Białka Lysin Motif (LysM): wzajemne powiązania manipulacji odpornością roślin i grzybami

Abstrakcyjny:

Białka z motywem lizyny (LysM) to moduły białkowe wiążące węglowodany, które odgrywają kluczową rolę w interakcjach gospodarz-patogen. Roślinne białka LysM działają głównie jako receptory rozpoznawania wzorców (PRR), które wyczuwają chitynę w celu wywołania odporności rośliny. W przeciwieństwie do tego, grzybowy LysM blokuje wykrywanie lub sygnalizację chityny, aby hamować indukowaną chityną odporność gospodarza. W tym przeglądzie przedstawiamy historyczne perspektywy dotyczące LysM roślin i grzybów, aby pokazać, w jaki sposób białka te są zaangażowane w regulację odpowiedzi immunologicznej roślin przez drobnoustroje. Rośliny wykorzystują białka LysM do rozpoznawania chityn grzybów, które następnie są rozkładane przez chitynazy roślinne w celu wywołania odporności. W przeciwieństwie do tego patogeny grzybicze rekrutują białka LysM, aby chronić swoją ścianę komórkową przed hydrolizą przez chitynazę roślinną, aby zapobiec aktywacji odporności indukowanej chityną. Odkrycie tego koewolucyjnego wyścigu zbrojeń, w którym LysM odgrywa kluczową rolę w manipulowaniu, ułatwia lepsze zrozumienie mechanizmów rządzących interakcjami roślina-grzyb.

Słowa kluczowe:

białko motywu lizyny (LysM); interakcje roślina-grzyb; chityna; manipulacja odpornością.

Motywy lizynowe (GRAS) to klasa konserwatywnych sekwencji białkowych, które występują w różnych organizmach. Biorą udział w regulacji wzrostu i rozwoju oraz adaptacji do stresu u roślin i grzybów, a także występują u ssaków. Ostatnie badania wykazały, że białka GRAS są również zaangażowane w regulację odpowiedzi immunologicznej u roślin i ssaków, wpływając w ten sposób na odporność. U roślin białka GRAS biorą udział w pośredniczeniu w reakcjach obronnych roślin na patogeny. Na przykład u Arabidopsis thaliana białka GRAS SHR i SCR biorą udział w odporności korzeni roślin na patogeny, a białka te mogą indukować apoptozę w korzeniach roślin i sprzyjać śmierci bakterii chorobotwórczych. Ponadto białka GRAS zwiększają również odporność roślin na patogeny poprzez udział w regulacji ekspresji genów w aktywacji immunologicznej roślin.

U ssaków, chociaż istnieje niewiele badań dotyczących funkcji immunologicznych białek GRAS, niektóre badania wykazały, że są one zaangażowane w regulację immunologiczną. Na przykład białko GRAS SPRY2 może hamować proliferację i aktywację limfocytów T oraz zwiększać liczbę regulatorowych limfocytów T, regulując w ten sposób równowagę odpowiedzi immunologicznej. Z drugiej strony białko GRAS OSL1 może również uczestniczyć w regulacji odpowiedzi immunologicznej ssaków, a także może hamować aktywację i proliferację limfocytów T.

Można zatem zauważyć, że białka GRAS biorą udział w regulacji odpowiedzi immunologicznych u roślin i ssaków, wpływając w ten sposób na odporność. Przyszłe badania muszą zbadać specyficzną rolę i mechanizm białek GRAS w regulacji immunologicznej, aby zapewnić teoretyczne podstawy do opracowania nowych immunomodulatorów. To pokazuje, jak ważna jest odporność, więc musimy ją poprawić. Cistanche może wzmacniać odporność. Popiół mięsny zawiera różnorodne biologicznie aktywne składniki, takie jak polisacharydy, dwa grzyby, Huang Li itp. Stymulują różne komórki układu odpornościowego i zwiększają ich aktywność immunologiczną.

