Utrwalacz Karnowskiego zapobiega pojawianiu się artefaktów jako wakuolizacji powstałej w wyniku przetwarzania tkanki w nerkach leczonych antysensownym oligonukleotydem Ⅰ

Abstrakcyjny: Oligonukleotyd antysensowny(ASO) uznano za nową metodę leczenianieuleczalne choroby. Wnerki leczone ASO, wakuole, oprócz bazofilnych granulek, często obserwuje się w kanalikach bliższych. W niektórych raportach opisano, że te wakuole są prawdopodobnie zjawiskiem wtórnym wynikającym zekstrakcja ASOpodczas obróbki tkanek. W tym badaniu porównaliśmy morfologię nerek po utrwaleniu utrwalaczem Karnovsky'ego lub 4% buforem fosforanowym paraformaldehydu (PFA) z 10% obojętnym buforowanym roztworem formaldehydu (NBF). Badano samice szczurów Sprague-Dawley, którym dożylnie czterokrotnie podano 50 mg/kg zablokowanego kwasu nukleinowego zawierającego antysensowne oligonukleotydy (LNA-ASO) przez 1 lub 2 tygodnie. Mikroskopowo w nerkach utrwalonych za pomocą NBF obserwowano wakuole i ziarnistości zasadochłonne w kanalikach proksymalnych. Granulki zasadochłonne wskazują na akumulację ASO. Co więcej, niektóre wakuole zawierały również słabe granulki zasadochłonne, co sugeruje, że wakuole były istotne dla akumulacji ASO. Chociaż zaobserwowano umiarkowaną wakuolizację w kanalikach bliższych, większość wakuolizowanych nabłonków nie wykazała obecności cząsteczki uszkodzenia nerek-1 w barwieniu immunohistochemicznym. W próbkach poddanych utrwalaniu Karnowskiego nie zaobserwowano wakuoli w kanalikach bliższych, chociaż zaobserwowano ziarnistości zasadochłonne. W próbkach utrwalonych PFA w kanalikach proksymalnych zaobserwowano wakuole i ziarnistości zasadochłonne, podobne do tych w próbkach utrwalonych NBF. Ogólnie rzecz biorąc, nasze odkrycia wykazały możliwość przeszacowania wakuolizacji z powodu artefaktów podczas przetwarzania tkanki podczas stosowania konwencjonalnego utrwalania NBF. Utrwalacz Karnowskiego jest uważany za użyteczną alternatywę dla odróżnienia sztucznych wakuoli od prawdziwej nefrotoksyczności. (DOI: 10.1293/toks.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Słowa kluczowe:antysensowny oligonukleotyd, artefakt,Utrwalacz Karnowskiego, wakuolizacja, ziarnistość zasadochłonna, nerka

Suplement Cistanche Suplement wspomagający czynność nerek PhGs75% Ech 30% Act 12%

Niedawno opracowano terapie oligonukleotydami antysensownymi (ASO) jako nowe metody leczenia nieuleczalnych chorób1, 2. ASO to krótkie, syntetyczne, jednoniciowe oligodeoksynukleotydy, które wiążą się z kwasem rybonukleinowym i hamują ekspresję genów3.

Pod względem toksykologicznym toksyczności wywołane ASO dzieli się na toksyczności zależne od hybrydyzacji, które są związane z sekwencją ASO, i toksyczności niezależne od hybrydyzacji, które są związane z modyfikacją chemiczną. Toksyczność niezależna od hybrydyzacji jest indukowana przez trzy główne mechanizmy: 1) akumulację ASO, 2) działanie prozapalne i 3) działanie wiązania aptamerycznego4. Kumulację ASO obserwuje się przede wszystkim w wątrobie i nerkach, a nadmierna kumulacja prowadzi do dysfunkcji tych narządów5. Działanie prozapalne jest indukowane przez stymulację wrodzonego układu odpornościowego poprzez wiązanie z receptorami Toll-podobnymi u gryzoni i małp lub aktywację alternatywnego szlaku dopełniacza poprzez hamowanie czynnika H przez ASO u małp6. Aptameryczny efekt wiązania indukuje aktywację i agregację płytek krwi/trombocytopenię w celu związania się z receptorem specyficznym dla płytek7. Co więcej, za jedną z przyczyn hepatotoksyczności uważa się wiązanie aptameryczne z białkami wewnątrzkomórkowymi w hepatocytach8–10. Aby wykryć te toksyczności, badacze opracowali kilka testów nieklinicznych; wśród nich badanie histopatologiczne jest jednym z najczulszych testów wykrywających akumulację ASO.

Histopatologicznie akumulację ASO powszechnie obserwuje się w postaci bazofilnych ziarnistości w cytoplazmie komórek Kupffera w wątrobie lub kanalikach proksymalnych nerek. Wyraźne nagromadzenie ziarnistości zasadochłonnych jest skorelowane ze zwiększoną częstością lub nasileniem zmian zwyrodnieniowych, powszechnie obserwowanych jako wakuolizacja lub zwyrodnienie/martwica nabłonka kanalików proksymalnych w nerkach4. Same granulki zasadochłonne nie są uważane za mające znaczenie toksykologiczne11; dlatego też rozróżnienie akumulacji ziarnistości zasadochłonnych od zmian zwyrodnieniowych jest ważne dla oceny toksyczności związanej z ASO.

