Warianty apolipoproteiny L1 związane z chorobą nerek wykazują wzmocnienie funkcji w aktywności kanału kationowego

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno i John C. Edwards

Wiadomo, że warianty apolipoproteiny L1 (ApoL1) są odpowiedzialne za zwiększone ryzyko niektórych postępującychnerkachorobywśród osób pochodzenia afrykańskiego. ApoL1 jest białkiem amfitropowym, które może wstawiać się do błon fosfolipidowych i nadawać przepuszczalność anionowo- lub kationoselektywną błonom fosfolipidowym w zależności od pH. Nie wiadomo, czy te działania różnią się w zależności od wariantów, czy też przyczyniają się do patogenezy choroby. Do oceny różnic między izoformami ApoL1 zastosowaliśmy testy sterowanego napięciem przepływu jonów z pęcherzyków fosfolipidowych i stabilnej asocjacji błonowej. Występuje znaczący (około dwukrotny) wzrost kationoselektywnej aktywności permeazy jonowej dwóch wariantów związanych z chorobą nerek w porównaniu z białkiem referencyjnym. W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzamy różnic w aktywności anionowoselektywnej permeazy przy niskim pH wśród izoform. W porównaniu z sekwencją referencyjną, dwa warianty związane z chorobą wykazują zwiększoną stabilną asocjację z pęcherzykami fosfolipidowymi w warunkach, które wspierają aktywność kationpermeazy, co sugeruje, że zwiększona aktywność może prowadzić do wydajniejszego asocjacji i insercji błon. Nie ma różnicy w asocjacji błon między izoformami w optymalnych warunkach dla aktywności permeazy anionów. Dane te wspierają model, w którym zwiększona przepuszczalność kationów może przyczyniać się do postępujących chorób nerek związanych z allelami ApoL1 wysokiego ryzyka.

Wiadomo, że dwa różne warianty białka ApoL1 są odpowiedzialne za rozpoznane zwiększone ryzyko progresji białkomoczunerkachorobau osób pochodzenia afrykańskiego, szczególnie z powodu ogniskowego odcinkowego stwardnienia kłębuszków nerkowych, nadciśnieniowej nefrosklerozy i nefropatii związanej z HIV(1–3). Funkcjonalne role ApoL1 w komórkach ludzkich, wpływ wariantów związanych z chorobą na te funkcje oraz to, jak wszelkie takie zmiany mogą przyspieszyć brak aktywnościchoroba nereksą niejasne (4, 5).

Jedyną aktywnością biochemiczną, o której wiadomo, że posiada białko ApoL1, jest działanie jako kanał jonowy. Stwierdzono, że domena N-końcowa ApoL1 jest strukturalnie podobna do kolicyny A1 bakterii (6). Podobnie jak kolicyna A1, ApoL1 jest białkiem amfitropowym, które w pewnych okolicznościach może przenikać przez błonę lipidową z roztworu wodnego, a następnie działać jako permeaza jonowa (6–9). Oczyszczona, zrekombinowana ApoL1 typu dzikiego jest stabilna w roztworze detergentu w obojętnym pH (8, 9). W niskim pH ApoL1 może wnikać do błon fosfolipidowych i zwiększać przepuszczalność błon selektywnych względem anionów (6, 7, 9). Gdy pH cis zostaje podniesione z powrotem do obojętnego, przepuszczalność anionowo-selektywna jest tłumiona i aktywowany jest kanał kationoselektywny (8, 9). Dane te wspierają model, w którym ApoL1 prezentowana w kwaśnym kompartmencie wzdłuż szlaku egzocytarnego lub endocytarnego może wstawić się do ograniczającej błony organelli, prowadząc do zwiększonej przepuszczalności anionowej. Późniejsze przemieszczanie białka do innych przedziałów błonowych, w których pH cis byłoby obojętne (takich jak błona plazmatyczna lub błony mitochondrialne), hamuje przepuszczalność anionów i aktywuje kationpermeazę. Czy te aktywności permeazy jonowej odgrywają rolę w patogenezie związanej z ApoL1-nerkowychorobyjest niejasne.

Zastosowaliśmy metody oparte na pęcherzykach, aby zbadać różnice w aktywności permeazy inionowej i wiązania z błoną między sekwencją odniesienia (typu dzikiego), oznaczoną G0, a wariantami związanymi z dwiema chorobami, oznaczonymi G1 i G2. Stwierdziliśmy, że w porównaniu z G0, zarówno izoformy G1 jak i G2 wykazują zwiększoną aktywność specyficzną aktywności permeazy kationowej przy pH neutralnym bez zmiany aktywności permeazy selekcyjnej aniono przy niskim pH. Ponadto, związane z chorobą izoformy G1 i G2 wykazują zwiększoną stabilną asocjację błonową w porównaniu z G0 w warunkach, które wspierają aktywność kationpermeazy, ale nie w warunkach, które wspierają aktywność permeazy anionów. Nie stwierdzamy żadnego wpływu na wzorzec wrażliwości na pH ani etapu wiązania, ani etapu wypływu aktywności kanału kationowego i nie stwierdzamy wpływu na wrażliwość na pH anionoselektywnej aktywności permeazy. Wnioskujemy, że związane z chorobą warianty ApoL1 selektywnie wzmacniają aktywność kanału kationowego białka, prawdopodobnie przynajmniej częściowo poprzez wzmocnienie insercji błony. Proponujemy, aby ta zwiększona aktywność kanału przyczyniła się do progresywnegonerkachorobau osób z genotypami wysokiego ryzyka.

Cistanche może leczyćchoroba nerek

Wyniki

Rekombinowane izoformy ApoL1 z N-końcową sekwencją sygnałową usuniętą i zastąpioną znacznikiem epitopowym 6His/T7 poddano ekspresji i oczyszczono. Wszystkie trzy wykazały identyczne właściwości chromatograficzne po oczyszczeniu i były nie do odróżnienia za pomocą elektroforezy żelowej. Ryc. 1.

Frakcje szczytowe rozcieńczono do 100 ug/ml i poddano testom wypływu z pęcherzyków w celu nadania przepuszczalności chlorków i potasu. Test składa się z dwóch oddzielnych etapów. Na etapie asocjacji ApoL1 miesza się z pęcherzykami fosfolipidowymi obciążonymi KCl i pozwala na wprowadzenie ich do błon. Pozawoziowy KCl i bufor są następnie usuwane przez przepuszczenie przez odsalającą kolumnę wirową zrównoważoną izotoniczną sacharozą, generując duże gradienty od wewnątrz do zewnątrz obu Kand. Jony Cl. W etapie wypływu eluat z kolumny wirówkowej jest rozcieńczany do izotonicznego buforowanego roztworu sacharozy, który utrzymuje gradient KCl w pożądanym pH. Stężenie pozapłytkowe Cl jest monitorowane za pomocą elektrody selektywnej względem chlorków. Nawet jeśli występuje przepuszczalność selektywna wobec K lub Cl, żaden jon nie będzie mógł opuścić pęcherzyków z powodu braku ruchu przeciwjonu. Sterowany napięciem wypływ jonów jest inicjowany przez dodanie nasycającego stężenia jonoforu przeciwjonu. Dodanie jonoforu selekcyjnego wobec K, walinomycyny (Val), indukuje duży potencjał wewnątrz błony ujemnej, który, jeśli obecna jest przepuszczalność Cl, będzie kierował wypływem KCl, który będzie wykrywany przez elektrodę selekcyjną dla chlorków; zatem po Val, szybkość wypływu Cl odzwierciedla przepuszczalność Cl. I odwrotnie, dodanie jonoforu selektywnego względem Cl, chlorku jonoforu 1 (Cl1), wywoła wewnątrz-dodatni potencjał błonowy, który będzie napędzał wypływ KCl, jeśli występuje przepuszczalność K. Stąd, po dodaniu CI1, szybkość wypływu Cl odzwierciedla przepuszczalność K. Ten test może zatem służyć jako test przepuszczalności Cl lub K, w zależności od tego, który jonofor jest używany. Początkową szybkość wypływu jonów po dodaniu jonoforu przyjmuje się jako specyficzną przepuszczalność jonową pęcherzyków. Uwaga, wypływ Cl przed dodaniem jonoforu wskazuje na pewną przepuszczalność dla obu Kan i Cl. Nawet w tych okolicznościach szybkość wypływu Cl po dodaniu nadmiaru jonoforu przeciwjonu reprezentuje przepuszczalność jonu będącego przedmiotem zainteresowania — Cl po dodaniu Val, a K po dodaniu CI1.

Cistanche może leczyćchoroba nerek

Aktywność permeazy chlorkowej

Nasze poprzednie badania wykazały, że przepuszczalność anionów jest największa, gdy zarówno etap asocjacji błony, jak i etap wypływu są przeprowadzane przy pH 5.0, a warunki te zastosowano do porównania aktywności przepuszczalności Cl trzech izoform, przy użyciu Val do zainicjowania Wypływ zależny od przepuszczalności Cl. Przykłady nieprzetworzonych danych pokazano na rysunku 2A, który pokazuje wyjście z elektrody Cl-selektywnej w miliwoltach w funkcji czasu. Rejestracja rozpoczyna się przed dodaniem eluatu z minikolumny zawierającego pęcherzyki i białko, przy czym wartość mV odzwierciedla stężenie 10 μM Cl. Eluat z kolumny wirowej bez Cl dodaje się przy pierwszej strzałce, rozcieńczając Cl, co znajduje odzwierciedlenie w odchyleniu w górę wykresu mV. Val dodaje się do drugiej strzałki, wywołując wypływ Cl, jeśli obecna jest przepuszczalność Cl, co odzwierciedla postępujący spadek inmV. Triton X-100 dodaje się przy trzeciej strzałce, uwalniając cały pozostały chlorek wewnątrzpęcherzowy. Po przeliczeniu z mV na stężenie chlorków przy użyciu krzywej standardowej wygenerowanej dla elektrody w warunkach testu, określa się ułamkową początkową szybkość uwalniania Cl po dodaniu Val i przyjmuje się jako przepuszczalność chlorków. W porównaniu z kontrolą bez białka (niebieskie znaczniki), wysoka szybkość uwalniania Cl po dodaniu Val wskazuje, że ApoL1 nadaje znaczną przepuszczalność Cl, która wydaje się porównywalna wśród trzech izoform (czerwone, zielone i żółte znaczniki). Bardzo mała szybkość wypływu przed Val wskazuje, że przepuszczalność potasu jest znacznie niższa niż przepuszczalność Cl. Zakres stężeń izoform ApoL1 zbadano pod kątem permeazyaktywności Cl (Fig. 2B). Jak wcześniej doniesiono dla G0, stwierdzamy, że aktywność Clpermeazy jest liniowo związana z masą białka w teście dla wszystkich trzech izoform. Aktywność permeazy przy każdym stężeniu nie różni się między trzema izoformami. Krzywą stężenia wykonano dwukrotnie przy użyciu dwóch różnych zestawów preparatów białkowych, uzyskując ten sam wynik.

Sześć niezależnych preparatów trzech białek zbadano pod kątem aktywności permeazy Cl przy pH 5.0, jak podsumowano na Figurze 2C. W żadnym z zestawów preparatów nie znaleźliśmy istotnej różnicy w aktywności permeazy Cl pomiędzy izoformami (p > 0.05 dla porównania G0 z G1 lub G2 w każdym zestawie) . Średnie szybkości wypływu wszystkich sześciu preparatów (oznaczonych ALL na ryc. 2C) wynosiły 1,21 ± 0,32 procent /s dla sekwencji referencyjnej G0, 1,36 ± 0 0,41 procent /s dla G1 i 1,18 ± 0.34 dla G2 (średnia ± SD, n=6 dla każdego; p=0.47 i 0.94 dla porównania G0 z G1 i G2 odpowiednio). Aby określić, czy mutacje związane z chorobą zmieniają wrażliwość na pH permeazy anionów, przepuszczalność Cl nadaną przez każdą izoformę zbadano w zakresie wartości pH, stosując wskazane pH zarówno dla etapów asocjacji, jak i wypływu testu (ryc. 2D). znaczące różnice między izoformami. Ten eksperyment przeprowadzono dwukrotnie przy użyciu dwóch różnych zestawów preparatów białkowych, uzyskując ten sam wynik. Zatem aktywność Clpermeazy nie różni się znacząco między wariantami związanymi z dwiema chorobami a sekwencją odniesienia.