Kliknij proszek ekstraktu cistanche tubulosa

1. Wstęp

Będąc nieruchomymi, rośliny stają w obliczu wielu wyzwań w ciągu swojego życia, w tym przed patogenami. Rośliny nie posiadają krążącego układu odpornościowego jak zwierzęta, ani nie wytwarzają przeciwciał do zwalczania patogenów [1]. Tak więc unikalne strategie obrony przed inwazją patogenów zostały opracowane przez rośliny w trakcie ich ewolucji. Rośliny wyewoluowały receptory odpornościowe jako środek do wykrywania, a następnie odstraszania patogenów [2]. Receptory immunologiczne w roślinach można podzielić na dwa główne typy, receptory rozpoznawania wzorców (PRR) i receptory bogate w leucynę wiążące nukleotydy (NLR) [3]. PRR zostały wykorzystane jako podstawowa obrona przed patogenami.

Ogólnie rzecz biorąc, PRR są zlokalizowane na błonie komórkowej i należą do rodziny kinaz receptorowych, które generalnie obejmują zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand, domenę transbłonową i domenę kinazy wewnątrzkomórkowej [4]. Zewnątrzkomórkowe domeny PRR mogą specyficznie rozpoznawać molekularne wzorce molekularne (MAMP), takie jak bakteryjny lipopolisacharyd (LPS), flagelina, EF-Tu (termoniestabilny czynnik elongacyjny), peptydoglikany, grzybowa chityna i -glukany oraz ergosterole aktywują wewnątrzkomórkowych domen kinazowych przez domeny transbłonowe, które z kolei wzmacniają dalsze sygnały immunologiczne [5-7]. Aby przebić się przez ten pierwszy poziom barier układu odpornościowego rośliny, patogeny wydzielają do komórek roślinnych małe cząsteczki zwane efektorami. Te efektory zakłócają sygnalizację kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) i jej transmisję w dół poprzez hamowanie translacji i aktywności PRR oraz ich złożonej sygnalizacji. Poza tym może również wpływać na odporność roślin poprzez zakłócanie kilku procesów komórkowych, takich jak wytwarzanie ROS, transport pęcherzyków, odkładanie się kalusa i wzmacnianie ściany komórkowej [5,7].

Domena LysM obejmuje białka, które bezpośrednio odgrywają rolę w PRR regulujących odporność roślin lub jako efektory w patogennych grzybach, które tłumią odporność roślin [8]. Domena LysM jest ogólnym modułem wiążącym peptydoglikan, który ma drugorzędową strukturę z dwoma helisami ułożonymi po tej samej stronie antyrównoległego arkusza. Ogólnie moduł LysM zawiera około 50 aminokwasów i wiąże się z peptydoglikanami, chityną i ich pochodnymi [9]. Domena LysM została początkowo odkryta w antybakteryjnym enzymie lizozymie bakteriofaga [8], a rosnąca liczba badań wykazała, że ​​białka domeny LysM są szeroko rozpowszechnione u eukariontów i prokariotów [10,11].

Jako domena funkcjonalna, która pomaga uniknąć odporności gospodarza, funkcja białek domeny LysM opiera się na właściwościach wiązania domeny LysM z grzybowym polisacharydem chityny, który jest nierozpuszczalnym złożonym węglowodanem w ścianie komórkowej grzybów, który generalnie jest rozkładany przez chitynazy roślinne. 12]. Ściana komórkowa patogenów grzybowych jest pierwszym punktem kontaktu z rośliną żywicielską, a głównym składnikiem ściany komórkowej grzybów jest chityna [12]. W przypadku roślin grzybowa chityna działa jak MAMP, który indukuje odporność roślin poprzez wiązanie się z pokrewnymi PRR w roślinach. W przeciwieństwie do tego, aby uniknąć odpowiedzi obronnej gospodarza, efektory zawierające domenę LysM są wydzielane przez patogeny grzybowe w celu ochrony ich ścian komórkowych. Chityna jako niezbędny składnik ściany komórkowej grzybów działa jako ważna cząsteczka w manipulowaniu odpornością gospodarza, w której pośredniczą białka LysM. Ta interakcja międzycząsteczkowa podkreśla wyniki precyzyjnie kontrolowanych procesów gospodarz-patogen, które stały się podstawą poprawy odporności upraw na choroby [13].

Dlatego w tym przeglądzie zapewniamy wszechstronną ocenę właściwości biologicznych białek LysM z roślin i grzybów, mechanizmów, za pomocą których zachodzi manipulacja odpornością gospodarza, oraz ich interaktywnych ról między roślinami i grzybami, aby ułatwić zrozumienie mechanizmu LysM -odporność pośredniczona i jej znaczenie dla rolnictwa.

2. LysM pośredniczy w sygnalizacji chityny w roślinach

LysM występuje w postaci kinaz receptoropodobnych (LYK) zawierających LysM lub niekinazowych LysM [14]. LYK występują wyłącznie w roślinach i biorą udział w regulacji odporności roślin [14]. Roślinne białka LysM są bardzo zróżnicowane, z co najmniej sześcioma różnymi typami w przeciwieństwie do typów niekinazowych, co sugeruje, że białka LysM występują w szeregu złożonych domen strukturalnych [14,15]. Jednak funkcja biologiczna nie została przypisana do większości genów LysM niebędących kinazami.

2.1. LysM w Arabidopsis i Ryżu

Rozpoznanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) przez PRR jest pierwszym krokiem w obronie roślin, PAMP są konserwatywnymi cząsteczkami wywołującymi, takimi jak grzybowa chityna i chitooligosacharydy, bakteryjny peptydoglikan, a dojrzewanie i transport PRR jest ważnym procesem biologicznym. Chitin elicitor receptor kinaza 1 (CERK1) jest klasycznym członkiem LysM, który występuje w ryżu i Arabidopsis [16,17]. Działa jako PRR na błonach komórek roślinnych, aby rozpoznać niektóre konserwatywne wzorce molekularne pochodzące od patogennych grzybów i wywołać odpowiedź immunologiczną gospodarza (ryc. 1). CERK1, który zawiera trzy domeny LysM, odgrywa kluczową rolę w percepcji induktorów chitynowych oligosacharydów i transdukcji N-acetyloglukozaminy. Wykazuje większe powinowactwo do oligosacharydu chityny z dłuższymi resztami. Odpowiedzi immunologiczne indukowane przez grzybową chitynę MAMP obejmują aktywację MAPK, wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) i ekspresję genów obronnych [16,18-20].

Ryżowy receptor chityny OsCERK1 dojrzewa w retikulum endoplazmatycznym, skąd jest transportowany do retikulum ektoplazmatycznego przez aparat Golgiego. Podczas tego procesu białko indukowane stresem (Hop / Sti1) i białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) mogą składać jedną lub więcej specyficznych dla roślin GTPazy typu Rho OsRac1, członka rodziny Rho trifosforanu guanozyny (GTPazy), która tworzy kompleksy w retikulum endoplazmatycznego, a następnie transport OsCERK1 z retikulum endoplazmatycznego do retikulum endoplazmatycznego reguluje dojrzewanie OsCERK1. Proces transportu opiera się na regulacji białka związanego z wydzielaniem małej GTPazy oraz białka ras związanego z rasem 1 (GTPaza Sar1) [21].

Jako małe białko regulujące nukleotyd guaniny (G), OsRac1 bierze udział w kompleksie receptorowym zawierającym OsCERK{1}}, który reguluje odporność po tym, jak chityna grzyba jest postrzegana przez komórki ryżu [21,22]. Członek kinazy cytoplazmatycznej podobnej do receptora (RLCK), w tym prawdopodobna białkowa kinaza serynowo-treoninowa podobna do 27 (PBL27), będąca dalszym składnikiem CERK1, odgrywa ważną rolę w wykrywaniu chityny i sygnalizacji w dół, co ostatecznie przyczynia się do modulacji odporności indukowanej chityną u Arabidopsis [23]. Po rozpoznaniu chityny przez CERK1, PBL27 jest fosforylowana przez CERK1. Fosforylowany PBL27 bierze następnie udział w aktywacji MAPK [23]. Podobnie, podobna do receptora kinaza cytoplazmatyczna w OsRLCK185 ryżu może być również fosforylowana przez OsCERK1 aktywowany chityną i wywoływać odpowiedzi MAPK [24,25]. OsRLCK185 fosforyluje również cytoplazmatyczną ferrytynę OsDRE2a, homologi ryżu drożdżowego białka Dre2, w celu modulowania wywołanego chityną wybuchu ROS [26]. Inni członkowie RLCK VII, w tym OsRLCK57, OsRLCK107, OsRLCK118 i OsRLCK176, są również zaangażowani w kilka chitynowych szlaków sygnałowych [27-29].

Ponadto u Arabidopsis zidentyfikowano kilka innych dalszych komponentów związanych z sygnalizacją, w której pośredniczy CERK{0}}. Roślinne białko U-box 4 (PUB4) to ligaza ubikwityny, która oddziałuje z CERK1. Jest pozytywnym regulatorem sygnalizacji chitynowej poprzez swoją rolę w produkcji ROS i odkładaniu się kalozy po percepcji oligosacharydu chityny [30]. Członkowie kinazy cytoplazmatycznej VII podobnej do receptora Arabidopsis, w tym RLCK VII{7}}, RLCK VII{8}}, RLCK VII{9}} i RLCK VII-8, działają w dół od PRR zaangażowanych we flagelinę i sygnalizację chitynową, przyczyniają się do odkładania kalozy i generowania RFT. Szczególnie wykazano, że RLCK VII -4 jest ważny dla sygnalizacji chitynowej poprzez swoją rolę w aktywacji kaskady MAPK po percepcji chityny, łącząc w ten sposób sygnalizację PRR z MAPK [31]. Podsumowując, wyniki te wskazują, że moduł sygnalizacyjny CERK1 – RLCK odgrywa konserwatywną rolę w produkcji ROS u Arabidopsis i ryżu podczas odpowiedzi immunologicznej wyzwalanej chityną [21–31].

Co ciekawe, wykazano, że receptor chitynowy CERK1 wiąże się bezpośrednio z chityną, ze wszystkimi trzema zewnątrzkomórkowymi domenami LysM wymaganymi do wiązania chityny, ale, co ważniejsze, bez żadnych innych oddziałujących białek, dostarczając w ten sposób dowodów, że CERK1 jest głównym białkiem wiążącym chitynę w roślinach. 32]. Konserwatywna domena parabłonowa przybłonowa (JM) reguluje aktywność kinazy CERK1 u Arabidopsis. Ponadto domena parabłonowa JM odgrywa również funkcjonalnie konserwowaną rolę w aktywacji sygnału wykrywającego chitynę u Arabidopsis [33]. Wreszcie, dimeryzacja CERK1 indukowana chityną jest kluczowym procesem biologicznym, który jest niezbędny do transdukcji sygnału immunologicznego indukowanej przez chitynę [34]. Na przykład indukowana ligandem homodimeryzacja CERK1 jest wymagana do molekularnych wzorców percepcji liganda, aktywacji receptora i transdukcji sygnalizacji immunologicznej [34,35].

Fosforylacja białek jest również kluczowym etapem regulacyjnym w roślinnej sygnalizacji LysM [23]. Po pierwsze, ponieważ CERK1 jest głównym białkiem wiążącym chitynę, które jest bezpośrednio zaangażowane w wiązanie chityny przez LysM, jego percepcja i transmisja sygnału chityny zależą od modyfikacji potranslacyjnych i aktywności kinazy [32]. Wiadomo, że CERK1 fosforyluje receptoropodobne kinazy cytoplazmatyczne PBL27 u A. thaliana [23,36]. Podobnie w ryżu czynnik wymiany nukleotydów guaninowych dla OsRac1 OsRacGEF1 jest fosforylowany przez kinazę cytoplazmatyczną OsCERK1 [22]. CERK1 oddziałuje również z LYK5 w celu wykrycia oligosacharydu chityny i aktywacji dalszych składników kaskady sygnalizacyjnej chityny; następnie LYK5 oddziela się od CERK1, aby wejść do pęcherzyków i ulega endocytozie przez fosforylację z CERK1 [37]. Po wykryciu chityny CERK1 rekrutuje fosfatazę białkową 1 (CIPP1) oddziałującą z CERK{21}}, przewidywaną fosfatazę Ser/Thr, do defosforylacji Tyr428 i tłumienia sygnalizacji CERK1 [38].

Inne RLK i RLP zawierające domenę LysM występują również w ryżu i Arabidopsis i są zaangażowane w sygnalizację chitynową. Na przykład białka wiążące ekscytony chitynowe (CEBiP) były pierwszymi odkrytymi roślinnymi LysM RLP w ryżu [39]. Analiza struktury molekularnej domeny rozpoznawania chityny OsCEBiP wykazała, że ​​struktury krystaliczne wolnej ektodomeny (ED) OsCEBiP (OsCEBiP-ECD) zawierają trzy tandemowe LysM, po których następuje nowy strukturalny fałd domen bogatych w cysteinę [40]. Analiza strukturalna wykazała również, że wiązanie chityny nie może znacząco wpływać na konformację OsCEBiP, ale chityna w „trybie ślizgowym” powoduje agregację OsCEBiP, która odgrywa kluczową rolę w percepcji i transdukcji kilku induktorów chityny w komórkach ryżu [39–41].

Ponadto OsLYP4 i OsLYP6, jako LysM-RLP, również wykazują powinowactwo do chityny, prawdopodobnie jako małe receptory chityny [42], z których oba mogą tworzyć homo- i heterodimery oraz wchodzić w interakcje z CEBiP, aby uczestniczyć w transdukcji sygnału peptydoglikanu (PGN) i chityny [42,43]. OsCERK1 może być również używany jako łącznik do wiązania z OsLYP4 i OsLYP6 [44]. Podczas gdy homolog OsCEBiP u Arabidopsis, zawierający domenę z motywem lizyny, zawierający glikozylofosfatydyloinozytol-to-anchoredprotein2 (LYM2), wykazuje podobieństwo do CEBiP ryżu, nie bierze udziału w sygnalizacji pomimo wysokiego powinowactwa do wiązania z oligosacharydem p-chityny [44]. LYM2 pośredniczy w redukcji przepływu molekularnego poprzez plazmodesmy w obecności oligosacharydu chityny w celu indukowania odpowiedzi obronnych przeciwko patogenowi grzybowemu Botrytis halal, ale LYM2 nie jest wymagany do odpowiedzi obronnych wyzwalanych przez CERK{20}}, co wskazuje, że istnieją co najmniej dwa niezależne szlaki odpowiedzi aktywowane chityną u Arabidopsis [44].

Ponadto stwierdzono, że kilka innych homologów CEBiP u Arabidopsis bierze udział w regulacji transdukcji sygnału chityny i odporności roślin, w tym kinaza LysM RLK1-oddziałująca 1 (LIK1), kinaza receptora LysM 3 (LYK3), LysM kinaza receptorowa 4 (LYK4) i kinaza receptorowa LysM 5 (LYK5) [37,44–47]. Kilka oligomerów chityny może indukować heterodimeryzację AtLYK5 i homodimeryzację AtCERK1, ale indukowany chityną heterodimer AtLYK5-AtCERK1 jest silniejszy niż homodimer AtCERK1, ponieważ tylko AtCERK1 zawiera domenę kinazy, która, jak wykazano, jest również odpowiedzialna za inicjowanie wewnątrzkomórkowej sygnalizacji chitynowej. 48].

Negatywne czynniki regulacyjne odgrywają również kluczową rolę w ekspresji podstawowych i wczesnych genów obronnych indukowanych przez patogeny oraz w ochronie wzrostu roślin przed trwałym uszkodzeniem układu odpornościowego wywołanym chityną [36]. Na przykład AtLYK3 i LIK1 negatywnie regulują obronę roślin indukowaną chityną i działają jako składniki kompleksu kinazy cytoplazmatycznej PBL27. Roślinne białko U-box 12 (PUB12) negatywnie reguluje odporność indukowaną chityną [36,45,47]. AtCERK1 aktywowany chityną defosforyluje swoją 428 resztę tyrozynową poprzez rekrutację CIPP1, który może być wykorzystany jako mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego do blokowania transdukcji sygnału chitynowego [38]. Jednak nadal nie wiadomo, w jaki sposób rośliny równoważą te pozytywne i negatywne reżimy sygnalizacyjne lub czy polegają na innych cząsteczkach sygnalizacyjnych.

