Wpływ suplementacji algami na stężenie glutationu i aktywność enzymów glutationu w wątrobie i nerkach myszy
Mar 17, 2022
Abstrakcyjny: Algi są potencjalnym i naturalnym źródłem długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak kwas eikozapentaenowy (EPA) i kwas dokozaheksaenowy (DHA). Okrzemka Pinnularia Borealis gromadzi wysokie poziomy EPA i może być uważana za źródło komercyjnej produkcji suplementów diety. W tym badaniu zadaliśmy pytanie, czy suplementacja P. Borealis może wzmocnić obronę antyoksydacyjną i złagodzić czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Karmiliśmy myszy (Mus musculus) liofilizowanymi roztworami okrzemek o różnych stężeniach (1 procent, 3 procent i 5 procent) przez 7 dni. Następnie zmierzyliśmy zawartość glutationu i aktywność enzymów układu redoks glutationu, stężenie cholesterolu całkowitego i triacyloglicerolu oraz stężenie dialdehydu malonowego wwątrobaoraznerka. Stwierdziliśmy, że stężenie cholesterolu i triacyloglicerolu wwątrobaoraz nerki były najniższe u myszy karmionych najwyższym stężeniem Pinnularia Borealis, co sugeruje ochronne właściwości alg. Dodatkowo najniższe stężenie Pinnularii Borealis było wystarczające do poprawy zdolności antyoksydacyjnej. Nasze wyniki sugerują, że P. Borealis może być wykorzystywany jako źródło suplementów diety bogatych w EPA, ale ilość dostarczana do organizmu powinna być ograniczona.
Słowa kluczowe:glony; EPA; suplementacja; glutation; enzymy glutationowe; stres oksydacyjny; nerka; wątroba
CISTANCHE POPRAWI FUNKCJĘ NEREK/NEREK
Wstęp
Wolne rodniki i ROS stanowią poważne wyzwanie dla organizmów, ponieważ mogą uszkadzać kwasy nukleinowe, białka i lipidy. W ten sposób organizmy wykształciły skuteczny system obrony antyoksydacyjnej, który obejmuje endogenne przeciwutleniacze enzymatyczne i nieenzymatyczne. Jednak z diety można również uzyskać przeciwutleniacze, takie jak witamina C, witamina E, karotenoidy i fenole. Ponadto wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA), które szybko utleniają się in vitro, mogą zmniejszać uszkodzenia oksydacyjne in vivo [1]. Dieta bogata w PUFA zmniejsza ryzyko chorób układu krążenia i niektórych rodzajów raka. Może również obniżać stężenie cholesterolu w osoczu, a tym samym zmniejsza ryzyko chorób sercowo-naczyniowych i Alzheimera [1,2] oraz odgrywa korzystną rolę w zaburzeniach psychicznych, wzroku, astmie i reumatoidalnym zapaleniu stawów [3]. Organizm ludzki może syntetyzować wiele rodzajów kwasów tłuszczowych, ale niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe, takie jak kwas -linolenowy (omega-3, ω-3) i kwas linolowy (ω-6), muszą być uzyskane z diety. Dwie pochodne kwasu -linolenowego, kwas eikozapentaenowy (ω-3, EPA) i kwas dokozaheksaenowy (ω{{10}}, DHA), są ważnymi składnikami strukturalnymi błony komórkowej [4] . EPA i DHA łagodzą czynniki ryzyka chorób serca, takich jak udar mózgu, arytmia i wysokie ciśnienie krwi [3] oraz odgrywają korzystną rolę w zaburzeniach psychicznych, wzroku, astmie i reumatoidalnym zapaleniu stawów [4]. Zarówno EPA, jak i DHA są powszechnie pozyskiwane z codziennej diety, głównie z oleju rybiego. Jednak podczas ekstrakcji z ryb napotyka się problemy, takie jak zapach i niestabilność produktów ekstrakcji [4]. Dlatego potrzebne są alternatywne źródła. Okrzemki stanowią jedną z głównych grup fotosyntetycznych alg [5–11] i są znane z wysokiego poziomu niezbędnych ω-3 kwasów tłuszczowych, EPA, DHA i karotenoidów [12,13]. W 2 011 Lang i in. opublikowali profile kwasów tłuszczowych ponad 2000 mikroalg, co pozwala na szczegółowe badanie profili VLC-PUFA w okrzemkach [14]. Są bogate w średnio- i bardzo długołańcuchowe wielonienasycone kwasy tłuszczowe (VLC-PUFA). Dominującymi kwasami tłuszczowymi są kwas mirystynowy (14:0), kwas palmitynowy (16:0), kwas palmitolejowy (16:1) i kwas eikozapentaenowy (20:5), podczas gdy kwasy tłuszczowe C18 są zwykle obecne w ilościach śladowych [ 15]. Okrzemki są szeroko rozpowszechnione ekologicznie, występują w siedliskach morskich, słodkowodnych i lądowych na całym świecie i znacząco przyczyniają się do produkcji pierwotnej oraz do globalnego obiegu węgla i składników odżywczych [16]. Pinnularia Borealis jest pospolitym lądowym gatunkiem kosmopolitycznym występującym w siedliskach powietrznych (skały, ściany, gleba, mchy) oraz w wodach po nich i stojących [17]. W ostatnich latach okrzemki są coraz częściej doceniane ze względu na ich duży potencjał w zastosowaniach biotechnologicznych, ponieważ wytwarzają związki o wysokiej wartości, które mogą być stosowane w medycynie i jako suplementy diety [18].
