Ekstrakt z komórek Jasminum Sambac jako przeciwutleniacz przeciw starzeniu się skóry, część 1

Abstrakcyjny: Stres oksydacyjny odgrywa główną rolę w procesie starzenia się skóry poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i tworzenie zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE). Dlatego na rynku produktów do pielęgnacji skóry potrzebne są składniki przeciwutleniające, a wykorzystanie molekuł pochodzących z kultur komórek roślinnych stwarza wyjątkową okazję. W pracy zbadano właściwości ekstraktu wodno-etanolowego otrzymanego przez komórki Jasminum sambac (JasHEx). Właściwości przeciwutleniające i przeciwdziałające AGE badano za pomocą multidyscyplinarnego podejścia, łączącego spektrometrię mas i bioinformatyczne eksperymenty in vitro i ex vivo. JasHEx zawiera pochodne kwasu fenolowego, lignany i triterpeny i stwierdzono, że zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu w cytozolu w keratynocytach narażonych na stres egzogenny. Wykazał również zdolność do zmniejszania powstawania AGE i zwiększania produkcji kolagenu typu I w macierzy zewnątrzkomórkowej. Dane wykazały, że właściwości przeciwutleniające JasHEx były związane z jego aktywnością wychwytywania wolnych rodników i chelatowania metali oraz aktywacją szlaku Nrf2/ARE. Może to dobrze wyjaśniać działanie przeciwzapalne JasHEx związane ze spadkiem poziomów NO w makrofagach stymulowanych LPS. Zatem JasHEx można uznać za silny wzmacniacz przeciwutleniaczy przeciwko starzeniu się skóry wywołanemu stresem oksydacyjnym.

Glikozyd cistanche może również zwiększać aktywność SOD w tkankach serca i wątroby oraz znacznie zmniejszać zawartość lipofuscyny i MDA w każdej tkance, skutecznie wymiatając różne reaktywne rodniki tlenowe (OH-, H₂O₂, itp.) i chroniąc przed uszkodzeniami DNA spowodowanymi przez rodniki OH. Glikozydy fenyloetanoidowe Cistanche mają silną zdolność wychwytywania wolnych rodników, wyższą zdolność redukującą niż witamina C, poprawiają aktywność SOD w zawiesinie plemników, zmniejszają zawartość MDA i mają pewien ochronny wpływ na funkcję błony plemników. Polisacharydy Cistanche mogą zwiększać aktywność SOD i GSH-Px w erytrocytach i tkankach płuc eksperymentalnie starzejących się myszy wywołaną przez D-galaktozę, a także zmniejszać zawartość MDA i kolagenu w płucach i osoczu oraz zwiększać zawartość elastyny, mają dobry efekt zmiatania DPPH, przedłuża czas niedotlenienia u starzejących się myszy, poprawia aktywność SOD w surowicy i opóźnia fizjologiczną degenerację płuc u doświadczalnie starzejących się myszy Eksperymenty z degeneracją morfologiczną komórek wykazały, że Cistanche ma dobrą zdolność przeciwutleniającą i ma potencjał, aby być lekiem do zapobiegania i leczenia chorób związanych ze starzeniem się skóry. Jednocześnie echinakozyd w Cistanche ma znaczną zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH i może wychwytywać reaktywne formy tlenu, zapobiegać degradacji kolagenu wywołanej przez wolne rodniki, a także ma dobry wpływ naprawczy na uszkodzenia anionów wolnych rodników tyminy.

Kliknij Gdzie mogę kupić Cistanche

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Słowa kluczowe: starzenie się skóry; reaktywne formy tlenu (ROS); zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE); hydroetanolowy ekstrakt z jaśminu wielkolistnego (JasHEx); spekrtometria masy; metabolomika; Globalna społeczna sieć molekularna produktów naturalnych (GNPS); czynnik jądrowy erytroidalny 2-powiązany czynnik 2 (Nrf2)

1. Wstęp

Genetyczne czynniki wewnętrzne i czynniki zewnętrzne, takie jak promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie podczerwone, ksenobiotyki i zanieczyszczenia środowiska, powodują wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS). Powstają w wyniku aktywacji mitochondrialnego łańcucha oddechowego, cytochromu p450 i oksydaz NADPH [1]. RFT obejmują wolne rodniki (anion ponadtlenkowy, rodnik hydroperoksylowy, rodnik alkoksylowy i rodnik hydroksylowy) oraz cząsteczki nierodnikowe (nadtlenek wodoru i tlen singletowy) [2]. Kiedy systemy antyoksydacyjne są przeciążone, ROS gromadzą się w komórkach i generują tak zwany stres oksydacyjny, który jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do starzenia się skóry [3].

Rzeczywiście, stres oksydacyjny powoduje zarówno uszkodzenie DNA, jak i utlenianie lipidów i białek, wraz z wyzwalaniem szlaku kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAPK) (AKT, JNK, ERK i p38) [4]. To z kolei promuje ekspresję cytokin prozapalnych, czynników wzrostu i cząsteczek adhezyjnych poprzez stymulację czynników transkrypcyjnych AP-1 i NF-κB. Ponadto aktywacja szlaku MAPK powoduje zmiany w macierzy skóry poprzez zmniejszenie poziomu kolagenu. Przyspiesza rozpad kolagenu poprzez modulację ekspresji metaloproteinaz macierzy (MMP) i ich tkankowych inhibitorów TIMP oraz zmniejsza syntezę nowego kolagenu poprzez blokowanie sygnalizacji receptora TGF typu II/Smad. Oprócz tego stres oksydacyjny zmienia stan skóry, zaburzając naskórkowy gradient wapnia, niezbędny dla integralności i funkcji zrogowaciałej otoczki, stymulując pracę gruczołów łojowych i indukując degenerację melanocytów [5].

Równolegle tworzenie zmodyfikowanych biomolekuł znanych jako zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE) sprzyja stresowi oksydacyjnemu w komórkach i tkankach [6]. Rozwój tych biomarkerów starzenia jest indukowany przez różne czynniki środowiskowe, takie jak dym papierosowy, dieta bogata w rafinowane i proste węglowodany, żywność gotowana w wysokiej temperaturze oraz siedzący tryb życia; AGEs to stabilne i nieodwracalne produkty powstałe w wyniku nieenzymatycznej reakcji między cukrami redukującymi a białkami, kwasami nukleinowymi lub lipidami, po której następują dalsze rearanżacje [7]. Rzeczywiście, punktem wyjścia do powstania AGE jest reakcja Maillarda, w której grupy karbonylowe cukrów redukujących reagują odwracalnie z wolnymi grupami aminowymi białek, kwasów nukleinowych lub aminofosfolipidów, tworząc zasady Schiffa. Te iminy spontanicznie przekształcają się w bardziej stabilną ketaminę, zwaną produktami Amadori. Wytwarzają reaktywne dikarbonyle (takie jak glioksal lub metyloglioksal), które reagują z funkcyjnymi grupami lizyny i argininy w białkach, dając bardzo różnorodne AGE [8,9]. Dzieli się je na różne grupy w oparciu o ich zdolność do emitowania fluorescencji i tworzenia wiązań poprzecznych.

W działaniu AGE pośredniczą receptory AGE (RAGE), które są białkami transbłonowymi należącymi do nadrodziny immunoglobulin cząsteczek powierzchniowych komórek typu I, wyrażanych w różnych typach komórek, w tym w keratynocytach, fibroblastach i makrofagach. Wiążące AGE/RAGE zwiększają produkcję RFT głównie poprzez aktywację oksydaz NADPH (NOX) i mitochondrialnego łańcucha oddechowego, prowadząc do stresu oksydacyjnego i wszystkich opisanych powyżej skutków ubocznych [6,8].

