadczy ich niebieski wygląd, jak w kreskówce Smerf postać. (d) Wyniki kwantyfikacji obrazów pokazanych w (c). (e – j) Przekrój poprzeczny i barwienie hematoksyliną-eozyną pokazują uszkodzenie PM z larw karmionych Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) i 35Spro: sadzonki PEN1 (i, j). Dane przedstawiono jako średnią ± sem; różne litery przy każdym zabiegu wskazują znaczącą różnicę w (a, b, d) (jednokierunkowa analiza wariancji, n=6). [Kolorową figurę można obejrzeć na stronie wileyonlinelibrary.com]

W testach bez wyboru mutant rpx1-1 wykazywał znaczną odporność na inwazję P. xylostella (ryc. 1c). I odwrotnie, larwy P. xylostella karmione roślinami rpx1-1 wykazywały poważne negatywne zaburzenia rozwojowe (ryc. 1d, e). Fenotypy te można przypisać inaktywacji RPX1, ponieważ linie komplementacji RPX1 (RPX1com) są tak samo podatne jak Col-0 typu dzikiego (ryc. 1c – e), co potwierdza wniosek, że RPX1 bierze udział w oporności szkodników. Oprócz zabijania larw, mutant rpx1-1 miał również długoterminowy wpływ na rozwój larw, w tym na przepoczwarzenie (ryc. 1f), prowadząc do ograniczenia reprodukcji szkodnika.

RYSUNEK 7 Dimetylo-1,3,7-nonatrien (DMNT) transportuje się z korzeni Arabidopsis do liści. (a) Ilustracja testu transportu DMNT przy użyciu sadzonek Arabidopsis. DMNT rozpuszczono w płynnym podłożu Murashige i Skoog. Po 24-godzinnej hodowli wycięto korzenie, a liście wykorzystano do karmienia larw Plutella xylostella w celu oceny śmiertelności i szybkości przepoczwarzania. (b, c) DMNT transportowany z korzeni do liści powoduje wyższą śmiertelność (b) i niższy wskaźnik przepoczwarzania (c) larw P. xylostella. (d–f) DMNT znakowany 2H (DMNT-2H) jest transportowany z korzenia do liści. DMNT-2H rozpuszczono w płynnej pożywce MS jak w (a) przez 24 godziny, a następnie zebrano liście do analizy GC-MS (e). Jako kontrolę zastosowano DMSO (d). W celach informacyjnych pokazano normę DMNT-2H (f). (g–i) TIC DMNT-2H otrzymany podczas testów transportowych przedstawionych w (d–f). Dane przedstawiono jako średnią ± sem, w (b, c) n=6, wartości p pokazano obok kolumn histogramu, aby wskazać istotną różnicę (dwustronny test t niesparowany). Należy zauważyć, że więcej kontroli dla testów transportu uwzględniono w informacjach uzupełniających: Rysunek S8. [Kolorową figurę można obejrzeć na stronie wileyonlinelibrary.com]

Co więcej, testy preferencji wykazały, że mutanty Col-{0}} i rpx1-1 typu dzikiego mogą emitować różne lotne związki; jednym z nich jest DMNT, który skutecznie odstrasza szkodniki (ryc. 1b, 3a, informacje dodatkowe: rys. S5a). Na podstawie powyższych wyników sugerujemy, że akumulacja DMNT w rpx1-1 jest jedną z przyczyn zatruć owadami. Donoszono, że szlaki sygnałowe JA i SA biorą udział w oporności owadów (Costarelli i in., 2020; Lortzing i Steppuhn, 2016). W tym badaniu po 24 godzinach żerowania owadów zawartość JA i SA zarówno w mutantach Col-0, jak i rpx1-1 wzrosła, a wzrost zawartości SA w rpx1-1 był znacznie niższy niż w Col-0, natomiast wzrost zawartości JA był znacznie wyższy (informacje uzupełniające: rysunek S6), co sugeruje, że JA i SA mogą również odgrywać ważną rolę w oporności rpx1-1 na P. xylostella. Dlatego proponujemy, aby zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie działanie rpx1-1 przyczyniały się do zwiększonej odporności Arabidopsis na owady.

FIGURA 8 Degradacja białka RPX1 jest indukowana przez inwazję Plutella xylostella i leczenie ran. (a) RPX1-GFP z RPX1pro: Rośliny transgeniczne RPX1-GFP ulegają degradacji pod wpływem inwazji P. xylostella przez 15-120 min. (b) Jako kontrola (a), sam GFP z 35Spro: Rośliny transgeniczne GFP nie wykazują degradacji po inwazji larw. (c) Flaga RPX1 z 35Spro: Rośliny transgeniczne flagą RPX1 ulegają degradacji w wyniku inwazji larw. (d) RPX1-GFP z RPX1pro: Rośliny transgeniczne RPX1-GFP ulegają degradacji w ciągu 15-120 minut leczenia ran. (e) RPX1-GFP z RPX1pro: Rośliny transgeniczne RPX1-GFP ulegają degradacji, gdy tkanki inkubuje się w roztworze z tkankami roślin Col-0, które zostały zakażone P. xylostella przez 15-120 minut. Wartości poniżej pasm immunoblottingu pokazują względną obfitość białka oznaczoną ilościowo za pomocą ImageJ. Wszystkie te eksperymenty powtórzono co najmniej trzy razy i przedstawiono reprezentatywne wyniki. Więcej danych eksperymentalnych z niezależnymi liniami transgenicznymi pokazano w informacjach uzupełniających: Rysunek S10. [Kolorową figurę można obejrzeć na stronie wileyonlinelibrary.com]

Przedstawiamy kilka dowodów pokazujących, w jaki sposób akumulacja DMNT za pośrednictwem PEN{0}} przyczynia się do funkcji RPX1 w odporności roślin na P. xylostella. PEN1, kluczowy gen należący do szlaku biosyntezy seskwiterpenoidów i triterpenoidów, zidentyfikowano na podstawie analizy KEGG danych seq RNA mutanta rpx1-1 (ryc. 3b), zapewniając powiązanie między RPX1, PEN1 i DMNT (Sohrabi i in. , 2015). Na poparcie DMNT jako jednego ze związków sprawczych zabijających larwy szkodników, DMNT akumulował się w większej ilości w mutantach rpx1-1 niż w Col-0 (Rysunek 3a), ale poziom w liniach RPX1com został odwrócony do Col-0 (Rysunek 3a). Rysunek 4a–c). Ponadto chemicznie syntetyzowany DMNT może odstraszyć i zabić larwy P. xylostella (Informacje dodatkowe: Rysunek S5a, b), co jest zgodne z wynikami rpx1-1 (Rysunek 1b, e). Co więcej, rośliny transgeniczne z nadekspresją PEN1 wytwarzały ponad czterokrotność DMNT w Col-0 i nadawały podobną oporność na P. xylostella jak rpx1-1 (ryc. 5d, i,j,o,p i 6).

Co ważne, zmniejszenie poziomu transkryptu PEN1 w rpx1-1 blokuje biosyntezę DMNT (ryc. 5d, g, h, m, n) i łagodzi efekt zabijania larw P. xylostella, które są podatne na inwazję P. xylostella (ryc. 6a, b ). Te połączone wyniki wskazują, że mutacja PEN1 może tłumić funkcję inaktywacji RPX1 w odporności szkodników. Uszkodzenie RPX1 powoduje większą obfitość PEN1 (ryc. 5a), niemniej jednak to, jak dokładnie RPX1 reguluje PEN1 i pośredniczy w biosyntezie DMNT, wymaga dalszych badań. Ponieważ przewiduje się, że RPX1 jest nowym białkiem wiążącym czapeczkę, należącym do rodziny eIF4E (Rhoads, 2009; Ruud i in., 1998), możliwe jest, że RPX1 może wpływać na PEN1 poprzez wpływ na jego stabilność mRNA lub wydajność translacji białka, co będzie ważnym czynnikiem temat w przyszłych badaniach. Co więcej, należy zauważyć, że poziomy DMNT mogą nadal być indukowane do wyższego poziomu przez inwazję P. xylostella w mutancie rpx1-1 (ryc. 5d), co sugeruje, że mogą istnieć inne szlaki regulujące akumulację DMNT niezależne od RPX1. DMNT wykryto w wielu gatunkach roślin, takich jak Arabidopsis (Sohrabi i in., 2015), bawełna (Liu i in., 2018) i kukurydza (Richter i in., 2016). Ponadto zapewnia pośrednią ochronę przed szkodnikami roślinożernymi, wabiąc drapieżniki, umożliwiając roślinom usuwanie zagrożeń ze strony szkodników (Kappers i in., 2005; Lee i in., 2010; Li i in., 2018). Niedawno donieśliśmy, że może odstraszyć i zabić larwy P. xylostella poprzez uszkodzenie PM w jelicie środkowym larwy (Chen i in., 2021). Tutaj odkryliśmy, że struktura PM może zostać poważnie uszkodzona, gdy larwy karmione są sadzonkami z nadekspresją rpx1-1 lub PEN1 (ryc. 2c – j i 6i, j). Wyniki te są zgodne z wynikami opisanych wcześniej eksperymentów dotyczących leczenia DMNT (Chen i in., 2021), co ponownie potwierdza propozycję, że akumulacja DMNT w rpx1-1 może być jednym z czynników przyczyniających się do odstraszania i śmierci szkodników. RPX1 należy do rodziny genów eIF4E (Rhoads, 2009) i bierze udział w przemieszczaniu się wirusów roślinnych z komórki do komórki (Keima i in., 2017). Jednakże nie jest jasne, czy akumulacja DMNT ma związek z opornością wirusa u roślin. PEN1 ulega specyficznej ekspresji w korzeniach Arabidopsis, gdzie katalizuje biosyntezę DMNT (Sohrabi i in., 2015).

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Konsekwentnie w tym badaniu wykryliśmy wysoką ekspresję PEN1 w korzeniach i bardzo niską ekspresję w liściach (informacje dodatkowe: rysunek S8a). Zaobserwowaliśmy, że liście mutanta rpx1-1 były toksyczne dla larw P. xylostella (ryc. 1), co sugeruje, że akumulacji DMNT i związanej z nią odporności na szkodniki w liściach nie można po prostu wyjaśnić niewielką ekspresją PEN1 w tych tkankach. Co istotne, odkryliśmy, że DMNT może być transportowany z korzeni roślin do części nadziemnych, jak wykazały testy transportu DMNT i analiza GC-MS ekstraktów z liści roślin inkubowanych z DMNT-2H przy korzeniach (Rysunek 7). Sposób transportu tego związku w roślinach jest niejasny i może stanowić temat do dalszych badań. Rośliny mają zdolność tolerowania i zwalczania ataków owadów na różne sposoby. Tutaj, przeprowadzając analizę immunoblot roślin transgenicznych RPX1pro: RPX1-GFP i 35Spro: RPX1-FLAG, odkryliśmy, że po inwazji P. xylostella białko RPX1 może szybko ulec degradacji (Rysunek 8a, c, Informacje dodatkowe: Rysunek S10a), podczas gdy na poziomie ekspresji mRNA RPX1 pozostał niezmieniony (informacje dodatkowe: rysunek S9b). Obecnie sposób degradacji białka RPX1 pozostaje niejasny, ale nasze dane sugerują przede wszystkim, że mechanizm degradacji białka może być zaangażowany w szlaki sygnalizacyjne rany (Rysunek 8d, Informacje dodatkowe: Rysunek S10b).

Co więcej, P. xylostella wstępnie zakażona Col-0 indukowała degradację RPX1-GFP w różnych roślinach (Rysunek 8e), co sugeruje, że inwazja P. xylostella może powodować akumulację sygnałów w roślinach, co z kolei może prowadzić do Degradacja RPX1. Interesujące będzie ustalenie tożsamości sygnałów w przyszłości. Ta cecha degradacji RPX1 jest ważna dla roślin, co może prowadzić do akumulacji DMNT i zapewniać szybką reakcję na szkody spowodowane przez szkodniki (Informacje dodatkowe: Rysunek S3). Zwiększona tolerancja roślin na szkodniki często odbywa się kosztem kondycji. Obserwacja, że ​​mutacja rpx1-1 prowadzi do zwiększonej odporności (ryc. 1) i wyższej produkcji nasion (informacje uzupełniające: ryc. S11) u Arabidopsis bez znaczących kompromisów, oferuje obiecującą drogę do upraw inżynieryjnych o wyższej odporności na szkodniki. Na przykład edycja genomu za pomocą CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do ulepszania upraw (Yang i in., 2017), które umożliwia wprowadzenie mutacji w RPX1 i potencjalnie rozszerza jego zastosowanie na różne uprawy.

BIBLIOGRAFIA

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. i Takabayashi, J. (2000) Lotne substancje wywołane roślinożernością wywołują geny obronne w liściach fasoli lima. Natura, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Wang, C., Tao, Z. i in. (2021) Lotny DMNT bezpośrednio chroni rośliny przed Plutella xylostella poprzez zakłócanie bariery macierzy peritroficznej w jelicie środkowym owada. eŻycie, 10, e63938.

Cheng, X., Hu, J., Li, J., Chen, J., Wang, H., Mao, T. i in. (2018) Uszkodzenie gruczołów jedwabnych i odpowiedź transkrypcyjna na geny związane z enzymami detoksykującymi Bombyx mori pod wpływem foximu. Chemosfera, 209, 964–971.

Clough, SJ i Bent, AF (1998) Dip kwiatowy: uproszczona metoda transformacji Arabidopsis thaliana za pośrednictwem Agrobacterium. The Plant Journal, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. i in. (2020) Kwas salicylowy wywołany żerowaniem roślinożerców antagonizuje obronę roślin za pośrednictwem kwasu jasmonowego przed atakiem owadów. Sygnalizacja i zachowanie roślin, 15, e1704517.

Douglas, AE (2018) Strategie zwiększania odporności upraw na szkodniki owadzie. Roczny przegląd biologii roślin, 69, 637–660.

Feng, Y. i Zhang, A. (2017) Kwiatowy zapach, benzoesan metylu, to skuteczny zielony pestycyd. Raporty naukowe, 7, 42168.

Field, B. i Osbourn, AE (2008) Niezależne od dywersyfikacji metabolicznej składanie klastrów genów przypominających operony w różnych roślinach. Nauka, 320, 543–547.

Go, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK i in. (2012) Identyfikacja syntazy mineralnej, która jest kluczowa dla wzrostu i rozwoju Arabidopsis. The Plant Journal, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Bezpośrednia i pośrednia obrona chemiczna przed owadami w środowisku multitroficznym. Roślina, komórka i środowisko, 37, 1741–1752.

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K. i in. (2019) Jednoczesna edycja za pośrednictwem CRISPR/Cas9 izoform eIF4E manioku nCBP-1 i nCBP-2 zmniejsza nasilenie i częstość występowania objawów choroby brunatnej plamistości manioku. Plant Biotechnology Journal, 17, 421–434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA i Turlings, TCJ (2005) Antennal elektrofizjologiczne reakcje trzech pasożytniczych os na wywołane przez gąsienice substancje lotne z kukurydzy (Zea mays), bawełny (Gossypium herbaceum) i wspięgi (Vigna unguiculata). Journal of Chemical Ecology, 31, 1023–1038.

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. i in. (2016) Biosynteza 8-O-metylowanych związków obronnych benzoksazynoidów w kukurydzy. Komórka roślinna, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. i in. (2019) Wyspecjalizowana sieć metaboliczna selektywnie moduluje mikroflorę korzenia Arabidopsis. Nauka, 364, eau6389.

Huang, HJ i Yang, WB (2007) Synteza moenocynolu i jego analogów przy użyciu BT-sulfonu w olefinacji Julii-Kocieńskiego. Listy czworościanu, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. i in. (2020) Wywoływany przez roślinożerców DMNT, katalizowany przez CYP82D47, odgrywa ważną rolę w indukcji zależnej od JA oporności roślinożerców u sąsiadujących roślin herbacianych. Roślina, komórka i środowisko, 44, 1178–1191.

Johnson, SN i Züst, T. (2018) Zmiana klimatu i szkodniki owadzie: opór nie jest daremny? Trendy w nauce o roślinach, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. i Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: skuteczny środek owadobójczy z nowymi cechami środowiskowymi i nowinami. Mikrobiologia stosowana i biotechnologia, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. i Bouwmeester, HJ (2005) Inżynieria genetyczna metabolizmu terpenoidów przyciąga ochroniarzy do Arabidopsis. Nauka, 309, 2070–2072.

Keima, T., Hagiwara-Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N. i in. (2017) Niedobór izoformy eIF4E nCBP ogranicza przemieszczanie się z komórki do komórki wirusa roślinnego kodującego białka z potrójnym blokiem genów u Arabidopsis thaliana. Raporty naukowe, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. i Tholl, D. (2010) Lotne monoterpeny indukowane roślinożercami i kwiatowe są biosyntetyzowane przez pojedynczy enzym P450 (CYP82G1) u Arabidopsis . Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 21205–21210.

Li, B., Förster, C., Robert, CAM, Züst, T., Hu, L., Machado, RAR i in. (2018) Zbieżna ewolucja przełącznika metabolicznego między odpornością mszyc na gąsienice w zbożach. Postępy nauki, 4, eaat6797.

Liu, D., Huang, X., Jing, W., An, X., Zhang, Q., Zhang, H. i in. (2018) Identyfikacja i analiza funkcjonalna dwóch enzymów P450 Gossypium hirsutum zaangażowanych w biosyntezę DMNT i TMTT. Plant Biotechnology Journal, 16, 581–590.

Lortzing, T. i Steppuhn, A. (2016) Sygnalizacja jasmonianowa w roślinach kształtuje ekologię interakcji roślina-owad. Aktualna opinia w Insect Science, 14, 32–39.

Lu, H., Luo, T., Fu, H., Wang, L., Tan, Y., Huang, J. i in. (2018) Odporność ryżu na szkodniki owadzie za pośrednictwem tłumienia biosyntezy serotoniny. Rośliny przyrodnicze, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. i Tavazza, M. (2022) Celowanie CRISPR-Cas9 genu eIF4E1 rozszerza spektrum odporności Y wirusa ziemniaka Solanum tuberosum L. odm. pożądanie. Granice w mikrobiologii, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. i Miao, X. (2019) Nowatorski przesłuch między reakcjami szlaku etylenu i kwasu jasmonowego na owada przeszywająco-ssącego w ryżu. Nowy Fitolog, 225, 474–487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW i in. (2019) Lotny DMNT ogólnoustrojowo indukuje niezależną od jasmonianu bezpośrednią obronę przeciw roślinożercom w liściach słodkich ziemniaków (Ipomoea batatas). Raporty naukowe, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska-Banaszak, O., Skrzypczak-Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. i Slomski, R. (2015) Glutathione S-transferase as a toksyczność wskaźnik w znieczuleniu ogólnym: genetyka i funkcja biochemiczna. Journal of Clinical Anesthesia, 27, 73–79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: nowi członkowie rodziny, nowi wiążący partnerzy, nowe role. Journal of Biological Chemistry, 284, 16711–16715.

Richter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG i in. (2016) Charakterystyka szlaków biosyntezy produkcji lotnych homoterpenów DMNT i TMTT w Zea Mays. Komórka roślinna, 28, 2651–2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ i Browning, KS (1998) Identyfikacja i charakterystyka nowego białka wiążącego czapeczkę z Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 273, 10325–10330.