Wakuole, które często obserwuje się w kanalikach proksymalnych nerek małp cynomolgus leczonych ASO, zawierają materiał bazofilowy i wykazują taki sam ogólny rozkład w komórkach jak granulki zasadochłonne11, 12. Kilka raportów sugeruje, że proces wiązania może wpływać na pojawienie się akumulacji ASO w przedziale fagolizosomalnym5, 11. Dodatkowo Henry i in. i Engelhardt opisali, że wakuole w kanalikach bliższych są prawdopodobnie zjawiskiem wtórnym wynikającym z ekstrakcji ASO podczas przetwarzania, ponieważ wakuole są nieobecne w nerkach utrwalonych perfuzją paraformaldehydu/glutaraldu5, 11. Wakuole w kanalikach bliższych małp cynomolgus leczonych Spekulowano, że mipomersen może pojawiać się podczas procesu utrwalania13.

Tak więc, chociaż wakuolizacja spowodowana leczeniem ASO może w niektórych przypadkach być artefaktem, hipoteza ta nie została jasno udowodniona i w żadnym raporcie nie wskazano odpowiedniej metody utrwalania do oceny toksykologicznej. W związku z tym w tym badaniu porównaliśmy morfologię nerek po utrwaleniu utrwalaczem Karnovsky'ego lub 4% buforem fosforanowym paraformaldehydu (PFA) z 10% obojętnym buforowanym roztworem formaldehydu (NBF). Dodatkowo wykazaliśmy użyteczność utrwalacza Karnowskiego jako alternatywnego utrwalacza zapobiegającego wakuolizacji spowodowanej artefaktami.

Czterotygodniowe samice szczurów Sprague-Dawley zakupiono od Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japonia) i aklimatyzowano do warunków laboratoryjnych. Zwierzęta trzymano w kontrolowanych warunkach (12-godzinny cykl światło/ciemność, temperatura 23 ± 2 stopnie, wilgotność względna 50 ± 25%) i miały swobodny dostęp do standardowej dostępnej na rynku diety (autoklawowana CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japonia) i wodę z kranu. Dwadzieścia zwierząt przydzielono do następujących czterech grup (po pięć zwierząt w każdej): 1-grupa leczona solą fizjologiczną przez tydzień (kontrola- 1W), 2-grupa leczona przez tydzień solą fizjologiczną (kontrola{ {14}}W), grupa traktowana przez 1-tydzień zablokowanego kwasu nukleinowego zawierającego antysensowny oligonukleotyd (LNA-ASO) (ASO-1W) i 2-tydzień grupa traktowana LNA ASO (ASO-2W). W chwili rozpoczęcia podawania 50 mg/kg LNA-ASO zwierzęta miały 5 tygodni. LNA-ASO podawano dożylnie w sumie cztery razy według następującego schematu: dni 1, 4, 8 i 11 w grupie ASO-2W; oraz dni 1, 2, 3 i 4 w grupie ASO-1W. Zwierzęta w grupach kontrolnych-1W i ASO-1W uśmiercono w dniu 7. Zwierzęta w grupach kontrolnych-2W i ASO-2W uśmiercono w dniu 14. Podczas każdej końcowej sekcji zwłok pobierano próbki krwi do badań patologicznych z żyły głównej brzusznej w głębokim znieczuleniu izofluranem. Po pobraniu krwi wszystkie szczury uśmiercono poprzez wykrwawienie poprzez natychmiastowe przecięcie aorty brzusznej. Zbadano zewnętrzną powierzchnię ciała, jamę klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz wnętrzności, a nerki lewe pobrano i przygotowano do badania mikroskopowego. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z Zasadami karmienia i przechowywania zwierząt doświadczalnych i eksperymentów na zwierzętach Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Próbki surowicy uzyskano poprzez odwirowanie próbek krwi w temperaturze 4 stopni. Analizę biochemiczną surowicy przeprowadzono przy użyciu urządzenia TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japonia) w celu oceny poziomów azotu mocznikowego (BUN) i kreatyniny (CRE) we krwi

Nerki utrwalono trzema roztworami utrwalającymi w następujący sposób: Po podzieleniu nerki poprzecznie na trzy części, środkową część, w tym miedniczkę nerkową, utrwalono w 10% NBF na 5 dni; część czaszkową utrwalono w utrwalaczu Karnovsky'ego (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokio, Japonia); a część ogonową utrwalono w 4% PFA na 17 godzin w temperaturze 4 stopni, a następnie umieszczono w 10% NBF na 24 godziny. Każdą utrwaloną próbkę odwodniono i zatopiono w parafinie. Przygotowano skrawki tkanek do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E). Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko cząsteczce uszkodzenia nerek-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; rozcieńczenie 1:300) i białku błonowemu związanemu z lizosomami 2 (LAMP{{ 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA; rozcieńczenie 1:1000) po pobraniu antygenu (bufor cytrynianowy, pH 6,0, ogrzewany przez 10 minut lub ogrzewany pod ciśnieniem przez 20 minut). Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japonia).

Usługa pomocnicza Wecistanche:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kup więcej szczegółów specyfikacji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop