Izolacja i oczyszczanie glikozydów fenyloetanoidowych z Cistanche Deserticola za pomocą szybkiej chromatografii przeciwprądowej

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Li a, b, Rong Tsao b,*, Raymond Yang b, Chunming Liu a, J. Christopher Young b, Honghui Zhu b

Abstrakcyjny

Pięć glikozydów fenyloetanoidowych (PhG), echinakozyd, cistanozyd A, akteozyd, izoakteozyd i 20-acetyloakteozyd, wyizolowano i oczyszczono zCistanche deserticolapo raz pierwszy metodą szybkiej chromatografii przeciwprądowej (HSCCC) z użyciem dwóch układów dwufazowych, jednego składającego się z octanu etylu-etanolu-woda (5:0.5:4,5, v/v/v) i drugiego octan etylu-n-butanol-etanol-woda ({{10}}.5:0.5:0.1:1, obj./obj./obj./obj.). W sumie 28,5 mg echinakozydu, 18,4 mg cistanozydu A, 14,6 mg akteozydu, 30,1 mg izoakteozydu i 25,2 mg 20-acetyloakteozydu oczyszczono z 1412 mg ekstraktu n-butanolu z C. deserticola, każdy o czystości ponad 92,5%, jak określono metodą HPLC. Struktury zidentyfikowano na podstawie czasu retencji, UV, LC-ESI-MS w trybie jonów ujemnych i potwierdzono eksperymentami NMR. Omówiono charakterystyczny wzór fragmentacji LC-ESI-MSn pięciu związków i stwierdzono, że jest on bardzo specyficznym i użytecznym narzędziem do identyfikacji strukturalnej PhG z tej ważnej rośliny leczniczej.

Słowa kluczowe:Cistanche deserticola; Fenyletanoid; echinakozyd; Cystanozyd A; akteozyd; izoakteozyd; 20-Acetylolaktozyd; HSCCC; LC-ESI-MS; NMR

1. Wstęp

Cistanche deserticola YC Majest dobrze znanym chińskim ziołolecznictwem i jest szeroko stosowany w tradycyjnych preparatach podobnych do dzisiejszych składników żywności funkcjonalnej lub suplementów diety (Wong, Li, Cheng i Chen, 2006). Głównymi składnikami bioaktywnymi w C. deserticola są glikozydy fenyloetanoidowe (PhG), w tym echinakozyd, akteozyd, izoakteozyd, 20-acetyloakteozyd i cistanozyd A (Kobayashi, Karasawa i Miyase, 1984; Kobayashi i wsp., 1987). PhG są szeroko rozpowszechnione w królestwie roślin i zostały szeroko przebadane pod kątem ich różnych funkcji biologicznych, takich jak hepatoprotekcyjne (Xiong i wsp., 1998), przeciwzapalne, antynocyceptywne (Schapoval i wsp., 1998) i przeciwutleniające ( Cheng, Wei, Guo, Ni i Liu, 2005; He, Lau, Xu, Li i & But, 2000; Li, Wang i Wang, 1997; Li, Wang, Zheng, Liu i Jia, 1993; Wang, Jiang, Wu i Wang, 2001; Xiong, Kadota, Tani i Namba, 1996), poprawę funkcji seksualnych (Xie i Wu, 1993; Zong, He, Wu i Chen, 1996) oraz działanie uspokajające (Lu, 1998 ).