Aktywność permeazy potasowej

Nasze poprzednie badania wykazały, że przepuszczalność kationów jest największa, gdy etap asocjacji błon prowadzi się przy pH 6,0, a etap wypływu prowadzi się przy pH 7,5, i stosowaliśmy te warunki, o ile nie określono inaczej. Przykłady nieprzetworzonych danych z testu permeazy K przedstawiono na Ryc. 3. Podobnie jak w przypadku testów przepuszczalności Cl, eluat z kolumny wirówkowej dodaje się przy pierwszej strzałce, jonofor (w tym przypadku Chloride Ionophore1, CI1) dodaje się przy drugiej strzałce, a detergent jest dodawany przy trzeciej strzałce. Początkowe szybkości wypływu po dodaniu jonoforu, reprezentujące przepuszczalność K, przedstawiono szarymi liniami przerywanymi. Niebieski ślad pochodzi z kontroli braku białka, pokazując endogenną przepuszczalność tła samych pęcherzyków. Czerwony wykres pokazuje aktywność wariantu G0(typu dzikiego), wykazując wyraźnie obecność Kprzepuszczalności większej niż pęcherzyki kontrolne nadawane przez białko, jak opisano wcześniej (9). Ślady żółty i zielony pokazują odpowiednio aktywność wariantów G1 i G2. Początkowe nachylenia po dodaniu jonoforu są wyraźnie większe dla G1 i G2 niż dla G0, co wskazuje, że warianty związane z chorobą wspierają większą aktywność permeazy K niż G0.

W przeciwieństwie do testu przepuszczalności Cl i jak wcześniej zgłoszono dla izoformy G0 (9), w warunkach testu permeazy K występuje pewien wypływ przed jonoforem w pęcherzykach zawierających którąkolwiek z trzech izoform, reprezentowanych przez nachylenie w dół zapisów po dodaniu próbki i przed dodaniem jonoforu. Podczas gdy wysoka szybkość wypływu po dodaniu jonoforu wskazuje na obecność znacznej przepuszczalności K, wypływ przed jonoforem wskazuje również na obecność pewnej przepuszczalności Cl, co pozwala na wyciekanie obu jonów z pęcherzyków przy braku jonoforu. Prawdopodobne jest to, że odpowiada to zarówno stępionemu wzrostowi mocy wyjściowej elektrody natychmiast po dodaniu eluatu z kolumny wirowej, jak i późniejszemu spadkowi nachylenia przed CI1, które obserwuje się we wszystkich zapisach zawierających ApoL1. Zakładając, że przeciek zaczyna się, gdy próbka przechodzi przez kolumnę wirówkową, uwzględniłoby to również różnice w końcowym stężeniu Cl po dodaniu detergentu, ponieważ jakakolwiek utrata KCl na kolumnie wirówkowej oznaczałaby mniejszą całkowitą ilość KCl dodaną do testu. Ilościowa interpretacja szybkości jonoforów nie jest prosta, poza tym, że musi być funkcją przepuszczalności dla obu Kand Cl. Jak poprzednio (9), przypisujemy tę aktywność resztkowej aktywności permeazy Cl, którą widzimy przy pH 7,5 jak na Figurze 2D (patrz również Bruno i wsp. (9), Ryc. 4D).

Testy permeazy potasowej przeprowadzono w zakresie stężeń białka (Fig. 4A). Aktywność była liniowo związana z masą białka w teście dla każdej izoformy, ale dwie związane z chorobą izoformy wykazały znacznie zwiększoną aktywność wypływu w porównaniu z G0. Tę krzywą stężenia odtworzono z trzema oddzielnymi zestawami preparatów białkowych, uzyskując bardzo podobne wyniki.

Sześć niezależnych preparatów trzech izoform zbadano pod kątem aktywności wypływowej K stosując 2 ug białka w każdym teście. W każdym z sześciu zestawów aktywność izoform G1 i G2 była znacznie większa niż aktywność G0 (ryc. 4B). Średnia ze wszystkich sześciu zestawów danych dała szybkości wypływu 0.349 ± 0.063 procent /s dla G{{10}}, {{15} },709 ± 00,176 procent /s dla G1 i 0,673 ± 00,142 procent /s dla G2 (średnia ± SD, n=6 dla każdego; p < 0,00001="" dla="" porównania="" g0="" z="" g1="" lub="" g2).="" specyficzne="" aktywności="" permeazy="" k="" g1="" i="" g2="" są="" odpowiednio="" 2.03-="" i="" 1.93-razy="" większe="" niż="" g0="" w="" tym="">

Oddzielnie analizowano zależność aktywności K-permeazy od pH etapu asocjacji błon i etapu wypływu jonów. Chociaż potwierdziliśmy, że całkowita aktywność wypływowa G1 i G2 jest większa niż aktywność G0 w „standardowych” warunkach (wiązanie przy pH 6, wypływ przy pH 7,5), nie znaleźliśmy znaczącej różnicy w kształcie krzywej aktywności względem zewnętrznego (cis) pH etapu asocjacji błony (ryc. 4C) lub etapu wypływu jonów (ryc. 4D). Nie stwierdziliśmy również różnic między izoformami w zależności aktywności od wysokiego śródpęcherzykowego (trans) pH lub konieczności obecności kationu dwuwartościowego (ryc. 4E), a ponadto zauważyliśmy, że zarówno wapń, jak i magnez są równie skuteczne w dostarczaniu niezbędnego kationu dwuwartościowego do pełnego działalność. Każdy z tych eksperymentów przeprowadzono dwukrotnie przy użyciu różnych zestawów oczyszczonego białka, uzyskując identyczne wyniki.

Stabilne połączenie membran

Wcześniej wykazaliśmy, że oczyszczona rekombinowana ApoL1 spontanicznie wiąże się z błonami fosfolipidowymi wykazując podobną zależność od pH i składu fosfolipidów jak aktywność permeazy jonowej (9). Stosując podobne metody, porównaliśmy właściwości wiązania pęcherzyków lipidowych wersji referencyjnej ApoL1 z wariantami związanymi z chorobą nerek w warunkach wspierających optymalną aktywność permeazy Cl lub K (ryc. 5). W warunkach Clpermeazy białko inkubowano z pęcherzykami lipidowymi o pH 5,0 przed ekstrakcją chaotropową w celu usunięcia białek, które nie były stabilnie związane z pęcherzykami. Białko związane z błoną izolowano przez flotację przez sachakro-powłokę i oceniano ilościowo metodą western blotting. Wyniki przedstawiono na rysunku 5A. Nie było znaczącej różnicy w ilości białka związanego z pęcherzykami między izoformami G{{10}} a G1 lub G2. Z 500 ng białka w każdej reakcji ilość związana z pęcherzykami wynosiła 223 ± 33 ng dla G0,239 ± 38 ng dla G1 i 191 ± 28 ng dla G2 (średnia ± SD n=8 dla każdej grupy, p=0,35 i 0,076 dla porównania odpowiednio G0 z G1 i G2). W tych warunkach około 40-50% białka w teście wiąże się z błonami. Ten eksperyment przeprowadzono dwukrotnie, uzyskując bardzo podobne wyniki.

Aby ocenić wiązanie w warunkach optymalnych dla aktywności Kpermeazy, białko inkubowano z pęcherzykami w pH 6.0, a następnie przesunięto do pH 7,5 przed ekstrakcją chaotropową w celu usunięcia niestabilnie wstawionego białka. Białko związane z błoną izolowano przez flotację pęcherzyków błonowych przez poduszkę z asacharozą i oceniano metodą ilościowej analizy western blotting. Wyniki przedstawiono na Figurze 5B. Warianty związane z chorobą wykazują znacznie wydajniejsze wiązanie w porównaniu z G0. Z 500 ng białka dodanych do każdej reakcji ilość związana z pęcherzykami wynosiła 43,5 ± 14,5 ng (n=8) dla G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) dla G1 i 69,3 ± 10,3 ng (n=8) dla G2 (średnia ± SD; p=0.00076 i 0,0018 dla porównania odpowiednio G0 z G1 i G2). Około 9% białka G0 w reakcji było stabilnie związane z pęcherzykami w porównaniu z około 14% białka G1 i G2 w tych warunkach. Doświadczenie to przeprowadzono dwukrotnie przy użyciu niezależnych preparatów dających podobne wyniki.

Dyskusja

Przedstawiamy wyniki badań aktywności permeazy jonowej ApoL1 i jejnerka-chorobapowiązane warianty, które przyniosły kilka znaczących wyników. Po pierwsze, stwierdzamy, że związane z chorobą warianty ApoL1 mają znacznie zwiększoną aktywność Kpermeazy, która jest w przybliżeniu dwukrotnie większa niż izoforma G0 w naszych testach. Po drugie, w przeciwieństwie do Kpermeazy, nie ma znaczących różnic w specyficzności aktywności permeazy Cl przy pH 5.0 wśród izoform. Po trzecie, nie ma różnic we wrażliwości na pH aktywności permeazy K lub Cl, ani wymogu wysokiego pH trans i konieczności dwuwartościowego kationu dla aktywności Kpermeazy wśród izoform. Po czwarte, w optymalnych warunkach wspierających permeazę K, warianty związane z chorobą wykazują wzmocnioną stabilną asocjację błonową w porównaniu z G0, ale brak różnicy w asocjacji błonowej w optymalnych warunkach dla aktywności permeazy Cl.

Nasze odkrycia wykazujące zwiększoną permeazę K bez wpływu na permeazę Cl są bardzo solidne. Stosując optymalne warunki dla każdej aktywności permeazy, znaleźliśmy zasadniczo identyczne wyniki wśród sześciu niezależnych zestawów preparatów, z aktywnością Kpermeazy wariantów związanych z chorobą znacznie większą niż G0 w każdym z nich. Każdy zestaw został przygotowany i zbadany w tym samym czasie przy użyciu zwykłych odczynników. Ważność stężeń białka określonych w teście BCA została potwierdzona przez porównywalną intensywność barwienia Coomassie na SDS-PAGE. Dane te obejmują wszystkie udane próby jednoczesnego oczyszczania — nigdy nie udało nam się wygenerować zestawu wszystkich trzech wariantów, w których nie zaobserwowano tych względnych aktywności.

Podobnie, brak różnic w aktywności swoistej anion-permeazy przy pH 5 był spójny we wszystkich zestawach preparatów. Zatem naszym głównym wnioskiem jest to, że związane z chorobą warianty ApoL1 nadają selektywny wzrost funkcji w aktywności permeazy K bez wpływu na aktywność permeazy Cl, jak testowano w optymalnych warunkach dla każdej z tych aktywności. Obecność istotnych różnic w aktywności kanałów kationowych wariantów ApoL1, które korelują ze zdolnością do kierowania chorobą, ma implikacje dla możliwych mechanizmów patogenicznych. Selektywny charakter zwiększonej przepuszczalności jonów wskazuje, że zwiększona aktywność permeazy kationowej wariantów związanych z chorobą może przyczyniać się do choroby, ale jest mało prawdopodobne, aby aktywność permeazy anionów przy niskim pH, która nie różniła się wśród izoform, odgrywała kluczową rolę.

Badania wpływu wariantów na czułość aktywności na pH oraz na stopień stabilnego wiązania błonowego przez białko rzuciły światło na mechanizm, dzięki któremu można zwiększyć aktywność permeazy K. Po pierwsze, poza potwierdzeniem zwiększonej aktywności K-permeazy w optymalnych warunkach, nie stwierdziliśmy różnic w kształtach krzywych pokazujących wpływ pH na asocjację błon i etapy wypływu aktywności K-permeazy lub wpływ pH na ogólną aktywność permeazy Cl. Ponadto nie było różnic w wymaganiu podwyższonego pH wnętrza pęcherzyków lub w wymaganiu obecności kationu dwuwartościowego w reakcji aktywności K-permeazy wśród wszystkich izoform. W związku z tym nie znaleźliśmy dowodów na różnicę w wewnętrznych właściwościach samego kanału. W przeciwieństwie do tego, warianty wykazały znacznie zwiększoną stabilną asocjację z pęcherzykami fosfolipidowymi w warunkach, które wspierają aktywność Kpermeazy, przy czym skala tego efektu jest mniej więcej taka sama jak zmiana nieaktywności. Podsumowując, dane sugerują, że podstawą zwiększonej aktywności permeazy K jest po prostu wydajniejsza insercja błony w warunkach wspierających aktywność, bez konieczności wywoływania fundamentalnej zmiany właściwości wstawionego białka.

W strukturze ApoL1 zidentyfikowano trzy domeny(6). Uważa się, że aktywność kanału jonowego znajduje się w homologicznej do kolicynie domenie „tworzącej pory”, która zajmuje około 60% białka na jego N-końcu. Zmiany sekwencji związane z chorobą nie znajdują się w domenie tworzącej pory, ale znajdują się w pewnej odległości od niej w domenie typu coiled-coil, która zawiera około 16% białka na C-końcu. Usunięcie tej domeny nie ma wpływu na aktywność trypanolityczną, ale jest wysoce konserwatywne wśród izoform Apol zarówno w obrębie gatunków, jak i między gatunkami (10). Sugerowano, że region ten działa jako domena kontrolowana (10), a nasze dane wskazują, że mutanty wywołujące chorobę w tej domenie rzeczywiście wykazują zwiększone wiązanie z błoną w warunkach, które wspierają aktywność kanału kationowego i zwiększoną aktywność kanału kationowego. Jedna z interpretacji jest taka, że ​​domena C-końcowa służy do tłumienia asocjacji/insercji błony niezbędnej dla aktywności permeazy kationowej, a mutacja tej domeny rozluźnia to tłumienie.

Cistanche może leczyćnerkachoroba

Obserwacje dotyczące wiązania przez błonę mają dalsze implikacje i wyjaśniają niektóre aspekty zależności między aktywnościami permeazy anionowej i kationowej. Tutaj stwierdzamy, że znacznie więcej białka wiąże się z błonami przy optymalnych warunkach aktywności permeazy anionów (pH 5,0) niż przy optymalnych warunkach wiązania wspierających aktywność permeazy kationów (pH 6,0) i dotyczy to wszystkich izoformy (ryc. 5). Zwróć uwagę na różnicę we wrażliwości na pH aktywności permeazy anionowej (ryc. 2D) i etapie wiązania błon przez aktywność kationpermeazy (ryc. 4C): permeaza anionowa wzrasta dramatycznie poniżej pH 6, podczas gdy zdolność białka wprowadzonego do błony do podtrzymywania kationu aktywność permeazy znacznie spada. Nasze poprzednio zgłoszone dane wykazały, że stabilna błonowa asocjacja G0 znacznie wzrasta, gdy pH spada w tym samym zakresie pH, i jest to zakres, w którym wewnętrzna fluorescencja białka jest najbardziej drastycznie tłumiona (9), co wskazuje na znaczące przejście w strukturze białka . Podsumowując, dane sugerują, że wstawianie przez membranę przy pH 6,0 jest zasadniczo różne od wstawiania przez membranę przy pH 5,0. Przy pH 6,0 mniejsza frakcja białka wiąże się z błonami, czemu towarzyszy jedynie niewielka zmiana wewnętrznej fluorescencji i ograniczona aktywność permeazy anionów, ale ze zdolnością do przejścia do postaci przepuszczalnej dla kationów, gdy przedział cis jest miareczkowany do pH 7 .5. Ponadto wydajność tego wiązania jest większa dla wariantów związanych z chorobą, odpowiadając zwiększonej aktywności kationpermeazy po zmianie pH. Natomiast przy pH 5.0 znacznie większa frakcja białka jest związana z błonami; wiązaniu temu towarzyszy duża zmiana wewnętrznej fluorescencji i pojawienie się znacznie większej aktywności anionpermeazy. Ani wiązanie błony, ani aktywność anionpermeazy nie różnią się między izoformami. Zdolność wstawionego białka do przejścia do potwierdzenia permeazy kationowej jest znacznie zmniejszona. Postawiamy hipotezę, że wcześniej zgłoszona zmiana wewnętrznej fluorescencji przy spadku pH z 6 do 5 odzwierciedla transformację strukturalną do postaci, która jest niezdolna do przejścia do konformacji permeazy kationowej, a różnice między izoformami nie mają wpływu na właściwości permeazy jonowej tej konformacji.

Dodatkową nowatorską obserwacją jest to, że jony wapnia i magnezu są równie skuteczne we wspieraniu aktywności kanału kationowego ApoL1. To silnie sugeruje, że rola kationu dwuwartościowego nie polega na pewnym wysokim powinowactwie wiązania przez białko, ale bardziej prawdopodobnie na mniej specyficznym efekcie mostkowania ładunku, pozwalającym ujemnie naładowanemu białku na interakcję z ujemnie naładowaną powierzchnią błon fosfolipidowych.

Opublikowano inne badania oceniające różnice w aktywności kanałów jonowych izoform ApoL1. Thompson i Finkelstein (8) zastosowali metody elektrofizjologiczne z planarnymi technikami podwójnej warstwy lipidowej, aby ocenić aktywność kanałową oczyszczonej rekombinowanej ApoL1, zgłaszając brak różnic w charakterystyce kanałów pomiędzy izoformami. Należy zauważyć, że metody planarnej dwuwarstwy lipidowej i testy wypływu oparte na pęcherzykach, chociaż oba są testami kanałowymi, dostarczają różnych rodzajów informacji i mogą być traktowane jako uzupełniające się układy doświadczalne. Metody dwuwarstwy lipidowej są niezrównanym podejściem do definiowania właściwości jednokanałowych oczyszczonego białka, ale są słabszymi narzędziami do ilościowego określania aktywności specyficznej, podczas gdy testy wypływu z pęcherzyków mogą dostarczyć danych ilościowych o aktywności populacji, ale niewiele informacji o właściwościach jednokanałowych. Tak więc obserwacje Thompa syna i Finkelsteina nie są sprzeczne z naszymi, które również nie wykazują wyraźnych różnic w wewnętrznych właściwościach kanału, a jedynie około dwukrotną różnicę w specyficznej aktywności, skalę różnicy, która byłaby dość trudna do oszacowania. wykrywać w dwuwarstwowych układach lipidowych.

Badania z użyciem oczyszczonych białek i lipidów mają tę zaletę, że ujawniają właściwości, które są wyraźnie związane z samym białkiem i nie są zmienione przez żadne inne składniki, kinetykę ekspresji lub ruch przez błonę, które zagrażają bardziej złożonym układom. Jednak z konieczności milczą na temat ostatecznego wpływu tych działań na żywe komórki. Opisano badania z wykorzystaniem komórkowych systemów ekspresyjnych do wydobycia aktywności kanału jonowego ApoL1 (przegląd w Friedman i Pollak, 2019 (3)). Olabisi i wsp. (11) eksprymowali izoformy ApoL1 w komórkach HEK i oceniali wewnątrzkomórkowe stężenie potasu w stanie stacjonarnym. Odkryli niższy poziom potasu wewnątrzkomórkowego w komórkach wyrażających G1 i G2 w porównaniu z komórkami wyrażającymi G0. Chociaż ta obserwacja może być spójna ze zwiększoną przepuszczalnością K przez błonę komórkową, niższa wartość K wewnątrzkomórkowa może również być niespecyficzną konsekwencją większego efektu cytotoksycznego wariantu poprzez dowolny mechanizm, prowadząc do mniej aktywnej aktywności ATPazy NaK i/lub załamania integralności błon plazmatycznych. O'Toole i in. (12) starannie skalibrował poziomy ekspresji w komórkach HEK i ocenił wygląd aktywności kanału kationowego błony komórkowej, znajdując różnice w węzłach między izoformami. Shah i in. (13) donosi o ukierunkowaniu ApoL1 na mitochondria, gdzie warianty związane z chorobą indukowały otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów, zgodnie z ostatnimi dowodami na cytotoksyczność trypanosomów. Nie jest jasne, czy ten efekt wymaga aktywności kanału jonowego ApoL1. W każdym z tych badań, ze względu na złożoność systemów ekspresji opartych na komórkach, nie można mieć pewności, czy jakiekolwiek zauważone różnice wynikają z wewnętrznych właściwości białka, czy z innych oddziałujących składników obecnych w komórkach.

Patogeniczne mutacje polegające na nabyciu funkcji zazwyczaj wykazują dominujący wzorzec dziedziczenia, podczas gdyfenotyp choroby nerekzwiązany z wariantami ApoL1 jest recesywny. Jeden mechanizm, dzięki któremu mutacja zyskująca funkcję może być recesywna, polega na tym, że białko działa jako homomultimer, a WT może wywierać dominujący negatywny wpływ na aktywowany wariant. Obecnie nie wiadomo, czy ApoL1 działa jako kanał jako monomer czy multimer.

Nasze dane sugerują, że zwiększona przepuszczalność kationów przy podobnych poziomach ekspresji białka może przyczyniać się do tocytotoksyczności w podocytach lub innych komórkach. Jednak może wydawać się mało prawdopodobne, aby zaledwie dwukrotny wzrost aktywności mógł przekształcić pozornie niegroźną cząsteczkę w jedną prowadzącą chorobę. Niemniej jednak, choroby związane z wariantami ApoL1 mają tendencję do powolnego postępu i subtelne różnice w dłuższym okresie czasu (miesiące lub lata) mogą mieć duży efekt kumulacyjny. Inne potencjalne mechanizmy działania ApoL1 odpowiedzialne za:nerkaurazzostały zaproponowane i są poparte dowodami (3-5, 11-16), w tym między innymi wpływ na onapoptozę, autofagię, funkcję mitochondriów, transport wewnątrzkomórkowy i pośredniczący w działaniu zewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnalizacyjnych. Względne znaczenie różnic w aktywności kanału ApoL1 opisanego tutaj w porównaniu z innymi potencjalnymi mechanizmami działania w prowadzeniu choroby pozostaje do ustalenia.

Cistanche może leczyćnerkachoroba

Eksperymentalne procedury

Konstrukcje wyrażeń

pET-ApoWT kodujący N-końcowy 6His i T7 znakowany epitopem ApoL1 (wersja G0) został wcześniej opisany (9). Kodowane białko jest identyczne z akcesją Genbank#BC143038 (haplotyp 150K, 228I, 255K) od aminokwasów 28 do 398, eliminując sekwencję sygnałową w aminokwasach 1–27 i z dodatkiem N-końcowego {{ 17}} Tagi epitopów His i T7 kodowane przez plazmid pET28a. Plazmidy kodujące warianty G1 i G2 wytworzono z pET-ApoWT przez podstawienie fragmentu restrykcyjnego AleI do XhoI fragmentami zawierającymi sekwencje wariantów, zsyntetyzowanych przez Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, a tożsamość otrzymanych plazmidów potwierdzono przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Wszystkie trzy konstrukty były identyczne z wyjątkiem podstawień aminokwasowych S342G i I384M w izoformie G1 i delecji N388-Y389 w izoformie G2. Rekombinowane izoformy ApoL1 eksprymowano w bakteriach i oczyszczano jak opisano(8), z tym wyjątkiem, że bufor do kolumny S200 zawierał 0,03 procent n dodecylo- -D-maltozydu (DDM) (Millipore-Sigma). Do wszystkich zestawów eksperymentów porównujących izoformy materiały przygotowywano w tym samym czasie w identycznych warunkach przy użyciu tych samych odczynników. Stężenie białka określono za pomocą zestawu BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) stosując standard albuminy bydlęcej. W przypadku białka całkowitego, jak na Figurze 1, żele wybarwiono Instant Blue (Expedeon Inc). Białko w buforze S200 zamrożono błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. Próbki rozmrożono na lodzie i rozcieńczono w buforze S200 przed testami.

Jonofory

Walinomycynę (Millipore Sigma) rozpuszczono w 50 mM w absolutnym etanolu i rozcieńczono do 1 mM w absolutnym etanolu bezpośrednio przed użyciem. Chlorek Ionophore 1 (MilliporeSigma) rozpuszczono w 100 mM w 1-heksanolu i rozcieńczono do 0,2 mM w absolutnym etanolu bezpośrednio przed użyciem.

Pęcherzyki błonowe

Asolektynę (fosfatydylocholina sojowa typ II, Sigma) wyekstrahowano acetonem zgodnie z opisem (30), osuszono, a następnie rozpuszczono w chloroformie i przechowywano w temperaturze –20°C. Porcję fosfolipidów w chloroformie wysuszono w strumieniu azotu i zawieszono przy 20 mg/ml w 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8,0 w pięciu cyklach zamrażania-rozmrażania i energicznego worteksowania. Ta zawiesina była przechowywana w temperaturze -20 stopni. W celu wytworzenia jednowarstwowych pęcherzyków obciążonych KCl o średnicy około 200 nm, zawiesinę lipidową przepuszczono 15 razy przez 200 nm filtr membranowy z porepoliwęglanu, stosując komorę wytłaczarki (Avanti Polar Lipids) i zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta (17, 18). Wytłoczone pęcherzyki trzymano na lodzie i używano w ciągu 24 godzin.

Testy aktywności

Testy aktywności permeazy jonowej z zastosowaniem wypływu KCl sterowanego potencjałem błonowym wykrytego elektrodą selektywną wobec chlorków przeprowadzono jak opisano wcześniej (9). Dodano dwadzieścia mikrolitrów ApoL1 w buforze S200 (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH 8,3, 0,3 procent DDM) do 380 ul mieszaniny reakcyjnej składającej się z 82 mM KCl, 127 mM sacharozy, 42,1 mM buforu o wskazanym pH (MES dla pH 5-6,5, HEPES dla pH 7,0-8,0), 2,63 mMCa(glukonian)2 i 1,84 mg/ml wytłaczanej izolektyny pęcherzyki. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przed przejściem przez kolumnę 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) zrównoważoną 330 mM sacharozą. Eluat jest natychmiast dodawany do 2 ml 330 mM sacharozy, 10-5 M KCl, 2,5 mM Ca(glukonian)2 i 10 mM buforu (MES dla pH 5-6,5; HEPES dla pH 7-8), jak wskazano, z ciągłym monitorowaniem za pomocą chlorkowej elektrody selektywnej i rejestrowanym zgodnie z opisem. Po 20 s zainicjowano wypływ napędzany napięciem przez dodanie jonoforu (2,5 ul 1 mM walinomycyny lub 0,2 mM chlorku jonoforu 1 w etanolu) i pozostawiono na 30 s a następnie dodanie Triton X-100 do 0,1% w celu uwolnienia pozostałego chlorku dopęcherzowego. Surowe dane w mV przekształcono na stężenie Cl stosując standardową krzywą wytworzoną dla elektrody w warunkach testu. Początkowe ułamkowe szybkości uwalniania chlorków pochodziły z 3 s podczas maksymalnej natychmiastowej odpowiedzi na dodanie jonoforu.

Wszystkie porównania aktywności przeprowadzono przy użyciu materiału z równoczesnych preparatów trzech izoform, które przed testem rozcieńczono do 100 ug/ml białka w buforze S200. Wszystkie testy stosowane do bezpośredniego porównania wariantów przeprowadzono tego samego dnia przy użyciu tych samych świeżo przygotowanych odczynników.

Test asocjacji błon

Testy asocjacji błon prowadzono oddzielnie w warunkach optymalnych dla aktywności permeazy Cl i aktywności permeazy K. Dla warunków wspierających aktywność Clpermeazy, 5 ul 100 ug/ml białka w 1{{30}} mM Tris pH 8,2, 150 mM NaCl , 00,03% DDM dodano do 95 ul mieszaniny reakcyjnej (3,4 mg/ml pęcherzyki izolektyny (załadowane 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5,0, 2,5 mM Ca (glukonian) 2, 100 mM KCl, 100 mM sacharoza) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 min. Stosunek białka do lipidu w teście wynosi 1:680 masa/masa. Próbkę rozcieńczono bez zmiany pH przez dodanie 200 ul 60 mM MES pH 5,0, 2,5 mMCa(glukonian)2, 100 mM KCl, 100 mM sacharozy i inkubowano przez 20 sekund. Dodano sto mikrolitrów 8 M mocznika, wymieszano, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Stężenie sacharozy doprowadzono do 40% przez dodanie 1,6 ml 50% sacharozy. Próbkę o objętości 2 ml nałożono na warstwę poniżej 1 ml 30% sacharozy w 8 mM MES pH 5,0, która z kolei znajdowała się poniżej 1,7 ml 8 mM MES bez sacharozy o pH 5,0. Strome gradienty wirowano przy 200,000gw rotorze Beckman Coulter TLA-110przez 90 min w 4°C. Pęcherzyki zebrano z granicy faz 0 do 30% sacharozy. Równe frakcje próbek rozcieńczono 4-krotnie i odwirowano przy 100,000g przez 1 godzinę. Osady błon osuszono, rozdzielono metodą SDS-PAGE, przeniesiono na membranę z fluorku topoliwinylidenu i sondowano metodą western blot z przeciwciałem przeciwko epitopowi T7 (MilliporeSigma product nr 69522-3) z detekcją chemiluminescencji przy użyciu cyfrowego systemu obrazowania. Seryjne rozcieńczenia oczyszczonego białka umieszczono na żelu w celu wygenerowania izotypowej i specyficznej krzywej wzorcowej dla każdego białka.

W warunkach podtrzymujących aktywność permeazy K, 5 ul 100ug/ml białka w 10 mM Tris pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,03 procent DDM dodano do 95 ul mieszanina reakcyjna (3,4 ug/ml pęcherzyków izolacyjnych (załadowane 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6,0, 2,5 mM Ca(glukonian)2, 100 mM KCl, 100 mM sacharoza) i inkubowana w temperaturze pokojowej przez 1 min. Próbkę rozcieńczono z przesunięciem pH do 7,5 przez dodanie 200 ul 60 mM HEPES pH 8,0, 2,5 mM Ca(glukonian)2,100 mM KCl, 100 mM sacharozy i inkubowano przez 20 sekund. Dodano sto mikrolitrów 500 mM Na2CO3 i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 min. Stężenie sacharozy doprowadzono do 40% przez dodanie 1,6 ml 50% sacharozy. Próbkę o objętości 2 ml nałożono na warstwę poniżej 1 ml 30% sacharozy w 8 mM Tris pH 8,3, która z kolei znajdowała się poniżej 1,7 ml 8 mM Tris bez sacharozy o pH 8,3. Poduszki z sacharozą odwirowano i pobrano próbkę i poddano obróbce jak powyżej.

Statystyka

Istotność różnic między parami średnich w zbiorach danych określono za pomocą analizy wariancji (ANOVA)(19). Parametry statystyczne wyznaczono za pomocą funkcji wbudowanej w Excela. Wartości P obliczono za pomocą socscistatistics.com. Wszystkie punkty danych są przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD), określone za pomocą funkcji STDEV.S programu Excel dla każdej indywidualnej grupy replik.

Dostępność danychWszystkie dane uzupełniające niniejszy dokument zostaną udostępnione na żądanie dr John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche może leczyćnerkachoroba

Podziękowanie— Dziękujemy Wydziałowi Nefrologii i Klinice Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Saint Louis za wsparcie niezbędne do wykonania tej pracy.

Autorskie Wkłady— JCE zainicjowało i nadzorowało badanie, zapewniło finansowanie, wykonało testy wypływu, zinterpretowało dane i napisało artykuł; JB oczyścił białka, przeprowadził testy asocjacji błon, zinterpretował dane, przygotował figury i zredagował artykuł.

Finansowanie i dodatkowe informacje—Praca została sfinansowana ze środków instytucjonalnych Uniwersytetu Saint Louis oraz z grantu National Institutes of Health R01 DK120651 dla JCE Za treść tego artykułu odpowiadają wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentuje on oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Konflikt interesów— Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów z treścią tego artykułu.

Skróty—Użyte skróty to: ApoL1, apolipoproteinaL1; CI1, chlorkowy jonofor 1; DDM, n-dodecylo- -D-maltozyd; PVDF, polifluorek winylidenu; SD, odchylenie standardowe; Val, walinomycyna.

Z: 'Nerka-choroba-zasocjowane warianty apolipoproteiny L1 wykazują wzmocnienie funkcji w aktywności kanału kationowego' oJonathan Bruno i John C. Edwards

---J. Biol. Chem. (2021) 296 100238

Bibliografia

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Gałka, AL, Bernhardy, AJ, Hicks PJ, Nelson GW, Vanhollebeke B., Winkler CA i in. (2010) Powiązanie trypanolitycznych wariantów ApoL1 znerkachorobau Afroamerykanów. Nauka 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, i in. (2013) Warianty ryzyka APOL1, rasa i progresja przewlekłej chorobynerkachoroba. N. Engl. J. Med. 369, 2183-2196
3. Friedman, DJ i Pollak, MR (2020) APOL1 inerkachoroba: Od genetyki do biologii. Annu. Ks. Fizjol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF i Sedor, JR (2017) Identyfikacja wewnątrzkomórkowej funkcji APOL1. J. Am. Soc. Nefrol. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. i Okamoto, K. (2018) Nefropatie Apolipoproteiny L1: przegląd 2017. Aktualn. Opinia. Nefrol. Nadciśnienie. 27, 153–158
6. D. Perez-Morga, B. Vanhollebeke, F. Paturiaux-Hanocq, DP Nolan, L. Lins, F. Homble, L. Vanhamme, P. Tebabi, A. Pays, Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R. i Pays, E. (2005) Apolipoproteina LI promuje lizę trypanosomów poprzez tworzenie porów w błonach lizosomalnych. Nauka 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S. i Hajduk, SL (2009) Permeabilizacja błony przez czynnik lityczny trypanosomów, cytolityczną ludzką lipoproteinę o dużej gęstości. J. Biol. Chem. 284, 13505–13512
8. Thomson, R. i Finkelstein, A. (2015) Ludzki czynnik trypanolityczny APOL1 tworzy kanały selektywne względem kationów z bramkowanym pH w planarnych dwuwarstwach lipidowych: związek z lizą trypanosomów. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J. i Edwards, JC (2017) Apolipoproteina L1 nadaje przepuszczalność jonów z możliwością zmiany pH dla pęcherzyków fosfolipidowych. J. Biol. Chem. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B. i Pays, E. (2006) Funkcja apolipoprotein L. Cell Mol. Życie Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3., Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ i Pollak, MR (2016) APOL1nerkachorobawarianty ryzyka powodują cytotoksyczność poprzez zubożenie komórkowego potasu i indukcję
kinazy białkowe aktywowane stresem. Proc. Natl. Acad. Nauka. Stany Zjednoczone 113, 830–837
12. JF O'Toole, W. Schilling, D. Kunze, SM Madhavan, M. Konieczkowski, Y. Gu, L. Luo, Z. Wu, LA Bruggeman, JR Sedor (2018) Nadekspresja ApoL1 napędza cytotoksyczność niezależną od wariantu. J. Am. Soc. Nefrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR i Friedman, DJ (2019) APOL1nerkawarianty ryzyka indukują śmierć komórki poprzez translokację mitochondrialną i otwarcie mitochondrialnego poru przejściowego przepuszczalności. J. Am. Soc. Nefrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V. i in. (2017) Trzyczęściowy kompleks suPAR, wariantów ryzyka APOL1 i integryny alfavbeta3 na podocytach pośredniczy w przewlekłymnerka choroba. Nat. Med. 23, 945-953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, LD Miller, AJ Molina, CD Langefeld, M. Murea i in. (2017) Warianty ryzyka nerek APOL1 wywołują dysfunkcję mitochondriów. J. Am. Soc. Nefrol. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. i Hu, CA (2008) Apolipoproteina L1, nowa domena homologii Bcl-2 {{4 }}tylko białko wiążące lipidy, indukuje autofagiczną śmierć komórek. J. Biol. Chem. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. i Cullis, PR (1985) Wytwarzanie dużych jednowarstwowych pęcherzyków za pomocą procedury szybkiego wytłaczania: Charakterystyka rozkładu wielkości, uwięzionej objętości i zdolności do utrzymania potencjału błony. Biochim. Biofizyka. Acta 812, 55–65
18. Olson F., Hunt CA, Szoka FC, Vail WJ i Papahadjopoulos D. (1979) Przygotowanie liposomów o określonym rozkładzie wielkości przez wytłaczanie przez błony poliwęglanowe. Biochim. Biofizyka. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Wielka Brytania