Ponadto białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), zwłaszcza kolagen, są bardzo wrażliwe na glikację. Rzeczywiście, poziomy pentozydyny o strukturze AGE, pochodzącej z kolagenu, są znacznie wyższe u osób starszych niż u młodych [10]. Glikacja kolagenu zmienia nie tylko właściwości mechaniczne samego kolagenu, który staje się sztywniejszy i bardziej kruchy [11], ale także macierzy zewnątrzkomórkowej, wpływając na zachowanie komórek rezydentnych (wzrost, różnicowanie, ruchliwość, ekspresję genów i odpowiedź na cytokiny) oraz interakcje macierz – komórka [12].

W tym scenariuszu składniki przeciwutleniające są bardzo poszukiwane w kosmetyce w celu zmniejszenia powstawania AGE i związanej z nimi kaskady oksydacyjnej: ekstrakty pochodzące z gatunku Jasminum sambac, należącego do rodziny Oleaceae, są interesujące ze względu na ich właściwości przeciwutleniające i ich łączne zastosowanie w medycynie ludowej lek stosowany w leczeniu chorób skóry [13]. Jednak ekstrakty roślinne wykazują kilka wad, takich jak słaba biozrównoważoność, potencjalne zanieczyszczenie pestycydami, nawozami lub patogenami oraz zmienność ich składu jakościowego i ilościowego, na którą wpływają pory roku i warunki środowiskowe. Ważną alternatywą dla roślin jako źródła bioaktywnych składników kosmetycznych są hodowle komórek roślinnych, które oferują kilka zalet: (i) wysoki stopień zrównoważenia procesu produkcji, ponieważ nie są potrzebne grunty rolne; (ii) ciągłe dostawy produktów naturalnych bez zależności geograficznej, sezonowej i cyklu reprodukcyjnego roślin; (iii) brak ryzyka zanieczyszczenia patogenami, zanieczyszczeniami środowiska i pozostałościami agrochemicznymi; (iv) wystandaryzowane warunki wzrostu, które pozwalają na uzyskanie wyższych i bardziej powtarzalnych wskaźników wydajności biomasy i metabolitów; (v) duża wszechstronność, ponieważ stężenie związków można optymalizować poprzez zmianę warunków hodowli oraz (vi) łatwiejsze i mniej czasochłonne protokoły ekstrakcji, zmniejszające zapotrzebowanie na agresywne rozpuszczalniki [14,15].

Tutaj badano wodnoetanolowy ekstrakt pochodzący z kultur komórkowych Jasminum sambac (JasHEx). Celem naszych badań jest szeroka charakterystyka chemiczna i biologiczna JasHEx, w szczególności badanie jego właściwości przeciwglikacyjnych i przeciwstarzeniowych. Najpierw zastosowano zaawansowane podejścia oparte na spektrometrii mas, aby uzyskać szczegółową charakterystykę strukturalną ekstraktu. Następnie przeprowadzono eksperymenty in vitro i ex vivo w celu udowodnienia biologicznej aktywności JasHEx jako przeciwutleniacza.

2. Materiały i metody

2.1. Kultury tkanek roślinnych i przygotowanie ekstraktów

Certyfikowany jaśmin arabski (Jasminum sambac) uzyskano z lokalnej szkółki („Ladre di Piante”, Pistoia, region Toscana, Włochy). Liście jaśminu wielkolistnego moczono w 7{6}}% etanolu (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) przez 1 minutę i sterylizowano powierzchniowo 1% (obj.) dostępnego w handlu wybielacza z dodatkiem Tween 2{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) przez 8 minut, a następnie trzykrotnie płukano sterylną wodą destylowaną. Następnie liście pocięto na kawałki 0,5–1,{22}} cm i hodowano na pożywce MS o pełnej mocy [16] zawierającej 3% (wag./obj.) sacharozy, 0 0,2 mg/L 2,4D i 8 g/L fito-agaru. Eksplantaty hodowano co miesiąc na świeżą pożywkę przez trzy miesiące. Po uzyskaniu żółto-zielonego, kruchego i szybko rosnącego kalusa komórki roślinne przenoszono do płynnej pożywki MS, uzupełnionej 3% (wag./obj.) sacharozą i 0,2 mg/l 2,4D. Zawiesinę mieszano w wytrząsarce obrotowej o godzinie 23:00 iw temperaturze 27°C w pomieszczeniu o ciemnym klimacie. Ciemne komórki powiększano co tydzień z kolb na małą skalę do kolb na dużą skalę, aż osiągnięto płynną zawiesinę hodowli około 177 g/l. Przygotowanie hydroetanolowego ekstraktu hodowli komórkowej Jasminum sambac (JasHEx) przeprowadzono przez dodanie 2000 ml roztworu etanol/woda (90/10, v/v) do 500 g komórek. Mieszaninę homogenizowano przez 3 min przy 1500 obr/min i 6 min przy 3800 obr/min stosując młyn nożowy Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Niemcy). Otrzymaną zawiesinę mieszano z szybkością 400 obrotów na minutę przez 2 godziny w temperaturze 25°C, unikając ekspozycji na światło. Zawiesinę następnie wirowano przy 6300 obr./min przez 10 min w 4°C. Supernatant usunięto, przesączono, a następnie zatężono pod próżnią w wyparce rotacyjnej (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Niemcy) ustawionej na 25°C. Na koniec pH doprowadzono do 7,0 za pomocą 10 N NaOH, a następnie liofilizowano do uzyskania drobnego proszku.

2.2. Analiza UPLC-MS/MS do charakterystyki chemicznej JasHEx

Uzyskano dwufazową ekstrakcję butanol/woda. Frakcję butanolu wysuszono i rozmrożono w metanolu (10 mg/ml) przed analizą UPLC-MS/MS przeprowadzoną na spektrometrze masowym Q-Exactive Classic wyposażonym w system UltiMate™ 3000 UPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ). Wszystkie przebiegi chromatograficzne przeprowadzono w sposób opisany już przez Ceccacciego i in. [17].

2.3. Globalne analizy sieci społecznościowych molekularnych produktów naturalnych

Do identyfikacji metabolitów wykorzystano Global Natural Products Social Molecular Networking [18]. Wszystkie te sygnały MS i MSMS nieprzypisane przez GNPS zostały mądrze zbadane i przypisane zgodnie z literaturą. Pliki RAW zostały przekonwertowane do formatu mzXML przez oprogramowanie MS Converter General User Interface, przed przeszukaniem biblioteki widmowej GNPS. Przeprowadzono to stosując tolerancję masy jonu prekursora 0.{3}} 25 Da, tolerancję masy jonu fragmentacyjnego 0,02 Da, minimalne dopasowane piki 2 i próg punktacji 0,7. Wyniki zostały potwierdzone ręcznie.

Wstępne przetwarzanie danych zostało przeprowadzone przez Mzmine (wersja 2.53, Softpedia, Bukareszt, Rumunia) [19], a zadanie Feature-Based Molecular Networking (FBMN) [20] zostało wykonane, jak donosi Ceccacci i in. [17]. Uzyskane pliki sieciowe importowano do Cytoscape (wersja 3.9.1, US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Bethesda, MD, USA) [21].

2.4. Analiza ilościowa lignanów i triterpenów

Te same ustawienia UPLC, które podano dla eksperymentów jakościowych, zastosowano do ilościowej analizy lignanów, podczas gdy dla triterpenów ulepszono je, aby rozdzielić dwie pary izomerów, kwas arjunolowy/kwas azjatycki i kwas oleanolowy/ursolowy. Analizę przeprowadzono na klasycznym spektrometrze masowym Q-Exactive, jak zdefiniowano wcześniej. Rozdział przeprowadzono za pomocą Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, USA) EVO C18 300 Å (150 x 2,1 mm, wielkość cząstek 5 µm). Faza ruchoma składała się z A (5 mM wodny roztwór octanu amonu, pH 9,{8}} skorygowane wodorotlenkiem amonu) i B (1{{40}}0 procent acetonitrylu) przy użyciu elucja gradientowa 13–28% B w 0–20 min, 28–65% B w 20–24 min, 65–75% B w 24–28 min, 75–95% w 28–28,5 min, 95% w 28,5 –32 min, 95–13 procent w 32–32,1 min i 13 procent w 32,1–44 min. Szybkość przepływu wynosiła 0,450 ml/min, a objętość wstrzyknięcia wynosiła 5 ul. Zarówno dla lignanów, jak i triterpenów dane uzyskano metodą masową opisaną przez Ceccacci i in. [17]. Kupiliśmy nortachelogeninę (#LCA52174) od Biosynth Carbosynth, matairezinol (#80497) i kwas maslinowy (#83209) od PhytoLab GmbH & Co.KG, secoisolariciresinol (#60372) i kwas arjunolowy (#SMB00119) od Sigma-Aldrich (Saint Louis , MI, USA), kwas azjatycki (nr 0027), kwas oleanolowy (nr 0041 S) i kwas ursolowy (nr 0037 S) z firmy Extrasynthèse (Genay, Francja). Krzywe kalibracji uzyskano przez wstrzyknięcie wzorców w stężeniu od 0,05 do 25 µM dla lignanów i od 0,1 do 25/250 µM dla triterpenów. Granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) dla wzorców wyznaczono na podstawie stosunku sygnału do szumu (S/N).

2.5. Hodowle komórek skóry i eksplanty

Unieśmiertelnione ludzkie keratynocyty (HaCaT), zakupione od Addexbio Technologies (San Diego, CA, USA), były konserwowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), która została uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) w 95 procentach powietrza, 5 procentach CO2 i wilgotnej atmosferze w temperaturze 37°C. Ludzkie fibroblasty skórne (HDF) konserwowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) uzupełnionej 10 procentami płodowej surowicy bydlęcej (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ) w 95 procentach powietrza, 5 procentach CO2 i wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 ◦C. Eksplantaty skóry, pobrane ze skóry zdrowych dawczyń (w wieku 31 i 40 lat) w centrum chirurgicznym Villa Cinzia (Neapol, Włochy), hodowano w 24- płytkach transwell w DMEM/FBS plus antybiotyki w warunkach powietrze-ciecz w temperaturze 37 ◦C w nawilżonym powietrzu o zawartości 5% CO2. Wszyscy dawcy wyrazili pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie tkanek skóry, zgodnie z Deklaracją Helsińską.

2.6. Cytosolowy test ROS w H2O{3}} poddanych stresowi komórkach HaCaT

W tym procesie 1,8 × 104 HaCaT wysiano w 96-płytkach studzienkowych i hodowano przez 20 godz. Następnie komórki traktowano przez 2 godziny różnymi stężeniami JasHEx (0,0006 procent, 0,002 procent i 0,006 procent p/v) lub 500 µM kwasu askorbinowego, stosowanego jako kontrola pozytywna. Następnie przemyto je w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) i inkubowano w 37°C z 100 µl/studzienkę roztworu zawierającego: 10 mM Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM glukozy i 5 mM µM CM-H2DCFDA (5-(i-6)-chlorometyl-20,70 -dioctan dichlorodihydrofluoresceiny, Invitrogen). Po 45 minutach przeprowadzono płukanie PBS i zmierzono wyjściową intensywność fluorescencji komórek przy 535 nm (wzbudzenie 485 nm), stosując instrument EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Następnie wywołano stres oksydacyjny przez dodanie 450 µM H2O2 i po 30 minutach zmierzono fluorescencję próbek.

2.7. Test immunoenzymatyczny (ELISA) do wykrywania AGE w komórkach ludzkich fibroblastów skóry właściwej (HDF) poddanych stresowi glioksalem

Na tym etapie 1,5 × 104 HDF wysiano w 96-płytkach ze studzienkami i hodowano przez 2 dni. Po przemyciu PBS komórki utrwalano przez 1{{1{13}}}} min za pomocą 100 µl 4% formaldehydu w PBS. Następnie traktowano je JasHEx (0,0006 procent i 0,002 procent p/v) lub kontrolą pozytywną 1 µM aminoguanidyny w obecności 0,5 procent glioksalu w temperaturze 50°C przez 1 tydzień. Po inkubacji poddano je obróbce do testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu swoistego przeciwciała przeciwko AGE (Abcam ab23722).

2.8. ImmunoHistoFluorescencyjny test eksplantatów ze skóry obciążonej metylo-glioksalem do wykrywania fibryliny -1

Eksplantaty skóry pochodziły od dwóch pacjentów w wieku 31 i 4 0 lat. Z każdej biopsji skóry wygenerowano trzy stemple dla każdego zabiegu występującego na granicy faz powietrze-ciecz. Pierwszego dnia stemple traktowano JasHEx (0,{22}}02 procent i 0,006 procent p/v) lub kontrolą pozytywną (1 mM aminoguanidyna), a po 24 h 500 µM metylo- dodano glioksal. Zabiegi odświeżano co dwa dni przez łącznie siedem dni. Pod koniec okresu stemple poddano analizie histologicznej, utrwalono w 4 procentach PFA, inkubowano w 15 procentach sacharozy, a następnie w 30 procentach sacharozy i przechowywano w stanie kriogenicznym w związku OCT (optymalna temperatura cięcia) w -80 ◦C . Krioskrawki 5 µm uzyskano za pomocą kriostatu CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, USA). Szkiełka z krioskrawkami nawilżano przez 30 minut w PBS i umieszczano w roztworze „blokującym” (6 procent BSA, 5 procent surowicy, 20 mM MgCl2, 0,2 procent Tween) na 1 godzinę. Następnie inkubowano je z pierwotnym przeciwciałem anty-fibrylina 1 (MA 5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). przez 16 godzin w 4 ◦C. Szkiełka przemyto PBS przez 30 minut, a następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem przeciw króliczym Alexa-Fluor 546 (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) przez 1 godzinę. Jądra barwiono DAPI (40, 6-5diamidyno{38}}fenyloindolem) 1 g/ml w PBS przez 10 min. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i przeanalizowano za pomocą oprogramowania ImageJ (wersja 1.53a, National Institutes of Health, USA).

2.9. Test AlphaLISA do pomiaru zawartości peptydu C (PIP) prokolagenu typu I

Na tym etapie 8 × 103 HDF wysiano w 96-płytce ze studzienkami i traktowano przez 24 godziny JasHEx (0.0006 procent, 0,002 procent, i 0,006 procent p/v) lub TGF- (2,5 ng/ml). Po traktowaniu komórki przetwarzano zgodnie z instrukcjami dostawcy zestawu do kolagenu alfa LISA hPIP (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)).

2.10. Nrf2 Test aktywacji transkrypcji oparty na lucyferazie

Tutaj 6 × 103 komórek HaCaT w 96-dołkowej płytce wysiano i hodowano przez 16 godzin. Następnie poddano je testowi aktywacji transkrypcji opartej na lucyferazie Nrf2, stosując zestaw reporterowy ARE BPS Bioscience (San Diego, Kalifornia, USA, nr 60514). Gotowy do transfekcji wektor reporterowy lucyferazy ARE (zawierający gen lucyferazy świetlika pod kontrolą elementów reagujących na ARE zlokalizowanych powyżej minimalnego promotora) wraz z kontrolą wewnętrzną (konstytutywnie wyrażający wektor lucyferazy Renilla) przejściowo kotransfekowano do komórek HaCaT przy użyciu Odczynnik do transfekcji DNA X-TREME gen HP (Roche, Basilea, Szwajcaria, nr 6366244001). Po transdukcji przez 24 godziny, komórki traktowano przez 2 godziny ekstraktem (0,0006 procent, 0,002 procent i 0,006 procent p/v) lub kontrolą pozytywną Resweratrolem (50 uM). Następnie poddano je testowi lucyferazy za pomocą systemu Dual-Glo Luciferase Assay (Promega, Rzym, Włochy nr E2920). W skrócie, komórki inkubowano z substratem lucyferazy świetlika przez 10 minut przed pomiarem luminescencji w 96- czytniku płytek (Victor Nivo, Waltham, MA, USA). Obliczono stosunek luminescencji świetlika i Renilli, aby znormalizować i porównać aktywność transkrypcyjną Nrf2.

2.11. Analiza ekspresji genów SOD-1(NM_000454.5) i OH-1(NM{6}}.3) w komórkach HaCaT

W tym procesie 1,5 × 105 komórek HaCaT na studzienkę hodowano w płytkach 6-dołkowych przez 16 godzin i inkubowano przez 6 godzin z ekstraktem (0,002 procent i 0,006 procent p/v) lub 50 uM resweratrolu jako kontroli pozytywnej. Pod koniec inkubacji całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu „GenElute™ Total RNA Purification” (od Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA) i traktowano DNazą I (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) w 37°C ◦C przez 30 min, aby usunąć zanieczyszczenie genomowym DNA.500 ng całkowitego RNA poddano retrotranskrypcji przy użyciu enzymu Odwrotna transkryptaza (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).Półilościowe RT-PCR przeprowadzono przy użyciu pary uniwersalnych startery 18S primer/competitor (Invitrogen- Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) jako standardy wewnętrzne.Produkty PCR rozdzielono na 1,5% żelu agarozowym i oglądano za pomocą instrumentu iBright (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Sekwencje starterów użytych do amplifikacji były następujące: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAATGTTGAGCAGGAA.

2.12. Test tlenku azotu w stymulowanym LPS RAW 264.7

Stężenie NO określono w mysich makrofagach RAW 264.7, zaszczepionych w stężeniu 1,5 × 105 komórek/dołek w 96-płytkach dołkowych na 24 godziny i wstępnie traktowanych ekstraktem ({{1 0}}0,0006 procent, 0,002 procent i 0,006 procent p/v) lub z 10 µM TPCK (kontrola pozytywna) przez 2 godziny, przed inkubacją z 2 µg/ml LPS przez 18 godzin. Ilość NO przekształconego w azotyny obliczono dodając odczynnik Griessa (roztwór N-(1-naftylo)etylenodiaminy i kwasu sulfanilowego, Invitrogen- Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i po 30 min absorbancję mierzono przy 540 nm za pomocą czytnika płytek wielodołkowych (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)

3. Wyniki

3.1. Jakościowa i ilościowa analiza ekstraktu wodno-etanolowego hodowli komórkowej Jasminum sambac (JasHEx)

Przeprowadzono analizę UPLC-MS/MS JasHEx i przeanalizowano dane spektrometryczne o wysokiej rozdzielczości za pomocą Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), internetowego systemu spektrometrii mas, który pomaga w adnotacji produktów naturalnych (NP) [18] . W szczególności wykonano bibliotekę widmową GNPS, aby uzyskać dereplikację online. Gatunki chemiczne niezidentyfikowane przez GNPS zostały przyporządkowane zgodnie z literaturą. Jak pokazano na rycinach 1 i 2 oraz w tabeli 1, zidentyfikowano ponad 50 związków należących do kilku klas metabolitów wtórnych, głównie polifenoli i terpenów. Ekstrakt JasHEx zawiera pochodne kwasu fenolowego, lignany (secoisolariciresinol, nortrachelogeninę i matairezinol) oraz triterpenoidy (kwas arjunolowy, kwas asparaginowy, kwas maslinowy, kwas oleanolowy i kwas ursolowy).

【Więcej informacji:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】