Lokalny nieprzysadkowy hormon wzrostu jest indukowany wraz ze starzeniem się i ułatwia uszkodzenie nabłonka

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

STRESZCZENIE

Czynniki mikrośrodowiskowe modulujące uszkodzenia DINA związane z wiekiem są niejasne. Nieprzysadkowy hormon wzrostu (np) jest indukowany w ludzkiej okrężnicy, nieprzekształconych ludzkich komórkach okrężnicy i fibroblastach oraz w 3-wymiarowych organoidach jelitowych ze związanym z wiekiem uszkodzeniem DNA. Autokrynny/parakrynny npGH hamuje p53 i osłabia odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) poprzez indukcję TRIM29 i zmniejszenie fosforylacji ATM, co prowadzi do zmniejszonej naprawy DNA i akumulacji uszkodzeń DNA. Organoidy hodowane do 4 miesięcy wykazują markery starzenia, p16 i SA- -galaktozydazę oraz skróconą długość telomerów, a także akumulację uszkodzeń DNA, ze zwiększonym npGH, supresją p53 i atenuowanym DDR. Tłumienie GH w starych organoidach zwiększa p53 i zmniejsza uszkodzenia DNA. Myszy WT wykazują zależną od wieku akumulację uszkodzeń DNA okrężnicy, podczas gdy u starszych myszy pozbawionych sygnalizacji GH okrężnicy uszkodzenie DNA pozostaje niskie, z podwyższonym p53. Ponieważ związana z wiekiem indukcja npGH umożliwia pro-proliferacyjne mikrośrodowisko, zniesienie sygnalizacji npGH może być celem terapii przeciwstarzeniowej poprzez hamowanie uszkodzeń DNA i patologii związanych z wiekiem.

WPROWADZANIE

Funkcje biologiczne pogarszają się wraz ze starzeniem się, wraz z nasileniem choroby związanej z wiekiem.flawonoidyPatologie związane z wiekiem są napędzane przez nagromadzone uszkodzenia DNA i braki w naprawie DNA, które powodują mutacje i związane z wiekiem aberracje chromosomowe. Trwałe uszkodzenie DNA może również blokować proliferację komórek, powodując starzenie się i apoptozę, tym samym napędzając proces starzenia (Ou i Schumacher, 2018). Uszkodzenia DNA kumulują się wraz z wiekiem w komórkach typu dzikiego (WT), nietransformowanych komórkach ludzkich i mysich, o czym świadczy wzrost ufosforylowanego wariantu histonu 2A (yH2AX), markera pęknięć dwuniciowego DNA (DSB) (Sedelnikova i wsp., 2004) i nienaprawione uszkodzenie DNA (Dolle i wsp., 1997; Hasty i wsp., 2003; Lombard i wsp., 2005; Petr i wsp., 2020). Niestabilność genomowa wynikająca z naprawy wadliwych uszkodzeń DNA może sprzyjać transformacji komórkowej (Negrini i wsp., 2010). Uszkodzenie DNA powoduje fosforylację genów zmutowanych w ataksji i teleangiektazji (ATM), odpowiedzialnych za naprawę pęknięć jednoniciowego DNA i DSB. ATM fosforyluje i stabilizuje supresor nowotworowy p53, zapewniając w ten sposób naprawę uszkodzeń DNA poprzez ułatwienie kilku ścieżek naprawy DNA. Dlatego ATM odgrywa kluczową rolę w aktywacji zarówno odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR), jak i naprawy DNA (Ou i Schumacher, 2018).

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

Ekspresja i aktywność ATM pogarszają się z wiekiem (Feng i in. 2007; Gutierrez-Martinez i in., 2018), prawdopodobnie powodując związaną z wiekiem utratę czynnościowego p53 i prowadząc do nagromadzonego uszkodzenia DNA i niestabilności chromosomów (Simon i in., 2009) Odpowiedzi .p53 na stresory, takie jak promieniowanie, są niższe u starszych myszy (Feng et al., 2007) i ludzkich fibroblastów skóry pochodzących od starszych osobników (Goukassian et al., 2000). Tak więc oznaki starzenia obejmują zmniejszoną aktywność DDR i supresję p53 z nagromadzonymi nienaprawionymi uszkodzeniami DNA, wszystko to umożliwia sprzyjające środowisko dla proliferacji nabłonka (Lopez-Otin i wsp., 2013).

Ponieważ wydzielanie przysadkowego hormonu wzrostu (GH) spada wraz z wiekiem, zmieniona sygnalizacja GH jest zaangażowana w proces starzenia się (Ho i Hoffman, 1993). Niemniej jednak istnieją dowody potwierdzające korzystny wpływ tłumienia GH na starzenie się. oraz modele chorób u ludzi (Brown-Borg i wsp., 1996; Junnila i wsp., 2013), korzyści wynikające z niedoboru GH wynikają przede wszystkim z obserwacji faworyzujących drugorzędowe czynniki wydłużające długość życia, w tym zwiększoną wrażliwość na insulinę, zmniejszoną oksydację białek wątrobowych , zmniejszenie zachorowalności na raka i zmniejszenie zapalenia związanego z wiekiem (Aguiar-Oliveira i Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila i in., 2013; Spadaro i in., 2016). Potomstwo Leiden badało rodziny z rodzinną długością życia i niższą śmiertelnością niż w grupie kontrolnej dopasowanej do środowiska mają niższe zintegrowane poziomy krążącego GH (van der Spoeletal., 2016), podczas gdy GHexcess zmniejsza długość życia, co obserwuje się u pacjentów z akromegalią (Chesno-kova i in., 2019a; Melmed, 2020; Waters i Barclay, 200 7) oraz w transgenicznych modelach mysich z nadekspresją GH (Bartke, 2003).zastosowania hesperydynyNiektórzy sugerowali ujemną korelację między wzrostem a długowiecznością u ludzi (He i in., 2014; Samaras i Storms, 1992) oraz u psów (Greer i in., 2007). Postawiliśmy hipotezę, że niekorzystny wpływ GH na starzenie się może przynajmniej częściowo można je przypisać nagromadzonym uszkodzeniom DNA (Ches-nokova i Melmed, 2020). Na poparcie tego założenia limfocyty pochodzące od pacjentów z akromegalią wykazują uszkodzenia DNA ze zwiększonymi aberracjami chromosomowymi (Bayram i wsp., 2014), podczas gdy nienaprawione uszkodzenia DNA gromadzą się w wątrobie w modelu akromegalii danio pręgowanego (Elbialy i wsp., 2018). Wysokie poziomy krążącego GH osłabiają naprawę DNA okrężnicy myszy, wywołując akumulację uszkodzeń DNA, podczas gdy uszkodzenia DNA są osłabiane po zablokowaniu receptora GH (GHR) w ludzkich komórkach okrężnicy i u myszy z przerwaną sygnalizacją GHR (Chesnokova i wsp., 2019a).

Nieprzysadkowy GH (np) syntetyzowany lokalnie w tkankach obwodowych jest identyczny z hormonalnym GH1 wytwarzanym przez przysadkę i działa poprzez mechanizmy autokrynne/parakrynne poprzez szeroko eksprymowany GHR (Ballesteros i wsp., 2000), który rozpoznaje zarówno GH przysadkowy, jak i npGH ligandy ( Waters i Barclay, 2007; Waters i wsp., 2006).utracone imperium cistanchePonieważ aktywacja DDR indukuje npGH (Chesnokova et al., 2013), postawiliśmy hipotezę, że związane z wiekiem uszkodzenie nagromadzonego DNA okrężnicy indukuje ekspresję npGH, co z kolei dodatkowo ogranicza naprawę uszkodzeń DNA.

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Stosując ludzkie modele in vitro i ex vivo odzwierciedlające starzenie, pokazujemy tutaj, że npGH jest indukowany i uszkodzenia DNA kumulują się w starych tkankach ludzkich, o czym świadczy zwiększona fosforylacja H2AX (yH2AX). Ponadto uszkodzenie DNA okrężnicy jest znacznie zwiększone u starszych myszy WT, podczas gdy uszkodzenie nabłonkowego DNA pozostaje niskie u myszy GHR--w tym samym wieku, pozbawionych sygnalizacji GH i myszy pozbawionych GHR specyficznych dla okrężnicy (GHRcolKO).

Lokalny npGH był również indukowany w starzejących się 3-wymiarowych (3D) organoidach jelitowych wytworzonych z indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (Barrett i in., 2014; Chesnokova i in., 2019a). Z kolei organoidowy npGH tłumił p53 i osłabiał naprawę uszkodzeń DNA.mikronizowana oczyszczona frakcja flawonoidów 1000 mg zastosowańEfekty npGH były prawdopodobnie parakrynne, ponieważ wspólne hodowanie fibroblastów eksprymujących GH z mikroprzepływowymi urządzeniami Colon Intestine-Chip osadzonymi z ludzkimi kolonioidami doprowadziło do zahamowania p53/p21 i zwiększenia uszkodzenia DNA. Natomiast tłumienie GH w starych organoidach zapobiegało uszkodzeniom DNA.

W ten sposób pokazujemy, że nabłonkowy npGH jest silnie indukowany podczas starzenia i że npGH zmniejsza naprawę DNA i ułatwia akumulację uszkodzeń DNA związanych z wiekiem. Podsumowując, wyniki sugerują, że miejscowy nabłonek okrężnicy npGH wyzwala zmianę pola śluzówki, tworząc środowisko niestabilności chromosomowej, które sprzyja rozwojowi nowotworu w starzejącej się tkance.

Co ważne, chociaż istnieje szeroko rozpowszechnione niewłaściwe stosowanie GH jako hormonu „przeciwstarzeniowego” pomimo braku istotnego wpływu na proces starzenia (Blackman i in., 2002; Clemmons i in.. 2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), nasze wyniki pokazują, że lokalna sygnalizacja GH przyczynia się do mikrośrodowiska tkankowego, sprzyjając rozwojowi patologii związanych z wiekiem. Tłumienie lokalnej sygnalizacji npGH w celu ograniczenia niekorzystnych uszkodzeń nabłonkowego DNA może zatem stanowić cel terapeutyczny w starzeniu się bezowulacyjnym. Wyniki tych badań informują o innowacyjnym podejściu do wydłużania długości życia (tj. raczej tłumienia niż indukcji lokalnej sygnalizacji GH). WYNIKI

Uszkodzenia DNA okrężnicy i npGH kumulują się wraz z wiekiem

Uszkodzenia DNA związane z wiekiem oszacowano w próbkach nienowotworowej ludzkiej tkanki parafinowej jelita grubego pochodzących z kohort pacjentów z 3 grup wiekowych: młodych (18-39 lat), w średnim wieku (40-60 lat) i starszych ( {{6 lat). Przy ocenie pod kątem yH2AX 3 z 11 próbek (27 procent) w młodej kohorcie wykazywało uszkodzenie DNA, 8 z 16 (50 procent) wykazywało uszkodzenie DNA w średnim wieku, a 8 z 18 (45%) próbek w wieku wykazywało uszkodzenie DNA (Rysunki 1A-1C i 1J).

Jak wcześniej wykazaliśmy, że uszkodzenie DNA indukuje npGH (Chesnokova i wsp., 2013), staraliśmy się ustalić, czy zależna od wieku akumulacja uszkodzeń DNA była związana z ekspresją GH w nienowotworowej tkance okrężnicy. Ponieważ nie jest wyrażany w komórkach neuroendokrynnych jelita grubego (Chesnokova i wsp., 2016), wykluczyliśmy te komórki z analizy.

Ekspresję GH w nabłonku wykryto w 16 procentach -17 procentach prawidłowych próbek okrężnicy pochodzących z kohort w średnim i starszym wieku (odpowiednio 38 i 42 próbki), ale tylko w 2% młodych kohort (37 próbek), podczas gdy Wynik ekspresji GH był zwiększony w kohorcie w średnim wieku i dalej zwiększony w próbkach kohortowych w wieku (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflawonoidPodsumowując, wyniki te wskazują na akumulację uszkodzeń DNA bez indukcji w starzejącej się okrężnicy.

Aktywacja DDR indukuje lokalną npGHin okrężnicy mysiej i ludzkiej

Następnie rozważyliśmy, czy aktywowany DDR wyzwala lokalną ekspresję npGH w okrężnicy i leczyliśmy myszy nutlin3 w celu stabilizacji p53 (Vassilev i wsp., 2004) i zaobserwowaliśmy indukowane p53 okrężnicy i wyższe (ryc. 2A). Ponadto w próbkach gruczolakoraka okrężnicy pochodzących od tych samych pacjentów przed i po terapiach uszkadzających DNA (Tabela S1), we wszystkich 6 badanych próbkach pacjentów zaobserwowaliśmy umiarkowaną wyjściową ekspresję nabłonkowego npGH przed leczeniem i zwiększoną ekspresję npGH po terapii (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR aktywuje ekspresję GH in vitro

Użyliśmy inhibitora topoizomerazy II, etopozydu, do wytworzenia zarówno jednoniciowych pęknięć DNA, jak i DSB (Walles i wsp., 1996) oraz do określenia, czy DDR aktywuje GH in vitro. Indukowany uszkodzeniem DNA npGH w ludzkich komórkach gruczolakoraka okrężnicy NCC, hNCF i HCT116 (Figury 3A i S1A-S1C); w organoidach mRNA GH i GH indukowany etopozydem (Figury 3B i S1D), podczas gdy poziomy mRNA IGF1 i prolaktyny pozostały niezmienione (Figura S1E). Fosforylacja STAT5, dalszy sygnał GH (Waters, 2016), była indukowana we wszystkich typach komórek (ryc. 3A-3C i S1A-S1C). W przeciwieństwie do tego, zniesienie npGH za pomocą GH małym interferującym RNA (siRNA) zapobiegło indukowaniu pSTAT5 przez etopozyd (ryc. 3C i S1F), dostarczając dowodów, że npGH okrężnicy indukowany uszkodzeniem DNA jest aktywny funkcjonalnie. Obrazowanie NCC traktowanego etopozydem przez 24 godziny wykazało koekspresję GH i yH2AX w wielu komórkach (Figura 3D).

Komórki nabłonkowe podlegające uszkodzeniu DNA wydzielają GH Aby określić, czy indukowany wewnątrzkomórkowy npGH wywiera działanie autokrynne/parakrynne, oceniliśmy poziomy GH wydzielanego do NCC i pożywki hodowlanej organoidów po leczeniu etopozydem. Pożywka pobrana z ANCC w 8 i 24 h po leczeniu iz organoidów w 4-48 h po leczeniu wykazywała zależny od czasu wzrost GH po aktywacji DDR (Figura 3E). Ponieważ NCC i organoidy wyrażają receptory GH, podobnie jak ludzka tkanka okrężnicy (Chesnokova i wsp., 2016), wyniki te sugerują, że miejscowy GH indukowany w odpowiedzi na uszkodzenie DNA może poddawać starzejącą się tkankę działaniom autokrynnym/parakrynnym.

Autokrynny/parakrynny GH hamuje p53 . ludzkich komórek okrężnicy

Ponieważ endokrynny GH hamuje p53 mysiej okrężnicy (Chesnokova i wsp., 2016), ustaliliśmy, czy miejscowy GH wywiera podobne działanie au-autokrynne/parakrynne w ludzkich komórkach nabłonka okrężnicy. Analiza dwóch oddzielnych linii NCC pochodzących od dwóch różnych pacjentów po nukleofekcji hGH lub zakażeniu lentiwirusem wykazującym ekspresję GH (lenti-GH) (ryc. 4A, 4B i S2) oraz organoidów ze stabilną ekspresją hGH (ryc. 4C) wykazała p53 i współistniejąca nadekspresja. Komórki pochodzące z organoidów zakażonych lenti-GH lub pustym wektorem (lenti-V) pulsowanym bromodeoksyurydyną (BrdU) wykazywały supresję p53, po której nastąpiło niewielkie, ale znacząco zwiększone włączanie BrdU, oceniane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) (Figura S3A). Dla kontrastu, supresja GH za pomocą lentiwirusa eksprymującego mały GH o strukturze spinki do włosów (GH) doprowadziła do zmniejszonego tworzenia kolonii i wielkości kolonii w NCC (ryc. S3B i S3C), co wskazuje na pro-literaturowe działanie npGH.

Wpływ parakrynnego GH w ludzkim chipie jelita grubego Aby ocenić wpływ parakrynny npGH na komórki nabłonka błony śluzowej jelita, hodowaliśmy wspólnie UNCF zainfekowane lenti-GH i mikroprzepływowymi urządzeniami jelita grubego (Kasendra i wsp., 2020) z zaszczepionymi zdrową okrężnicą. komórki nabłonkowe pochodzenia organoidowego przez 8 dni. Lokalne wydzielanie GH z hNCF do pożywki potwierdzono testem ELISA (338ng/mL/1×10 stopni komórek). chipy utrwalono 24 godziny później i wybarwiono w kierunku EdU i H2AX, a EdU plus jądra zliczono w komórkach nabłonka. Oddzielny zestaw frytek z nasionami

z komórkami nabłonkowymi zastosowano do oceny p53/p21 metodą western blot. Wzrosła proliferacja chipowych komórek nabłonka (p<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Autokrynny/parakrynny GH hamuje DDR

Aktywacja ATM po uszkodzeniu DNA fosforyluje H2AX, który oznacza uszkodzone miejsca DNA, aby aktywować DDR i promować naprawę (Turinetto i Giachino, 2015). ATM fosforyluje również p53, dodatkowo wzmacniając naprawę DNA (Blackford i Jackson 2017). W hNCC, jak również w organoidach zakażonych albo pIRES2-ZsGreen1hGH, albo GH z soczewicy, nadekspresja GH tłumiła fosforylację ATM i kinazy DNA-białkowej (PK)c, obu zaangażowanych w naprawę DNA (Blackford i Jackson). 2017) i zmniejszona fosforylacja docelowego białka p53 (Figury 5A-5C).

Acetyloaza histonowa Tip60 aktywuje ATM (Jackson i Bartek, 2009) i jest ujemnie regulowana przez TRIM29 (Sho i wsp., 2011; Sun i wsp., 2005). Zaobserwowaliśmy, że nadekspresja GH w NCC i organoidach również skutkowała indukcją TRIM29, która z kolei tłumiła Tip60 (Figury 5A-5C). Podobne wyniki zaobserwowano w drugiej linii NCC 48 godzin po nukleofekcji plazmidem wyrażającym GH i 6 dni po infekcji lenti-GH (Figury S4A i S4B).

Autokrynny/parakrynny GH osłabia naprawę DNA

Następnie zmierzyliśmy wpływ na mechanizmy naprawy DSB, w szczególności podatne na błędy niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) (Jackson i Bartek, 2009) i odporną na błędy rekombinację homologiczną (HR) (Beucher et al., 2009 Blackford i Jackson, 2017; Chapman i in., 2012). Dokonaliśmy nukleofekcji NCC stabilnie eksprymujących kasety reporterowe NHEJ i HR z plazmidami pcDNA3.1-ludzkim GH1 (hGH1), indukowaliśmy DSB przez kotransfekcję plazmidem kodującym endonukleazę I-Excel i mierzyliśmy ponowne łączenie reporterów naprawy DSB. Wydajność transfekcji kontrolowano przez kotransfekcję z plazmidem kodującym DsRed (Seluanov i wsp., 2010). Wydajność NHEJ po nukleofekcji pcDNA3.1-hGH1 wyniosła 0.77-0.83 i zmniejszyła się po 48h (p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

Autokrynny/parakrynny GH zwiększa uszkodzenia nienaprawionego DNA

Badając, czy npGH zwiększa uszkodzenia DNA, zaobserwowaliśmy, że NCC i organoidy stabilnie transfekowane lenti-GH wykazały zwiększone uszkodzenia endogennego nienaprawionego DNA, co zmierzono testem Comet (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH jest indukowany w ludzkich organoidach jelitowych w wieku 3D i osłabia DDR

Po zaobserwowaniu zwiększonej ekspresji GH i uszkodzeń DNA w starzejących się próbkach ludzkiej okrężnicy, „zestarzaliśmy” organoidy wytworzone z trzech niezależnych linii iPSC, aby zrekapitulować model starzejącej się tkanki ludzkiej. Organoidy te składają się z enterocytów, komórek kubkowych, komórek Panetha i komórek enteroendokrynnych i wyrażają homeobox typu ogonowego 2 (CDX2) (Barrett i wsp. 2014; Gao i wsp., 2009; Workman i wsp., 2017). Dwie z trzech linii iPSC (linie 1 i 3) uzyskano od osób w wieku powyżej 60 lat, a trzecia linia iPSC (linia 2) pochodziła z fibroblastów 30-letniego osobnika. Organoidy wygenerowane z linii 1 i 3 hodowano przez okres do 2 miesięcy, w którym to momencie proliferacja komórek znacznie zwolniła. W przeciwieństwie do tego organoidy wytworzone z linii 2 silnie proliferowały w hodowli przez okres do 4 miesięcy. Starzenie komórkowe zostało potwierdzone we wszystkich 3 liniach przez wzrost p16, a także przez zmniejszoną długość telomerów (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Ponieważ te cechy organoidalne in vitro wydają się wiernie rekapitulować zmiany komórkowe zgodne ze starzeniem się tkanki ludzkiej (Baker et al.,2011; Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013), użyliśmy tego model do dalszych badań mechanizmów sygnalizacyjnych leżących u podstaw starzenia się ludzkiego nabłonka okrężnicy. W linii 1 poziomy mRNA GH były indukowane po 1 miesiącu hodowli i dalej wzrastały po 2 miesiącach (p < 0,05)="" (rysunek="" 6c),="" co="" jest="" zgodne="" ze="" znacznym="" wzrostem="" npgh="" obserwowanym="" w="" starszych="" organoidach="" zarówno="" w="" analizie="" western="" blot,="" jak="" i="" immunohistochemii="" (ihc)="" (rysunki="" 6d,="" 6e="" i="" s5b).="" yh2ax="" był="" również="" silnie="" indukowany="" przez="" przedłużoną="" hodowlę,="" wskazując="" na="" nagromadzone="" uszkodzenie="" endogennego="" dna="" ze="" starzeniem="" się="" in="" vitro.="" zgodnie="" z="" wynikami="" wykazującymi="" supresję="" p53="" w="" ncc="" i="" organoidach="" transfekowanych="" gh="" (ryc.="" 4a-4c),="" zaobserwowaliśmy="" stłumienie="" p53="" po="" 1="" i="" 2="" miesiącach="" hodowli,="" co="" jest="" zgodne="" ze="" zwiększonym="" npgh="" (ryc.="" 6e="" i="" s5b).="" podobne="" wyniki="" (="" a="" i="" b)="" western="" blot="" komórek="" (a)="" ancc,="" hncf="" i="" hct116="" oraz="" (b)="" organoidów.="" komórki="" traktowano="" wskazanymi="" dawkami="" etopozydu="" i="" analizowano="" 24="" godziny="" później.="" organoidy="" potraktowano="" 3="" um="" etopozydem="">

(C) NCC nukleofekcja GH siRNA (siGH RNA) lub mieszany RNA (Scr RNA) jako kontrola przez 24 godziny była traktowana wskazanymi dawkami etopozydu (Etop) i analizowana 24 godziny później. Ilościową ocenę obrazu J dla western blot przedstawiono na rycinie S1.

（D） Reprezentatywne zdjęcie NCC traktowanego 20 µM etopozydem przez 24 godz. GH, czerwony; yH2AX, zielony; falloidyna, szara; DAPI, niebieski. Jasnozielone jądro wskazuje na apoptozę. Skala, 20 um. Kontrolne, nieleczone komórki.

(E) Western blot GH w pożywce hodowlanej ANCC i organoidów traktowanych odpowiednio 20 lub 5 uM etopozydem. Pożywkę zebrano z rui 8 i 24 godz. oraz z organoidów w 4-48 godz. po traktowaniu. Ponceau był używany jako kontrola załadunku. Przedstawiono reprezentatywne bloty z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów.

zostały uzyskane przez hodowanie organoidów wytworzonych z linii iPSC 2 i 3 odpowiednio przez 4 i 2 miesiące (Figury S6A-S6D).

Ponadto, zwiększony npGH w starych organoidach był związany z atenuowanym DDR, z tłumioną fosforylacją zarówno ATM, jak i DNA-PKc oraz niższymi poziomami ufosforylowanego p53 (Figury 6E i S5B). Wyniki te sugerują, że stłumiona aktywność DDR prowadzi do nagromadzenia nienaprawionych uszkodzeń DNA, czego dowodzi również indukcja yH2AX (Figury 6E i S5B). Po 2 miesiącach hodowli, stare organoidy zakażone shRNA GH wykazywały wzrost p53 (ryc. 6F i S7A) i zmniejszone uszkodzenia DNA mierzone testem Comet (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

Niedobór sygnalizacji GH osłabia uszkodzenia DNA okrężnicy in vivo u starzejących się myszy

Aby potwierdzić nasze wyniki uzyskane na starych organoidach, zbadaliśmy in vivo starzejące się myszy WT i GHR-7. Uszkodzenie DNA okrężnicy było znacznie zwiększone u starych (24-miesięcznych) w porównaniu z młodymi (3-miesięcznymi) myszami WT (p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

DYSKUSJA

Pokazujemy tutaj, że poziom npGH wzrasta wraz z wiekiem w ludzkiej tkance okrężnicy oraz w trójwymiarowych organoidach jelitowych człowieka. Przedstawiamy kilka linii dowodowych sugerujących, że w starzejącej się ludzkiej tkance okrężnicy, npGH jest indukowany przez uszkodzenie DNA, jak zaobserwowano w modelach ludzkich, w tym nienowotworowych komórkach nabłonkowych, normalnych fibroblastach okrężnicy, organoidach i tkance raka okrężnicy u pacjentów poddawanych terapiom uszkadzającym DNA ; pokazujemy również podobne wyniki in vivo w okrężnicy myszy z aktywowanym DDR.

Używając trójwymiarowych organoidów jelitowych człowieka, zaobserwowaliśmy zwiększone p16, starzenie się i skrócenie telomerów, wszystko zgodne ze zmianami w ludzkiej tkance związanymi z wiekiem (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). Pomimo ograniczeń modelu organoidów, nasze wyniki wspierają organoidy jelitowe jako wierną ludzką rekapitulację do badania mechanizmów sygnalizacyjnych leżących u podstaw związanych z wiekiem zmian okrężnicy (Hu et al., 2018).

Odkryliśmy, że lokalny npGH, działając w sposób autokrynny/parakrynny, hamuje p53 i zwiększa proliferację sąsiednich komórek. Indukowany GH hamuje również naprawę DDR i DNA, dodatkowo zwiększając akumulację uszkodzeń DNA. Wyniki są również zgodne z obserwowanym wpływem na akumulację uszkodzeń DNA w ludzkich guzach przysadki mózgowych wydzielających GH (Ben-Shlomo i wsp., 2020).

Działanie GH w prawidłowej tkance okrężnicy sprzyja rozwojowi środowiska proproliferacyjnego, które może leżeć u podstaw związanych z wiekiem zwiększonych częstości występowania polipów okrężnicy, czego przykładem jest związane z wiekiem uszkodzenie DNA i niestabilność chromosomów jako czynniki powodujące występowanie raka okrężnicy u pacjentów w wieku powyżej 50 lat (Aunan i in., 2017). Związane z wiekiem zwiększone uszkodzenia DNA, które tutaj pokazujemy, są również zgodne z doniesieniami, że yH2AX wzrasta liniowo z wiekiem w normalnych próbkach okrężnicy (Risques i in., 2008). Obserwowana przez nas wyraźna regulacja w górę yH2AX w starzejących się organoidach wskazuje na akumulację uszkodzeń DNA, ponieważ yH2AX oznacza miejsca uszkodzenia DNA w celu przyciągnięcia białek naprawczych DNA (Turinetto i Giachino, 2015). Wyniki te mogą pozornie być sprzeczne z faktem, że GH indukowany w starzejących się komórkach hamuje fosforylację H2AX. Jednak interpretujemy te obserwacje, aby pokazać, że GH zmniejsza aktywność DDR poprzez zmniejszenie fosforylacji ATM, co z kolei zmniejsza (ale nie całkowicie znosi) fosforylację białek niższego rzędu, w tym H2AX. Gdy DDR nie jest odpowiednio aktywowany, naprawa DNA jest zmieniona, ale yH2AX nadal gromadzi się, ponieważ oznacza nienaprawione miejsca uszkodzenia DNA. Zatem poziomy yH2AX obserwowane w starzejącej się ludzkiej tkance i organoidach odzwierciedlają wynik netto aktywności DDR i ilość nienaprawionego DNA.

Uszkodzenia DNA mogą kumulować się w starzejącej się tkance z powodu utraty naprawy przez wycinanie zasad, prawdopodobnie z powodu utraty odpowiedzi p53 na uszkodzenie DNA (Cabelof i wsp., 2006; Simon i wsp., 2009, 2012). W naszych eksperymentach p53 zmniejszyło się w komórkach okrężnicy i organoidach z ekspresją npGH, zgodnie z wcześniejszymi odkryciami GH hamującego p53 (Chesnokova i wsp., 2016). W przeciwieństwie do tego, starsze myszy GHR-/-, które są odporne na raka i mają dłuższą żywotność (Basu i wsp., 2018), a także myszy GHRcolKO specyficzne dla okrężnicy wykazują zwiększoną ekspresję p53 okrężnicy, prawdopodobnie wzmacniając naprawę DNA. Ponieważ GH hamuje p53 (Chesnokova i wsp., 2013), indukcja npGH może skutkować zmianami w lokalnym mikrośrodowisku zgodnymi ze związanym z wiekiem obniżonym p53 (Feng i wsp., 2007; Goukassian i wsp., 2000). Promotor GH zawiera miejsce wiązania p53 (Chesnokova et al., 2013), a p53 indukowany uszkodzeniem DNA aktywuje ekspresję GH (Chesnokova et al. 2013,2019a). Tak więc nasze wyniki pokazują, że w starych organoidach akumulacja uszkodzeń DNA indukuje npGH, co z kolei obniża poziom p53.

Co ważne, ponieważ npGH jest wydzielany lokalnie z komórek z uszkodzonym DNA, może działać parakrynne działanie wydzielanego GH na sąsiednie komórki. Podczas wspólnej hodowli hNCF z ekspresją GH z chipem jelita grubego zaobserwowaliśmy zwiększone uszkodzenie DNA i proliferację oraz obniżoną regulację p53/p21 w komórkach nabłonkowych osadzonych w chipie wystawionych na działanie parakrynne pochodzących z fibroblastów. Wyniki te sugerują, że miejscowe nieindukowane starzenie się w tkance ludzkiej zmienia mikrośrodowisko tkanki poprzez hamowanie białek supresorowych guza i zwiększanie proliferacji nabłonka i uszkodzenia DNA.

Wyniki są zgodne z obserwacjami, że egzogenne leczenie GH zwiększa zdolność proliferacyjną, tworzenie kolonii i przerzuty u myszy DJ-1 KO (Chien i wsp., 2016) oraz z dowodami, że indukcja GH w ludzkich komórkach nowotworowych jest związana z progresja kilku nowotworów (Perry et al., 2017); zgadzają się one z naszymi wynikami pokazującymi mniej formacji kolonii i mniejszy rozmiar kolonii z supresją GH.

Ścieżki naprawy uszkodzeń DNA chronią przed niestabilnością chromosomów, która napędza transformację komórkową (Negrini i wsp. 2010). Na przykład Tip60 aktywuje ATM (Jackson i Bartek, 2009), a ATM, centralny regulator DDR, fosforyluje i stabilizuje p53. Starzejące się komórki wykazują zmniejszoną supresję ATM i p53, a także dysregulację naprawy DNA z późniejszymi nienaprawionymi uszkodzeniami DNA (Lan i wsp., 2019). Tak więc w komórkach okrężnicy uszkodzenia DNA kumulują się wraz z wiekiem (Risques i wsp., 2008; Schu-macher i wsp., 2008), przynajmniej częściowo z powodu zmniejszającej się wydajności DDR (Jackson i Bartek, 2009) i supresji p53 w komórkach okrężnicy. odpowiedź na promieniowanie y u starzejących się myszy była przypisywana związanemu z wiekiem spadkowi stabilizującego p53-ATM (Feng et al, 2007). do zmniejszonej naprawy DNA, o czym świadczy odpowiednio osłabiona fosforylacja ATM i p53. Wyniki te sugerują, że lokalna nadekspresja npGH może przyczyniać się do związanej z wiekiem dysregulacji DDR i naprawy DNA. W starych organoidach indukcja GH osłabiła DDR, podczas gdy supresja GH aktywowała DDR, o czym świadczy zmniejszenie uszkodzeń DNA. Wyniki te są poparte naszymi wcześniejszymi obserwacjami, że blokowanie sygnalizacji GH w ANCC prowadziło do zmniejszenia uszkodzeń DNA (Chesnokova i wsp., 2019a). Ponadto pokazujemy, że uszkodzenie DNA okrężnicy nie kumuluje się u myszy GHRcolKO ukierunkowanych na okrężnicę z wyciętym GHR, ale kumulowało się w jelicie cienkim, gdzie GHR był nienaruszony. Te wyniki, wraz z naszym wykazaniem, że starsze myszy GHR-7- nie gromadzą uszkodzeń DNA okrężnicy, potwierdzają in vivo hipotezę, że lokalna indukcja npGH z komórkami agemayrendera podatnymi na transformację i być może również przyczynia się do oporności na leczenie raka, ponieważ zasugerowano (Basu i Kopchick, 2019).

Przedstawione tutaj wyniki wskazują również na możliwość, że w działaniu GH może pośredniczyć insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF1). W przeciwieństwie do GH, sygnalizacja IGF1 aktywuje naprawę DNA w komórkach nienowotworowych i nowotworowych (Chesnokova i Melmed, 2020; Chitnis i wsp., 2014; Turney i wsp., 2012) i wykazaliśmy, że GH supresja p53 i indukcja DNA uszkodzenia występują niezależnie od IGF1 w prawidłowej tkance okrężnicy (Ches-nokova i wsp.,2019a, 2019b). Jednak w komórkach i tkankach, w których GH aktywuje IGF1, ten ostatni czynnik wzrostu może również sygnalizować w sposób specyficzny dla komórki, aby przeciwdziałać działaniu GH na stabilność genomu.

Odkrycia sugerują, że npGH indukowany w starzejącej się tkance okrężnicy w odpowiedzi na nagromadzone uszkodzenie DNA ułatwia dalsze uszkodzenia DNA i wydaje się być niekorzystnym wyznacznikiem naprawy uszkodzeń DNA. Ekstrapolacja tych odkryć zapewnia platformę dla kilku potencjalnych zastosowań klinicznych. Ponieważ akumulacja uszkodzeń DNA jest cechą charakterystyczną chorób związanych z wiekiem, kierowanie sygnalizacji GH w celu zablokowania działania autokrynnego/parakrynnego może okazać się przydatne w hamowaniu związanych z wiekiem uszkodzeń nabłonkowego DNA i ostatecznie łagodzeniu progresji związanych z wiekiem patologii nabłonkowych (Miman i in. ,2016) Takie podejście może również przynieść korzyści pacjentom onkologicznym poddawanym terapiom uszkadzającym DNA, u których zmiany pola nabłonkowego wywołane przez autokrynne/parakrynne żadne działanie nie może uszkadzać prawidłowej sąsiedniej tkanki. W związku z tym zakłócenie sygnalizacji GH za pomocą zatwierdzonego antagonisty GHR (List i wsp., 2011; Trainer i wsp., 2000) może przynieść korzyści kliniczne. Co ważne, ludzki GH jest niewłaściwie promowany jako niezatwierdzona terapia przeciwstarzeniowa i wzmacniająca siłę (Giordano i in., 2008; Holt i Ho, 2019; Medeiros i Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Biorąc pod uwagę szkodliwe działanie parakrynne npGH, o którym tutaj mówimy, długotrwałe niewłaściwe podawanie GH jako eliksiru przeciwstarzeniowego może wywołać sygnalizację GHR i ryzyko rozwoju uszkodzenia DNA komórek nabłonka, a także potencjalną aktywację ukrytych zmian proliferacyjnych.

Ten artykuł pochodzi z Raportów komórkowych 37, 11 0068, 14 grudnia 2021 r., 2021 r. Autorzy. 1 Jest to artykuł z otwartym dostępem na licencji CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)