Ze względu na powyższe znaczące bioaktywności, duże ilości czystych związków są pilnie potrzebne jako wzorce odniesienia oraz do różnych badań in vitro i in vivo związanych ze stosowaniem tradycyjnych leków chińskich. Niezbędne stają się zatem skuteczne metody izolacji, oczyszczania i charakteryzacji strukturalnej PhG. Jednak taka praca wymaga zwykle zastosowania wielu etapów chromatograficznych w celu oczyszczenia i izolacji próbki (Gross, Lahloub, Anklin, Schulten i Sticher, 1988; Nishimura, Sasaki, Inagaki, Chin i Mitsuhashi, 1991; Ravn, Nishibe , Sasahara i Li, 1990; Shoyama, Matsumoto i Nishioka, 1987), co zwykle skutkuje niskimi wskaźnikami odzysku z powodu nieodwracalnej adsorpcji PhG na nośniku stałym podczas rozdzielania (Lei i wsp., 2001). W przeciwieństwie do tego, szybka chromatografia przeciwprądowa (HSCCC) stała się skuteczną alternatywą dla konwencjonalnych technik chromatograficznych do oddzielania niektórych PhG z ekstraktów roślinnych (Lei i wsp., 2001; Li i wsp., 2005). Lei i in. skutecznie oddzielił akteozyd i 20-acetyloakteozyd odSalsa Cistanches(CA Mey.) G. Beck przy użyciu HSCCC (Lei i wsp., 2001). Autorzy tej pracy donosili wcześniej o oddzieleniu akteozydu i izoakteozydu od Plantago psyllium L. przez HSCCC (Li i wsp., 2005). Jednak nie opublikowano żadnego doniesienia na temat separacji i oczyszczania wielu PhG z C. deserticola przy użyciu HSCCC. Ze względu na brak standardów, metody LC-MS zostały opracowane i wykorzystane jako potężne narzędzie analityczne do szybkiej charakteryzacji i identyfikacji niektórych PhG w ekstrakcie roślinnym (Li i wsp., 2005; Wang i wsp., 2000).

W tym artykule opisujemy metodę HSCCC opracowaną do wytwarzania echinakozydu, cistanozydu A, akteozydu, izoakteozydu i 20-acetyloakteozydu z C. deserticola. Charakterystykę i analizę pięciu rozdzielonych PhG przeprowadzono przy użyciu LC sprzężonej ze spektrometrią mas in-line ESI i eksperymentami NMR. W artykule przedstawiono i omówiono czas retencji, masę cząsteczkową oraz charakterystyczne jony fragmentacyjne pięciu PhG. Struktury pięciu PhG zidentyfikowanych w tym badaniu przedstawiono na rys. 1.

Skuteczne składniki Cistanche deserticola

2. Eksperymentalny

2.1. Chemikalia i odczynniki

Acteoside zakupiono od Sigma-Aldrich (Oak-Ville, ON), echinakozyd zakupiono od ChromaDex (Santa Ana, CA). Izoakteozyd wyizolowano z P. psyllium L. (Li i wsp., 2005). C. deserticola zakupiono w Beijing TongRenTang Medicinal Store (Chiny). Wszystkie rozpuszczalniki były czystości HPLC i zakupiono w Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON).

2.2. przygotowanie próbki

C. deserticola (20 g) ekstrahowano pięć razy w temperaturze pokojowej przez 12 godzin za każdym razem 100 ml 80% wodnego etanolu. Za każdym razem mieszaninę ekstrakcyjną filtrowano przez bibułę filtracyjną Whatman nr 1 (Whatman International Ltd., Maidstone, Anglia). Połączony przesącz zatężono do 100 ml pod próżnią w temperaturze < 40="" stopni="" .="" otrzymany="" roztwór="" wodny="" odtłuszczono="" dwukrotnie,="" za="" każdym="" razem="" 100="" ml="" heksanu,="" a="" następnie="" kolejno="" wyekstrahowano="" pięć="" razy,="" za="" każdym="" razem="" 100="" ml="" n-butanolu.="" warstwy="" n-butanolu="" połączono="" i="" zatężono="" do="" sucha="" pod="" próżnią="" w="" temperaturze="">< 40="" stopni,="" co="" dało="" 2,2="" g="" ekstraktu="" n-butanolu.="" ekstrakt="" przechowywano="" w="" -20="" stopniu="" przed="" rozdziałem="">

2.3. Procedura separacji HSCCC

Preparatywną HSCCC przeprowadzono w modelu CCC do szybkiej chromatografii przeciwprądowej {{0}} (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland USA). Aparat ten miał trzy cewki preparatywne, połączone szeregowo (całkowita objętość, 325 ml). Prędkość obrotową aparatu można regulować w zakresie od 0 do 2000 obr./min. System HSCCC był wyposażony w pompę HPLC (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland, USA), detektor UV Model 450 (Alltech, USA), rejestrator płaski Model L 120 E (Linseis Inc., Princeton Jct, USA), kolektor frakcji (Advantec MFS Inc., USA) i zawór do wstrzykiwania próbki z pętlą próbki 10-mL.

Mieszaninę octan etylu-etanol-woda (5:0.5:4,5, v/v/v) energicznie wytrząsano w rozdzielaczu, odstawiono i rozdzielono w temperaturze pokojowej. Dwie fazy zastosowano w HSCCC po osiągnięciu równowagi. Cała zwijana kolumna została najpierw wypełniona warstwą górną, która służy jako faza stacjonarna. Dolną warstwę (faza ruchoma) następnie pompowano do czoła kolumny z szybkością przepływu 1,5 ml/min. Prędkość obrotową ustawiono na 1050 obr/min. Próbka (każdorazowo ok. 230 mg) rozpuszczona w 8 ml mieszaniny octan etylu-etanol-woda (5:0,5:4,5, obj./obj./obj.) po osiągnięciu przez układ hydrodynamicznej równowaga. Ten dwufazowy układ rozpuszczalników wybrano na podstawie współczynnika podziału (K), który wynosił odpowiednio 0,87, 1,11 i 1,32 dla akteozydu, izoakteozydu i 20 acetyloakteozydu. Wartość K była stosunkiem stężeń w górnej i dolnej warstwie tego samego związku, jak oznaczono metodą HPLC (rys. 2). Wyciek z wylotu kolumny monitorowano w sposób ciągły za pomocą detektora UV przy 254 nm i zbierano do probówek z kolektorem frakcji ustawionym na 4 min dla każdej probówki.

2.4. Warunki LC

Do analizy PhGs w ekstrakcie n-butanolowym C. deserticola i frakcjach zebranych z separacji HSCCC zastosowano statyczny autosampler i detektor fotodiodowy (DAD). Rozdział przeprowadzono w kolumnie Phenomenex ODS-C18 (250 x 4,6 mm, 5 lm) z kolumną ochronną C18. Podwójna faza ruchoma składała się z acetonitrylu (rozpuszczalnik A) i wody zawierającej 2% kwasu octowego (rozpuszczalnik B). Wszystkie rozpuszczalniki zostały przefiltrowane przez

{{0}}.45 lm filtr przed użyciem. Szybkość przepływu utrzymywano na stałym poziomie 1,0 ml/min przez całkowity czas przebiegu 25 min. System działał z programem gradientowym: 0–20 min: 90 procent B do 60 procent B; 20–22 min: 60 procent B do 0 procent B; i 22-25 min, 0 procent B do 90 procent B. Objętość wstrzykiwanej próbki wynosiła 10 µl. Piki zainteresowania monitorowano przy 320 nm za pomocą detektora DAD.

2.5. Eksperymenty LC-ESI-MS

Eksperymenty LC-MS przeprowadzono przy użyciu spektrometru masowego Finnigan LCQ DECA z pułapką jonową (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) wyposażonego w źródło jonizacji metodą elektrorozpylania (ESI). Próbki analizowano w tych samych warunkach chromatograficznych. Do zbierania danych wykorzystano model negatywny. Natężenia przepływu gazu osłonowego i pomocniczego ustalono odpowiednio na 96 i 7 (jednostka arbitralna). Napięcie kapilary ustawiono na 29 V, a jej temperaturę kontrolowano na 350 stopni. Napięcie soczewki wejściowej ustalono na 40 V, a amplitudę multipolowego RF ustawiono na 540 V. Napięcie igły ESI było kontrolowane na 4,5 kV. Przesunięcie soczewki tubusu wynosiło 16 V, przesunięcie soczewki multipolowej 1 – 8,20 V, przesunięcie soczewki multipolowej 2 – 10,5 V. Napięcie powielacza elektronów ustawiono na 980 V dla wykrywania jonów.

2.6. NMR for Identification

Widma NMR rejestrowano na spektrometrze Bruker Avance-600 (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Kanada). Jedynie związki 2 i 5 (brak dostępnych standardów) poddano eksperymentom NMR. Próbki rozpuszczono w CD3OD.

Składniki aktywne cistanche: echinakozyd i akteozyd

3. Wyniki i dyskusja

Pomyślny rozdział HSCCC zależy w dużej mierze od odpowiedniego dwufazowego układu rozpuszczalników, który zapewnia idealny współczynnik podziału (K) około 1 dla żądanego związku. Taki dwufazowy system powinien również dawać rozsądnie krótki czas ustalania (Chen, Games, & Jones, 2003; Foucault i Chevolot, 1998; Oka, Oka i Ito, 1991). W naszym eksperymencie wybraliśmy cztery serie układów rozpuszczalników zgodnie z rozpuszczalnością związków docelowych w C. deserticola. Do pomiaru stężenia w każdej fazie zastosowano HPLC, z którego obliczono wartości K związków docelowych. Wcześniej w HSCCC w celu oddzielenia akteozydu i 20-acetyloakteozydu od

C. salsa oraz akteozyd i izoakteozyd z P. Psyllium,

odpowiednio (Lei i in., 2001; Li i in., 2005). Chociaż pierwszy system miał stosunkowo krótki czas osadzania, miał słabe wyniki w oddzielaniu PhG C. deserticola ze względu na niskie wartości K dla związków 1 i 2 oraz wysokie wartości K dla związków 3-5. Wartości K były bardzo niskie dla związków 1-4 w drugim systemie, ale bardzo wysokie dla związku 5 (tabela 1). Zmodyfikowany układ zawierający octan etylu-etanol-woda (5:0,5:4,5, obj./obj./obj.), dał idealną wartość K dla związków 3-5, odpowiednio 0,87, 1,11 i 1,32, i skutkował dobrym rozdziałem tych trzech związków (rys. 3A i B). System ten jednak wyprodukował

zbyt mała wartość K dla związków 1 i 2, powodująca koelucję tych dwóch związków w pobliżu czoła rozpuszczalnika (frakcja 1 na ryc. 3A). Kolejna modyfikacja układu (octan etylu-n-butanol-etanol-woda (0.5:0.5:0.1:1, v/v/v/ v) podwyższył wartości K dla związku 1 i 2 odpowiednio do 0.52 i 0.92 i doprowadził do całkowitego oddzielenia (rys. 3C). próbka zawierająca 230 mg ekstraktu n-butanolowego C. deserticola przy użyciu mieszaniny octan etylu-etanol-woda (5:0.5:4,5, v/v/v). Frakcje, które zostały potwierdzone metodą HPLC, aby zawierały tylko związki 3, 4 lub 5 połączono oddzielnie, a te zawierające związki 3 i 4 połączono, liofilizowano i ponownie poddano HSCCC w celu dalszego rozdzielenia (ryc. 3B). Opisany powyżej rozdział HSCCC dał w sumie 14,6 mg, 30,1 mg i 25,2 mg związków 3-5 z 1412 mg ekstraktu n-butanolowego Rys. 3C przedstawia rozdział HSCCC próbki zawierającej związki 1 i 2 (frakcja 1 w pierwszym rozdziale) przy użyciu octan etylu-n-butanol-etanol-woda (00,5:0,5:0,1:1, v/v/v/v). Łącznie 28,5 i 1 Otrzymano 8,4 mg związków 1 i 2. Czystości chromatograficzne liofilizowanych związków 1–5 wynosiły ponad 92,5%, które były bezpośrednio wykorzystywane do analiz LC-ESI-MS i NMR.

Wstępna identyfikacja związków 1, 3 i 4 została osiągnięta przez zbieżne czasy retencji i dane spektralne UV z tymi dla autentycznego echinakozydu, akteozydu i izoakteozydu (ryc. 2). Związki 2 i 5 były nieznane, jednak widma UV wszystkich pięciu związków były bardzo podobne, co wskazuje na podobne cechy strukturalne.

W celu dalszego zbadania struktur tych pięciu związków podjęto próby eksperymentów LC-ESI-MSn, których wyniki przedstawiono na ryc. 4 i w tabeli 2. Związki związane z pikami (1–5) na ryc. 2 wykazywały intensywne zdeprotonowane jony cząsteczkowe [MH] — przy m/z odpowiednio 785, 799, 623, 623 i 665 w trybie negatywu. Jony dimeryczne [2M H]— zaobserwowano również dla pików 1–4 na Rys. 2. Potwierdzono, że masy cząsteczkowe pików 1–5 wynoszą odpowiednio 786, 800, 624, 624 i 666. Dane LC-MSN (Tabela 2) dostarczyły bardzo przydatnych informacji strukturalnych dla pięciu PhG, takich jak utrata obojętna w procedurze eksperymentalnej: około 1 mg każdej próbki odważono w 10 ml probówce, w której 1 ml każdej fazy wstępnie zbilansowanego dwufazowego układu rozpuszczalników. Probówkę zakorkowano i energicznie wstrząsano przez 1 min i odstawiono do całkowitego rozdzielenia. Porcję 100 ?l każdej warstwy pobrano i odparowano oddzielnie do sucha pod próżnią w temperaturze?<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

LC-ESI-MS piku 1 pokazano na ryc. 4A. Zdeprotonowany jon cząsteczkowy [MH] – przy m/z 785 o dużej liczebności i dimeryczny zdeprotonowany jon cząsteczkowy.jon [2M H]— przy m/z 1571 był obserwowany w trybie ujemnym, co sugeruje masę cząsteczkową 786, która była taka sama jak w przypadku echinakozydu. Dalsze badania w eksperymencie LC–MS2 jonów m/z 785 dały jeden główny jon potomny przy m/z 623 (rys. 4B) wytworzony bezpośrednio z m/z 785 poprzez utratę ugrupowania kafeoilowego lub ugrupowania heksozowego jako [M 162 H]—. Widmo LC-MS3 m/z 623 wykazywało dwa główne jony przy m/z 477 i 461 oraz dwa mniejsze jony przy m/z 315 i 179 (ryc. 3C, tabela 2). Różnice mas między m/z 623 i jonami fragmentacyjnymi m/z 477 i 461 wynosiły odpowiednio 146 i 162, co odpowiada utracie jednostki ramnozy i jednostki glukozy lub jednostki kawoilu [M 162 H]-. Jony m/z 623 utraciły również ugrupowanie kawoilowe i ugrupowanie ramnozy, aby wytworzyć jony m/z 315. Jon przy m/z 179 został wytworzony z rozszczepienia ugrupowania kateoilowego, z ujemnym ładunkiem pozostającym na części ugrupowania kateoilowego. Eksperyment LC-ESI-MSN na autentycznym echinakozydzie wykazał ten sam wzór fragmentacji. Potwierdzono zatem, że pik 1 to echinakozyd.

Dla piku 2, LC-ESI-MS pokazała m/z 799 jako zdeprotonowany jon cząsteczkowy [MH]- i m/z 1599 jako jego jon dimeryczny, co sugeruje masę cząsteczkową 800. Podczas eksperymentów MS2 m/z 799 jonów utworzyło trzy córki przy m/z 637, 623 i 475 (tabela 1). Jon przy m/z 637 został ponownie wytworzony bezpośrednio z macierzystego jonu m/z 799 z powodu obojętnej utraty kafeoilu [M-162-H]- lub glukozy [M-162-H]-. Jon przy m/z 623 powstał w wyniku utraty rodnika CH2. Jon przy m/z 475 powstał z obojętnej utraty zarówno części kafeoilowej [M 162 H]-, jak i części glukozowej z jonu macierzystego. Eksperyment MS3 na m/z 637 wytworzył trzy jony przy m/z 619, 491 i 475, odpowiadające stratom odpowiednio jednej wody, jednostki ramnozy i reszty glukozy. Jon potomny m/z 623 wytworzył m/z 461 i 315 w badaniu MS3, które podążały tymi samymi ścieżkami fragmentacji co echinakozyd, jak omówiono powyżej. Dane LC-ESI-MSN potwierdziły wstępną identyfikację piku 2 jako cistanozydu A. Oba piki wykazały ten sam jon [MH]- przy m/z 623 i dimer przy m/z 1247 w trybie ujemnym (Tabela 1) są to prawdopodobnie izomery o tej samej masie cząsteczkowej

624, to samo co akteozyd i izoakteozyd. Widma MS2 jonów [MH]— również wykazywały jeden taki sam jon potomny m/z 461, co wskazywało na utratę ugrupowania kafeoilowego z jonu macierzystego m/z 623 (tabela 1). Podobne widma MS3 otrzymano dla dwóch związków. Dla piku 3 widmo MS3 jonu przy m/z 461 utworzyło trzy jony przy m/z 315, 161 i 135. m/z 315 powstaje po utracie ramnozy, jak omówiono wcześniej. Jon m/z 161 powstał w wyniku rozszczepienia ugrupowania kateoilowego, po którym nastąpiła dalsza utrata jednej wody; ładunek pozostał po części ugrupowania kafeoilowego. Jon przy m/z 135 [aglikon 18 H]— powstał w wyniku rozszczepienia wiązania glikozydowego w pozycji C1 z dodatkową utratą jednej wody, pozostawiając ładunek po części ugrupowania aglikonu. Widmo MS3 piku 4 przebiegało tym samym szlakiem fragmentacji co pik 3, z wyjątkiem brakującego jonu przy m/z 135. Jon cząsteczkowy i wzory fragmentacji tych dwóch związków są zgodne z danymi literaturowymi dotyczącymi akteozydu i izoakteozydu (Wang i in. ., 2000), chociaż znaleziono dodatkowy jon m/z 153, a dane protonowego NMR cistanozydu A i 20-acetyloakteozydu zostały przypisane jako [aglikon H]— przez Wang et al. (Wang i in., 2000). Jon ten mógł być niestabilny i tracić wodę, dając m/z 135 w naszym eksperymencie. Na podstawie danych MS i zgodnych czasów retencji pików 3 i 4 ze standardami są one zatem identyfikowane odpowiednio jako akteozyd i izoakteozyd.

Dane LC-ESI-MS piku 5 przedstawiono w tabeli 2. Odprotonowany jon cząsteczkowy [MH]— (m/z 665) był jedynym jonem znalezionym w trybie ujemnym, co oznacza masę cząsteczkową 666. Trzy jony potomne zaobserwowano przy m/z 623, 503 i 461 w eksperymencie MS2 (tabela 2). Jony potomne przy m/z 623 i 503 powstały bezpośrednio z jonu macierzystego przez utratę odpowiednio grupy COCH2 i ugrupowania kafeoilowego. Jon przy m/z 461 pochodził z utraty zarówno kafeoilu, jak i ugrupowania COCH2 [M 162 42 H]— z jonu macierzystego. W eksperymencie MS, m/z 623 dało m/z 461, a m/z 503 dało trzy jony przy m/z 485, 461 i 315. Widmo MS3 jonu potomnego m/z 461 dało dwa jony przy 443 i 315. Porównując wzór fragmentacji LC-MSN piku 5 z innymi związkami opisanymi w tym badaniu oraz z innymi opisanymi (Li et al., 2005; Wang et al., 2000), doszliśmy do wniosku, że pik 5 był strukturalnie silnie powiązany do akteozydu, przy czym jedyną różnicą jest jednostka COCH3 w pozycji R3. Wstępną tożsamość podano zatem pikowi 5 jako 20-acetyloakteozyd (Fig. 1).

Struktury dwóch wstępnie zidentyfikowanych związków, piku 2 (jako cistanozyd A) i piku 5 (jako 20-acetylo-akteozyd) zostały potwierdzone za pomocą 1H NMR. Przesunięcia chemiczne i stałe sprzężenia wszystkich protonów w związkach 2 i 5, jak pokazano w Tabeli 3., odpowiadały podanym danym NMR odpowiednio dla cistanozydu A i 20-acetyloakteozydu (Kobayashi i wsp., 1984, 1987) . Eksperymenty 2D NMR (długozakresowa korelacja COSY, ROESY i CH) zostały również przeprowadzone w niniejszym badaniu, co dodatkowo potwierdziło identyfikację (dane nieprzedstawione).

Acteoside z Cistanche deserticola

4. Wnioski

W niniejszej pracy HSCCC został z powodzeniem wykorzystany do izolacji i oczyszczania echinakozydu, cistanozydu A, akteozydu, izoakteozydu i 20-acetyloakteozydu z ekstraktu n-butanolowego C. deserticola. Jest to zatem sprawdzony środek do półpreparatywnej separacji substancji bioaktywnych. Tymczasem struktury pięciu PhG w C. deserticola zostały zbadane za pomocą LC-ESI-MSN; Stwierdzono pewne charakterystyczne cechy PhG, co pozwoliło na określenie grup funkcyjnych w strukturach. Metoda LC-ESI-MSN jest zatem potężnym narzędziem do szybkiej identyfikacji fenyletanoidów i ich glikozydów w ekstraktach z C. deserticola, szczególnie po potwierdzeniu danymi NMR.

Potwierdzenie

Autorzy chcieliby podziękować Jun Gu z Nuclear Magnetic Resonance Centre, University of Guelph, Ontario, Kanada za jej pomoc w eksperymentach NMR. Projekt ten był częściowo wspierany przez fundusze z prowincji Jilin w Chinach (nr 20060904).

Bibliografia

Chen, LJ, Gry, DE i Jones, J. (2003). Izolacja i identyfikacja czterech składników flawonoidowych z nasion Oroxylum Indicum metodą szybkiej chromatografii przeciwprądowej. Journal of Chromatography A, 988, 95-105.

Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., Ni, W. i Liu, CZ (2005). Kultury zawiesinowe komórek Cistanche deserticola: Biosynteza glikozydów fenyloetanoidowych i działanie przeciwutleniające. Biochemia procesowa, 40, 3119–3124.

Foucault, AP i Chevolot, L. (1998). Chromatografia przeciwprądowa: oprzyrządowanie, dobór rozpuszczalnika i niektóre najnowsze zastosowania w oczyszczaniu produktów naturalnych. Journal of Chromatography A, 808, 3-22.

Gross, G.-A., Lahloub, MF, Anklin, C., Schulten, H.-R. i Sticher, O. (1988). Teucrioside, glikozyd fenylopropanoidowy z Teucrium Chamaedrys. Fitochemia, 27, 1459-1463.

On, ZD, Lau, KM, Xu, HX, Li, PC i But, PPH (2000). Aktywność przeciwutleniająca glikozydów fenyloetanoidowych z szans Brandisia. Czasopismo etnofarmakologii, 71, 483-486.

Kobayashi H., Karasawa H. i Miyase T. (1984). Badania nad składnikami Cistanchis Herba. III. Izolacja i struktury nowych glikozydów fenylopropanoidowych, Cistanoside A i B. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, 3009-3014.

Kobayashi H., Oguchi H., Takizawa N., Miyase T., Ueno A., Usmanghani K. i in. (1987). Nowe glikozydy fenyloetanoidowe z Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. FI. Biuletyn chemiczny i farmaceutyczny, 35, 3309-3314.

Lei, L., Yang, FQ, Zhang, TY, Tu, PF, Wu, LJ i Ito, Y. (2001). Preparatywna izolacja i oczyszczanie akteozydu i 2'-acetyloakteozydu z Cistanches salsa (CA Mey) G. Beck metodą chromatografii przeciwprądowej. Journal of Chromatography A, 912, 181-185.

Li, L., Tsao, R., Liu, ZQ, Liu, SY, Yang, R., Young, JC, i in. (2005). Izolacja i oczyszczanie akteozydu i izoakteozydu z Plantago psyllium L. metodą szybkiej chromatografii przeciwprądowej. Journal of Chromatography A, 1063, 161-169.

Li, LL, Wang, XW i Wang, XF (1997). Przeciwutleniające i przeciwrodnikowe działanie glikozydów w herba Cistanches. China Journal of Chinese Materia Medica, 22, 364-367.

Li, J., Wang, PF, Zheng, RL, Liu, ZM i Jia, ZJ (1993). Ochrona glikozydów fenylopropanoidowych z Pedicularis przed hemolizą oksydacyjną in vitro. Planta Medica, 59, 315–317.

Lu, MC (1998). Badania nad uspokajającym działaniem Cistanche deserticola. Journal of Ethnopharmacology, 59, 161-165.

Nishimura H., Sasaki H., Inagaki N., Chin M. i Mitsuhashi H. (1991). Dziewięć glikozydów alkoholu fenetylowego firmy Stachys szeboldzz. Fitochemia, 30, 965-969.

Oka F., Oka H. i Ito Y. (1991). Systematyczne poszukiwanie odpowiednich dwufazowych układów rozpuszczalników do szybkiej chromatografii przeciwprądowej. Journal of Chromatography, 538, 99-108.

Ravn H., Nishibe S., Sasahara M. i Li X. (1990). Związki fenolowe z Plantago Asiatica. Fitochemia, 29, 3627-3631.

Schapoval, EES, Winter de Vargas, MR, Chaves, CG, Bridi, R., Zuanazzi, JA i Henriques, AT (1998). Działanie przeciwzapalne i antynocyceptywne ekstraktów i izolowanych związków ze Stachytarpheta cayennensis. Journal of Ethnopharmacology, 60, 53-59.

Shoyama Y., Matsumoto M. i Nishioka I. (1987). Glikozydy fenolowe z chorych korzeni Rehmannia glutinosa Var. Purpura. Fitochemia, 26, 983-986.

Wang, XW, Jiang, XY, Wu, LY i Wang, XF (2001). Oczyszczający wpływ glikozydów Cistanche deserticola na wolne rodniki i ich ochrona przed uszkodzeniami DNA indukowanymi przez OH in vitro. Journal of Chinese Pharmacology, 36, 29-31.