W tym badaniu zadaliśmy pytanie, czy suplementacja diety okrzemką Pinnularia Borealis może wzmocnić obronę antyoksydacyjną u myszy Mus musculus. Przeanalizowaliśmy układ antyoksydacyjny glutationu, który odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy oksydacyjnej, a także stężenie dialdehydu malonowego, produktu peroksydacji lipidów, jako markera stresu oksydacyjnego. System antyoksydacyjny glutationu składa się ze zredukowanych i utlenionych form glutationu (odpowiednio GSH i GSSH), peroksydaz glutationowych i reduktazy glutationowej. Zwiększony stosunek GSSG (dwusiarczek glutationu) do GSH wskazuje na większy stres oksydacyjny [1]. Glutation jest syntetyzowany w cytoplazmie komórek iwątrobajest najbardziej aktywnym organem [1]. Zredukowany glutation (L-gamma-glutamylo-L-cysteinyl glicyna, GSH) jest najobficiej występującym niskocząsteczkowym tiolem w komórkach ssaków o silnych właściwościach antyoksydacyjnych [19–21]. GSH regeneruje również inne utlenione antyoksydanty, takie jak witamina C i witamina E. Bierze również udział w naprawie struktury białek, lipidów i cząsteczek kwasu nukleinowego uszkodzonych przez utlenianie [22]. Peroksydazy glutationowe (GPx), charakteryzujące się wysokim powinowactwem do nadtlenku wodoru, wykorzystują zredukowaną formę glutationu do redukcji nadtlenku wodoru do wody i eliminacji go z organizmu [1]. Cykl redoks GSH zamyka reduktaza glutationowa, która katalizuje redukcję utlenionej postaci glutationu do postaci zredukowanej [1]. Proces ten jest ważny dla utrzymania prawidłowego stosunku komórkowego glutationu w postaci zredukowanej i utlenionej [23].
CISTANCHE POPRAWI NIEWYDOLNOŚĆ NEREK/NEREK
Wreszcie S-transferaza glutationowa (GST) katalizuje sprzęganie GSH z szeroką gamą endogennych i egzogennych związków elektrofilowych [24–26]. Koniugacja GST jest pierwszym etapem szlaku kwasu merkapturowego, który prowadzi do eliminacji związków toksycznych. GST odgrywa istotną rolę w detoksykacji różnych szkodliwych ksenobiotyków, zarówno egzogennych, jak i endogennych, a także w rakotwórczych procesach biotransformacji [27]. U ssaków GST występuje we wszystkich narządach i tkankach, ale najwyższa zawartość tego enzymu znajduje się wwątroba[21]. Kolejnym celem naszego badania było sprawdzenie prognozy, że krótkoterminowa suplementacja diety Pinnularia Borealis może złagodzić czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. W tym celu zmierzyliśmy stężenie triacylogliceroli i całkowitego cholesterolu wwątrobaoraznerkimyszy laboratoryjnych.
Materiały i metody
Badanie zostało przeprowadzone na Uniwersytecie Jana Kochanowskiego w Kielcach. Wszystkie procedury doświadczalne zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyki w Badaniach Zwierząt w Warszawie (decyzja nr 37/2019). Eksperyment obejmował dwa etapy badań: (1) przygotowanie Pinnularia Borealis do stosowania jako suplement diety oraz (2) badania in vivo na 6-tygodniowych myszach szwajcarskich.
2.1. Przygotowanie Pinnularia Borealis Plastry glonów zeskrobano z gałązek sosny zebranych w Jaskini Głowoniowej Nyżażu (Tatry, Polska), umieszczono w sterylnych plastikowych torebkach i przewieziono do laboratorium, gdzie hodowano glony na szklanych płytkach Petriego zawierających świeży agar złożony z 1 procent Podstawowego Średniego Bolda [28]. Hodowle utrzymywano w temperaturze 20◦C w cyklu 12-h światła/12-h ciemności w 300{{5{ {60}}}} µEmm2 s悆1 l× (40 W chłodne świetlówki FL). Po około dwóch do trzech miesiącach od pojawienia się glonów przeprowadzono badanie mikroskopowe. Materiał zaobserwowano w stanie żywym i zidentyfikowano przy użyciu mikroskopu świetlnego Nikon Eclipse E 600 (Nikon, Tokio, Japonia), a fotografie wykonano aparatem cyfrowym Coolpix 4500 (Nikon, Tokio, Japonia). Komórki utrwalano w 3% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,1, poddawano dalszej osmacji w 1% tetratlenku osmu, a następnie infiltrowano w pożywce Spurra [29]; mikrofotografie wykonano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego TESLA BS 500 (TEM). Pinnularia Borealis została zidentyfikowana zgodnie z [30] za pomocą odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse Ti i sfotografowana za pomocą sprzętu konfokalnego Nikon A1 (Nikon, Tokio, Japonia). Głowice laserowe i system detekcji 405.488.561 nm stanowiły detektor PMT-DU4 w zakresie 400–820 nm, soczewka odwrócona Plan Apo VC 100XOil, oświetlenie rtęciowe Nikon C-HgFiE oraz aparat cyfrowy DS0Fi1C-U3. Akwizycja danych w Nikon NIS-Elements uzyskała obrazy cyfrowe, które zostały przetworzone w programie Adobe Photoshop CS5 (Adobe, San Jose, CA, USA). Profil estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) w wysuszonej Pinnularia Borealis analizowano metodą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) przy użyciu aparatu Clarus 600T firmy PerkinElmer (Waltham, MA, USA) w oparciu o metodę Guzmana i in. [31]. Zawartość liofilizowanego P. Borealis w ωn-3 PUFA była następująca: ωn-3 PUFA (w procentach wszystkich kwasów tłuszczowych), całkowity=28 procent i EPA {{45 }} procent . W sumie zidentyfikowano i zmierzono 14 kwasów tłuszczowych: kwas mirystynowy (C14:0), kwas palmitynowy (C16:0), kwas palmitoleinowy (C16:1 n-7), kwas heksadekadienowy (C16:2 n{{ 56}}), kwas heksadekatrienowy (C16:3), kwas stearynowy (C18:0), kwas oleinowy (C18:1 n-9), kwas linolowy (C18:2 n-6), - kwas linolenowy (C18:3 n-3), arachidonowy (C20:4 n-6), kwas eikozapentaenowy (C20:5 n-3), kwas erukowy (C22:1 n{{ 79}}) i kwas dokozaheksaenowy (C22:6 n-3).
2.2. Obiekty badań na zwierzętach i przetwarzanie tkanek
2.2.1. Grupy zwierząt i zabiegi
Łącznie 4 0 samców myszy szwajcarskich w wieku 6 tygodni o początkowej masie ciała 20,5 g ± 0,5 g zakupiono w Instytucie Genetyki i Biotechnologii Zwierząt z Polskiej Akademii Nauk (Jastrz ˛ebiec, Polska). Zwierzęta trzymano w standardowych warunkach laboratoryjnych w stałej temperaturze 20-22 ◦C i wilgotności względnej 55 procent ± 10 procent w 12-h cyklu świetlnym (12L-12D ). Wszystkie osobniki umieszczono w standardowych, poliwęglanowych klatkach (252 × 167 × 140 mm) przykrytych pokrywkami ze stali nierdzewnej z wbudowanym koszem na paszę. Jedzenie (Stacja Terenowa Łomna-Las, Polska) i woda były dostępne delirium. W jednej klatce umieszczono pięć osobników. Wszystkim myszom podawano standardową karmę zawierającą (w przeliczeniu na wagę) 20,5 procent białek, 10 procent tłuszczów (0,28 g WKT), 62 procent węglowodanów, 6,5 procent minerałów (1,9 procent wapnia, 1,6 procent fosforu, 1,2 procent magnezu, sód). 0,9 proc. i potas 0,9 proc.) i 1 proc. witamin (retinol 25.000IU, cholekalcyferol 1.000IU, tiamina 300 mg, ryboflawina 20 mg, pirydoksyna 15 mg, kobalamina 40 mg, kwas askorbinowy 58 mg, chinony 5 mg, tokoferole 125 mg, kwas foliowy 3 mg, biotyna 100 µg, kwas nikotynowy 60 mg, kwas pantotenowy 35 mg, chlorek choliny 1000 mg). W trakcie badania myszy miały swobodny dostęp do pokarmu i wody. Po tygodniu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych myszy podzielono losowo na 4 grupy (10 myszy na grupę). Przez kolejne 7 dni myszy karmiono różnymi dietami:
(1) grupa kontrolna otrzymywała standardową dietę; (2) druga grupa była karmiona standardową dietą uzupełnioną 1% roztworem liofilizowanego P. Borealis (0,16 mg EPA); (3) trzecia grupa była karmiona standardową dietą uzupełnioną 3% roztworem liofilizowanego P. Borealis (0.48 mg EPA); oraz (4) czwartą grupę karmiono standardową dietą uzupełnioną 5% roztworem liofilizowanego P. borealis (0,8 mg EPA). Liofilizowane roztwory wodne P. borealis podawano doustnie raz dziennie w objętości 50 µl. W trakcie badania myszy miały swobodny dostęp do pokarmu i wody. Przyrost masy zwierząt monitorowano dwukrotnie (podczas doświadczenia), a ich przyjmowanie pokarmu mierzono również dwukrotnie. Roztwory liofilizowanych okrzemek dostarczano za pomocą konwencjonalnej jednokanałowej mikropipety p200 (Gilson Pipetteman, Thermo Fischer Scientific, Reinach, Szwajcaria) i końcówkę pipety wkładano do ust, aż mysz zaczęła pić.
CISTANCHE POPRAWI BÓL NEREK/NEREK
2.2.2. Pobieranie próbek tkanek
Po tygodniu suplementacji pożywienia myszy zostały ścięte, awątrobai wypreparowano nerki. Thewątrobaperfundowano schłodzonym roztworem soli fizjologicznej (4◦C) w celu usunięcia wszelkiej pozostałej krwi. Fragmenty tkanek (100 mg/1 ml buforu) homogenizowano w homogenizatorze TH 220-PCRH-Omni TH w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4 zawierającym 10 mM EDTA. Homogenaty wirowano przez 15 minut przy 12.000 obr./min w wirówce laboratoryjnej z chłodzeniem MPW-351 R. Po odwirowaniu supernatanty natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w t 40 ◦C do dalszej analizy .
2.2.3. Metody analityczne,W supernatantach tkankowych mierzono spektrofotometrycznie stężenie zredukowanego glutationu, aktywność peroksydazy glutationowej, reduktazy glutationowej, transferazy glutationowej, cholesterolu, triacylogliceroli, białka i dialdehydu malonowego [32]
2.3. Zredukowany Glutation (GSH)Stężenie GSH określono przy użyciu zestawu Glutathione Assist Kit (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy, nr kat. CS0260), zgodnie z procedurą producenta. Próbki najpierw odbiałczono 5-procentowym roztworem kwasu 5-sulfosalicylowego i odwirowano w celu usunięcia wytrąconego białka. Pomiar GSH wykorzystuje test kinetyczny, w którym katalityczne ilości GSH powodują ciągłą redukcję 5,5 ditiobis (kwasu 2-nitrobenzoesowego) (DTNB) do kwasu 5-tio-2nitrobenzoesowego (TNB) , który ma żółty kolor. Intensywność koloru mierzono spektrofotometrycznie przy 412 nm.
2.4. Peroksydaza glutationowa (GPx)Aktywność peroksydazy glutationowej mierzono za pomocą zestawu do oznaczania aktywności komórkowej peroksydazy glutationowej (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy, nr kat. CPG1). Metoda opiera się na utlenianiu glutationu (z postaci GSH do postaci GSSG) katalizowanym przez GPx, który jest sprzężony z zawracaniem GSSG z powrotem do GSH z wykorzystaniem reduktazy glutationowej i NADPH. Spadek absorbancji NADPH mierzony przy 340 nm podczas utleniania NADPH do NADP plus wskazuje na aktywność GPx.
2.5. Transferaza glutationowa (GST)Transferazę glutationową mierzono za pomocą zestawu do oznaczania glutationu S-Transferase (GST) (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy, nr kat. CS0410). Zasada testu opiera się na fakcie, że GST katalizuje sprzęganie L-glutationu z 1-chloro-2,4-dinitrobenzenem (CDNB) poprzez grupę tiolową glutationu. Koniugat GS-DNB absorbuje przy 340 nm. Szybkość wzrostu absorpcji jest wprost proporcjonalna do aktywności GST w próbce.
2.6. Reduktaza glutationowa (GR)Aktywność reduktazy glutationowej mierzono za pomocą zestawu do oznaczania reduktazy glutationowej (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy, nr kat. GRSA). Aktywność mierzono wzrostem absorbancji spowodowanym redukcją DTNB [5,5" ditiobis(2-nitrokwasu benzoesowego)] przy 412 nm.
2.7. Zawartość cholesteroluZawartość cholesterolu oznaczono za pomocą testu Biochemtest metodą [33]. Estry cholesterolu hydrolizowano przez esterazę cholesterolu (CE) do wolnego cholesterolu i kwasów tłuszczowych. Absorpcję badanej próbki mierzono przy 505 nm.
2.8. Zawartość triacylogliceroliZawartość triacylogliceroli oznaczono za pomocą testu Alpha Diagnostic [34]. Zasada testu opiera się na fakcie, że triacyloglicerole są hydrolizowane przez lipazę do wolnych kwasów tłuszczowych i glicerolu, a następnie fosforylowane przez ATP. Intensywność koloru mierzono przy 520 nm.
CISTANCHE POPRAWI DIALIZACJĘ NEREK/NEREK
2.9. Stężenie dialdehydu malonowego (MDA)Stężenie MDA zmierzono spektrofotometrycznie przy użyciu testu kwasu tiobarbiturowego (TBA). Aby przeprowadzić test, {{0},5 ml próbki dodano do mieszaniny reakcyjnej (1,0 ml) utworzonej z równych części 15-procentowego kwasu trischlorooctowego (TCA), w 0.25 N HCL i 0.375 procent kwasu tiobarbiturowego (TBA) w 0,25 N HCL i ogrzewano w 95◦C przez 30 min. Intensywność różowego zabarwienia adduktu TBA–dialdehyd malonowy po schłodzeniu i odwirowaniu mierzono spektrofotometrycznie przy 532 nm [35].
2.10. Zawartość białkaZawartość białka oznaczono metodą [36]. Test białek Lowry'ego opiera się na reakcjach jonów miedzi z wiązaniami peptydowymi (z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, czyli mieszaniną kwasu fosfowolframowego i kwasu fosfomolibdenowego) w warunkach alkalicznych (test Biuretowy) z utlenianiem reszt białek aromatycznych ( głównie tryptofan i tyrozyna). Cysteina również reaguje z odczynnikiem. Stężenie barwnego kompleksu mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali λ=750 nm.
2.11. Analiza statystycznaWszystkie wyniki przedstawiono jako średnie z odchyleniami standardowymi (SD). Parametry biochemiczne porównano stosując analizę wariancji ANOVA, a następnie test post hoc Tukeya. Zmiany masy ciała i spożycia pokarmu porównywano za pomocą testu t dla dwóch par próbek. Analizy te zostały wykonane przy użyciu programu Statistica 9.0 [37]. Dane są również prezentowane w procentach, przyjmując wartości kontrolne jako 100 procent . Istotność statystyczną ustalono na p < 0,05="" i="" p="">< 0,01.="" ponadto="" przeprowadzono="" analizy="" bezpośredniej="" koordynacji="" cca="" za="" pomocą="" testów="" permutacyjnych="" monte="" carlo,="" aby="" określić,="" które="" z="" mierzonych="" parametrów="" biochemicznych="" istotnie="" różnicują="" zestawy="" badań.="" analizy="" te="" zostały="" wykonane="" przy="" użyciu="" oprogramowania="" canoco="" 5.0="" [38],="" oddzielnie="">wątroba i nerki.
3. Wyniki
Stężenie lub aktywność wszystkich części układu antyoksydacyjnego glutationu zależała od suplementacji diety, zarówno wwątroba i nerki. Przed eksperymentem myszy ważyły 20,5 g ± 0,5 g. Po tygodniu suplementacji różnymi roztworami okrzemek myszy nie różniły się masą ciała [t== 1,75, p=00,088]. Spożycie pokarmu również nie różniło się między grupami, a myszy zjadały średnio 2,5 ± 0,4 g pokarmu dziennie. Jednak już po tygodniu suplementacji zawartość cholesterolu i triacyloglicerolu wwątrobai nerek zmniejszyły się w porównaniu z dietą kontrolną, a aktywność reduktazy glutationowej i stężenie dialdehydu malonowego znacząco wzrosła, niezależnie od stężenia roztworu okrzemek, zarówno wwątrobai nerki.
W wątrobie aktywność GPx stale spadała wraz ze wzrostem zawartości Pinnularia Borealis (F (3, 36)=30,80, p=00,018) (ryc. 1A). Największy spadek (78,18 proc.) odnotowano wwątrobamyszy karmionych 5% roztworem (Rysunek 1A, Tabela 1). W nerkach wzorzec był prawie odwrotny (F (3, 36)=13.08, p=6.2 × 10 6) (ryc. 1A) i najwyższa aktywność GPx odnotowano u zwierząt otrzymujących 3% roztwór okrzemek (Figura 1A, Tabela 1). Zmiany stężenia glutationu po suplementacji dietą nie wykazywały jednolitego wzorca, również w okresiewątroba(F (3, 36)=5,44, p=0,003) (Rycina 1B) lub w nerkach (F (3, 36)=230,12, p {{ 11}}.6 × 10悆 8) (Rysunek 1B). Po 7 dniach suplementacji diety 5-procentowym roztworem stężenie GSH wwątrobazmniejszyła się do ~82% wartości kontrolnych, ale ta różnica nie była znacząca (Figura 1B, Tabela 1). Istotną różnicę w zawartości GSH odnotowano tylko między myszami karmionymi 3 procentami i 5 procentami roztworów okrzemek. W nerce najwyższą zawartość GSH odnotowano u zwierząt karmionych 3% roztworem okrzemek (ryc. 1B, tabela 1).
Aktywność reduktazy glutationowej znacząco wzrosła, niezależnie od stężenia roztworu okrzemek, zarówno wwątroba(F (3, 36)=29,34, p=8,9 × 10 10) (Rysunek 1C) inerka(F (3, 36)=9.85, p=7.0 × 10 5 ) (Rysunek 1C) i ogólnie był znacznie wyższy wwątrobaniż wnerka(p < 0.05).="" aktywność="" gr="" po="" suplementacji="" 5-procentowym="" roztworem="" osiągnęła="" aż="" 290="" procent="" wartości="" kontrolnej="" w="">wątroba(Rysunek 1C) i do 180 procent wartości kontrolnej wnerka(Rysunek 2, Tabela 1).
Działalność GST wnerkastale wzrastała wraz ze wzrostem zawartości Pinnularia Borealis w pożywieniu (F (3, 36)=15,59, p=1,2 × 10 6) (Rysunek 1D). Największą aktywność odnotowano po suplementacji 5-procentowym roztworem, gdy osiągnęła 158% wartości kontrolnej (ryc. 1D). Działalność GST wwątrobabyła wyraźnie wyższa niż wnerka(p < 0.05).="" chociaż="" działalność="" gst="">wątrobabył zależny od diety (F (3, 36)=11.62, p=1.8 × 10 5) (ryc. 1D), nie wykazywał tak regularnego wzorca jak w tennerka(Rysunek 1D). Stężenie dialdehydu malonowego również stale rosło wraz ze wzrostem zawartości Pinnularia Borealis w żywności, zarówno wwątroba(F (3, 36)=4.26, p=0.011) (Rysunek 1E) oraz wnerka(F (3, 36)=6.74, p=0.001) (Rysunek 1E). W obu przypadkach najwyższe stężenie MDA odnotowano po karmieniu 5 procentowym roztworem okrzemek (ryc. 1E). Zmienne istotne dla różnorodności zbioru danych łącznie stanowiły 55,9 procent całkowitej zmienności wwątrobai 53,9 procnerka(Rysunki 2 i 3). W nerkach w próbkach kontrolnych stwierdzono statystycznie istotną zależność między wysokim poziomem cholesterolu a trójglicerydami. Istotny był również wzrost poziomu GSH przy 3-proc. suplementacji okrzemkami. Podobnie wzrost GR był istotnie związany z dodaniem 5 procent okrzemek (Rysunek 3). W wątrobie wzrost stężenia MDA korelował z 5-procentową domieszką okrzemek. Zależność była istotna statystycznie. Wzrost poziomu GSH i GR przy niskich stężeniach okrzemek w paszy był również istotny statystycznie (ryc. 2).
Zawartość triacylogliceroli i cholesterolu wwątrobaoraznerkabyły podobne (ryc. 1F,G). Suplementy diety okrzemkami istotnie wpłynęły na stężenie triacylogliceroli, zarówno wwątroba(F (3, 36)=16.22, p=7.8 × 10 7) oraz wnerka(F (3, 36)=7.89, p=0.0004). W porównaniu z grupami kontrolnymi, po 3% i 5% roztworach okrzemek,wątrobatriacyloglicerole spadły odpowiednio do 75,25 proc. i 65,84 procnerkado 92 (ns) i 73,16 proc. Podobnie wzbogacenie diety o okrzemki obniżyło zawartość cholesterolu, zarówno wwątroba(F (3, 36)=2.57, p=0.07) oraz wnerka (F (3, 36)=14,90, p =1,8 × 106). Największy spadek zawartości cholesterolu odnotowano w narządach myszy karmionych 5-proc. roztworem okrzemek.
4. Dyskusja
W tym badaniu zadaliśmy pytanie, czy suplementacja Pinnularia Borealis może wzmocnić obronę antyoksydacyjną i złagodzić czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Stwierdziliśmy, że stężenie cholesterolu i triacyloglicerolu wwątrobaoraznerkibyły najniższe u myszy karmionych najwyższym stężeniem P. Borealis, co sugeruje ochronne właściwości alg. Ponadto najniższe stężenie P. Borealis było wystarczające do poprawy zdolności antyoksydacyjnych myszy. Algi są potencjalnym i naturalnym źródłem długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), takich jak kwas eikozapentaenowy (EPA) i kwas dokozaheksaenowy (DHA). Ogólnie zawartość lipidów w algach fototroficznych waha się od 10 do 60 procent suchej masy, a zawierają one od 10 do 20 procent ω-3 PUFA [4]. Profile kwasów tłuszczowych w algach są uwarunkowane genetycznie, ale zawartość kwasów tłuszczowych zależy również od natężenia światła i zasolenia wody [39]. Ryckebosch i in. [40] donieśli, że duże ilości EPA lub DHA gromadzą się w algach morskich: Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Chrysophyceae, Cryptophyceae i Florideophyceae. Peltomaa i in. [39] zasugerowali, że glony słodkowodne mogą być bogatsze w ω-3 PUFA niż morskie i słonawe, a spiczaste okrzemki słodkowodne Nitzschia sp. jako najbardziej obiecujący szczep okrzemek do komercyjnej produkcji EPA. Nitzschia laevis zawiera łącznie 75,9% EPA, a 37,4% EPA jest skumulowane w postaci triacyloglicerolu, 22,6% w postaci monoacyloglicerydów, a 15,9% w postaci fosfatydylocholiny [41]. W P. Borealis użytym w tym badaniu ω-3 PUFA stanowiły 28% wszystkich kwasów tłuszczowych, a EPA stanowił 32% wszystkich ω-3 PUFA. Ludzka EPA pozyskiwana jest z diety, głównie z oleju rybiego. Jest niezbędnym kwasem tłuszczowym o ważnej wartości odżywczej i ma zdolność łagodzenia ryzyka wielu chorób. W związku z tym potrzebne są źródła alternatywne dla oleju rybnego, aby zaspokoić rosnące zapotrzebowanie na PUFA. Okrzemka P. Borealis akumuluje wysoki poziom (32%) EPA i dlatego może być traktowana jako suplement diety.
Stwierdziliśmy, że suplementacja diety liofilizowanymi roztworami okrzemek P. Borealis o różnych stężeniach indukowała zależny od dawki spadek stężenia cholesterolu i triacyloglicerolu. Ze względu na duże zróżnicowanie zawartości cholesterolu w grupie kontrolnej efekt ten nie osiągnął poziomu istotności wrelacja na żywor (p=0.07), ale widoczny był stały trend. wnerka,stężenie cholesterolu u myszy suplementowanych najwyższym 5% roztworem okrzemek zmniejszyło się o ~30%. Konsekwentnie zawartość triacyloglicerolu była wyraźnie obniżona, zarówno wwątrobaoraznerka. Sugerujemy, że spadek zawartości cholesterolu i triacyloglicerolu był wynikiem suplementacji diety WNKT, które są znane ze swojego działania ochronnego [1]. P. Borealis to okrzemka kserofityczna, która zawiera nie tylko wysokie stężenie EPA, ale także kilka związków bioaktywnych, takich jak pigmenty, włókna i fitosterole, które są korzystne dla zdrowia [5,8]. Podobne wyniki uzyskali Sano i in. [42], którzy zaobserwowali znaczące działanie przeciwlipidemiczne i przeciwmiażdżycowe suplementacji diety algami Chlorella Vulgaris u królików karmionych dietą wysokocholesterolową przez 10 tygodni. Fallah i in. [43] wykazali, że przyjmowanie chlorelli może również obniżać poziom cholesterolu u pacjentów z hipercholesterolemią. Te potencjalne korzyści zdrowotne zostały przypisane konkretnym składnikom Chlorelli, takim jak minerały, błonnik pokarmowy, białka i ω-3 PUFA. Cherng i in. [44] wykazali również, że Chlorella pyrenoidosa ma zdolność zapobiegania dyslipidemii w modelach szczurów i chomików karmionych dietą wysokotłuszczową zawierającą 20 procent uwodornionego oleju kokosowego (bogatego w nasycone kwasy tłuszczowe). Kilka badań wykazało, że zwierzęta karmione dietą wysokotłuszczową są bardziej narażone na dyslipidemię i hiperglikemię [45], insulinooporność [46], stłuszczenie wątroby [47], agregację płytek [48] i stres oksydacyjny [49]. Zatem odpowiednia dieta bogata w PUFA może złagodzić czynniki ryzyka tych chorób.
CISTANCHE POPRAWI INFEKCJE NEREK/NEREK
Lee i in. [50] wykazali, że u koreańskich palaczy płci męskiej suplementacja Chlorella Vulgaris zachowała stan przeciwutleniaczy w osoczu i poprawiła aktywność enzymów antyoksydacyjnych erytrocytów. Reaktywne formy tlenu i wolne rodniki mogą być szkodliwe dla lipidów, białek i DNA oraz mogą wywoływać szereg chorób człowieka, takich jak choroby neurodegeneracyjne i sercowo-naczyniowe [51]. W tym badaniu przewidzieliśmy, że suplementacja diety P. Borealis złagodzi stres oksydacyjny, ponieważ PUFA mogą zmniejszyć uszkodzenia oksydacyjne in vivo [1]. Natomiast stężenie dialdehydu malonowego (MDA), będącego markerem stresu oksydacyjnego, było najwyższe, zarówno wwątrobaoraznerkau myszy suplementowanych 5-procentowym roztworem okrzemek (ryc. 2 i 3). Dialdehyd malonowy powstaje w dużej mierze w wyniku peroksydacji PUFA i chociaż jest mniej niebezpieczny niż wcześniej sądzono, nadal jest toksyczny, immunogenny i mutagenny [1]. Jednak MDA może pochodzić nie tylko z peroksydacji lipidów, ale także z pożywienia. Jest więc prawdopodobne, że wysoka zawartość MDA nie jest związana ze stresem oksydacyjnym, ale z wysoką zawartością EPA w suplemencie diety. Rzeczywiście, aktywność peroksydazy glutationowej (GPx) nie zmieniła się ani nawet nie spadła po suplementacji diety (ryc. 2). Enzymy GPx katalizują redukcję nadtlenku wodoru chroniąc organizm przed uszkodzeniem oksydacyjnym. Tak więc, jeśli stres oksydacyjny byłby zwiększony, wówczas aktywność GPx wzrosłaby. Niezrozumiałe, że aktywność GPx wzrosła wnerkamyszy karmionych 3% roztworem okrzemek i towarzyszył temu wzrost zawartości GSH (Rysunek 3). Najprawdopodobniej dlatego stężenie GSH wyjaśniało 23,7% wariancjinerka(Rysunek 3). Wyniki te mogą sugerować wzrost stresu oksydacyjnego w tej grupie. Jednak aktywność reduktazy glutationowej (GR) wwątrobaorazzwiększona nerkapo suplementacji diety, niezależnie od roztworu okrzemek (ryc. 2). W wątrobie aktywność GR wyjaśniała 39,7% wariancji (ryc. 2). Enzym ten przekształcił utleniony glutation do jego zredukowanej formy, aby utrzymać właściwy potencjał oksydacyjno-redukcyjny i chronił grupy -SH białek przed utlenianiem [22]. ~2–2.5-krotny wzrost aktywności GR we wszystkich grupach wskazuje, że nawet przy najniższym roztworze Pinnularia Borealis mechanizmy antyoksydacyjne ulegają poprawie. Stężenie zredukowanego glutationu (GSH) spadło tylko u myszy suplementowanych 5% roztworem okrzemek. Może to sugerować, że korzystniejsze są niższe stężenia. GSH jest silnym przeciwutleniaczem, który jest również kofaktorem peroksydaz glutationowych i transferaz glutationowych [1]. Transferazy glutationowe to grupa enzymów, które inicjują detoksykację endogennych i egzogennych szkodliwych dla komórek związków, w tym reaktywnych form tlenu. Najwyższa aktywność transferazy glutationowej (GST) u myszy suplementowanych 5-procentowym roztworem okrzemek może również wyjaśniać najniższą zawartość GSH u tych zwierząt. Wnioskujemy zatem, że suplementacja diety P. Borealis jest korzystna dla układu redoks GSH przy zastosowaniu w roztworze do 3 proc. Wyższe stężenia mogą mieć szkodliwe skutki, których nie można zrekompensować obniżeniem zawartości cholesterolu lub triacyloglicerolu. Jednak dietetyczne PUFA mogą być wbudowywane do lipidów komórkowych w różnym stopniu i jako takie mogą wywierać różne efekty w zależności od struktury komórkowej lub tkanki [52]. Może to częściowo wyjaśniać różnice w parametrach systemu antyoksydacyjnego międzynerkai wątroba. Ponadto kwasy tłuszczowe pozyskiwane z diety mogą ulegać desaturacji lub wydłużeniu, przede wszystkim w retikulum endoplazmatycznym [53]. Nie mierzyliśmy zawartości EPA wwątrobaoraznerka,więc nie możemy dokładnie powiedzieć, jaka była zawartość EPA w tkankach, ale jesteśmy przekonani, że wyniki nie były przypadkowe, ponieważ najniższe stężenie P. Borealis wystarczyło do poprawy zdolności antyoksydacyjnej
Ponadto istnieje coraz więcej dowodów na to, że różne PUFA stosowane jako suplementy diety nie są sobie równe, ponieważ PUFA mają nie tylko właściwości pro-, ale także antyoksydacyjne, a zatem mogą modulować endogenną obronę antyoksydacyjną [52]. Skutki PUFA nie są po prostu związane z długością łańcucha węglowego lub liczbą i położeniem wiązań podwójnych. Wśród pięciu różnych badanych PUFA (arachidonowych (20:4 ω-6), linolowych (18:2 ω-6), -linolenowych (18:3 ω-3), eikozapentaenowych (20: 5 ω-3) i dokozaheksaenowy (22:6 ω-3)) tylko DHA zwiększał obronę antyoksydacyjną w hodowli linii komórek ludzkiego wątrobiaka, podczas gdy kwas arachidonowy powodował uszkodzenie oksydacyjne [51,54]. W innych badaniach in vitro autorzy [55] wykazali, że egzogenne EPA i DHA mają najsilniejsze właściwości przeciwutleniające i są znacznie skuteczniejsze w wymiataniu ROS niż ω-6 PUFA
Według naszej najlepszej wiedzy jest to pierwsze badanie dotyczące P. Borealis jako suplementu diety. Glony mogą syntetyzować wiele związków o silnych korzyściach zdrowotnych [56]. Koyande i in. [45] wykazali, że związki aktywne w algach mają właściwości przeciwnowotworowe, antyoksydacyjne i przeciwnadciśnieniowe. Jednym z naturalnych sposobów eliminowania ryzyka chorób neurodegeneracyjnych i sercowo-naczyniowych może być dieta bogata w ω-3 PUFA [38]. Niektóre algi zaliczane są do kategorii GRAS jako źródło pokarmu [57], a okrzemka P. Borealis została uznana za bogate źródło wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak EPA [58]. W dzisiejszych czasach ludzka EPA pozyskiwana jest z diety, głównie z oleju rybiego. Jest niezbędnym kwasem tłuszczowym o ważnej wartości odżywczej i zdolności łagodzenia ryzyka wielu chorób. W związku z tym potrzebne są źródła alternatywne dla oleju rybnego, aby zaspokoić rosnące zapotrzebowanie na PUFA. Okrzemka P. Borealis akumuluje wysoki poziom (32%) EPA i dlatego może być traktowana jako suplement diety.
5. Wnioski
Wyniki naszego badania wskazują, że Pinnularia Borealis może być stosowana jako suplement diety zapewniający korzyści zdrowotne. Dostarczony w odpowiedniej ilości może wzmocnić obronę antyoksydacyjną i złagodzić czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Algi są dobrą alternatywą dla oleju rybnego, eliminując problemy z zapachem i niestabilnością produktów ekstrakcji.