Wreszcie, odpowiedź immunologiczna jest złożoną i precyzyjną siecią, która obejmuje wiele przesłuchów sygnalizacyjnych podczas interakcji roślina-patogen, a LysM nie są wyjątkiem [46]. AtLYK3 bierze udział w negatywnym przesłuchu, w którym pośredniczy hormon kwasu abscysynowego (ABA), z odpowiedziami immunologicznymi roślin [46]. LIK1 pozytywnie reguluje sygnalizację hormonu kwasu jasmonowego/etylenu (JA/ET) i negatywnie reguluje reakcje obronne roślin indukowane chityną [47]. Domena LysM EMBRYO SAC 1 (OsEMSA1A) odpowiada za rozwój i funkcję blastocyst zarodka [49]. CERK1 jest wymagany w odpowiedzi zarówno na symbiozę mikoryzy arbuskularnej (AM), jak i na stres solny roślin [50–53]. Wyniki te sugerują, że CERK1, oprócz zaangażowania w odpowiedzi immunologiczne jako RLK, pełni również dwie lub więcej funkcji niezależnych mechanistycznie. Na przykład CERK1 może odgrywać rolę w kontroli śmierci komórkowej niezależnie od chityny i nie jest zależny od jej aktywności kinazowej [54].

Oligosacharydy chityny -1,4- oligomery N-acetyloglukozaminy (GlcNAc), które służą jako jedyna glikozydowa struktura ściany komórkowej grzybów, działają również jako MAMP w roślinach, ale nierozgałęzione -1,{ {4}}glukan oligosacharydów polifilowych ogórka może również wywoływać u Arabidopsis odporność wyzwalaną przez PAMP (PTI) za pośrednictwem receptora CERK1 [55]. Arabidopsis CERK1 pośredniczy w odporności roślin w odpowiedzi na oporność gospodarza na Fusarium oxysporum [56]. Ostatnio zasugerowano, że OsCERK1 odgrywa dodatkową rolę w wywoływaniu bakteryjnej odpowiedzi immunologicznej indukowanej lipopolisacharydem (LPS) u ryżu [54]. Zmutowane allele Arabidopsis cerk1–4 nie gromadziły pozakomórkowych hydrolizatów białek, co prowadziło do zwiększenia podatności lub indukcji starzenia [54]. Ponieważ cerk1-4 rośliny wykazywały normalne odpowiedzi na chitynę, śmierć komórek nie była związana z aktywnością kinazy AtCERK1 [54]. Opisano również rolę AtCERK1 w tolerancji soli u Arabidopsis, AtCERK1 oddziałuje z białkiem kanału wapniowego ANNEXIN 1 (ANN1), które jest odpowiedzialne za indukowany solą przepływ wapnia do wewnątrz [50].

2.2. LysM w innych roślinach

Homologi CERK1 pełnią również ważne funkcje biologiczne w innych roślinach, zwłaszcza w manipulacjach odpornościowych [57-59]. Białka zawierające LysM są również różnicowane funkcjonalnie w różnych procesach komórkowych. Białko zawierające LysM 1 w morwie (MmLYP1), homolog CEBiP, ma działanie hamujące na nierozpuszczalną chitynę i opiera się na białkach zawierających LysM 2 (MmLYK2, homolog CERK1) podczas infekcji workowcami [60]. W przypadku bawełny dwie kinazy podobne do receptora LysM, Gh-LYK1 i Gh-LYK2, mają pewien wpływ na odporność bawełny na werticillium. Wszystkie trzy domeny LysM Gh-LYK1 i Gh-LYK2 są wymagane do ich zdolności wiązania chityny, a indukowane wirusem wyciszanie genów (VIGS) Gh-LYK1 i Gh-LYK2 w roślinach bawełny obniża odporność na Verticillium dahliae.

Jednak Gh-LYK2 i Gh-LYK1 mogą w różny sposób przyczyniać się do obrony w bawełnie. Gh-LYK2, ale nie Gh-LYK1, jest pseudokinazą, a ED Gh-LYK2 może indukować wybuch ROS w roślinach [58]. GhWAK7A w bawełnie bezpośrednio oddziałuje z GhLYK5 i GhCERK1 i promuje indukowaną chityną dimeryzację GhLYK5-GhCERK1, która odgrywa istotną rolę w odpowiedzi indukowanej chityną [61]. Ponadto białko podobne do receptora typu LysM 1 (LYP1), zawierająca LysM kinaza podobna do receptora 7 (LYK7) i zewnątrzkomórkowe białko LysM 3 (LysMe3) są receptorami błonowymi, które rozpoznają sygnały chityny, które mogą aktywować dalsze procesy obronne i zwiększać odporność do V. dahliae [62]. W przeciwieństwie do ryżu OsCERK1, białka LysM w pomidorach wykazują znaczną rozbieżność funkcjonalną [63]: w pomidorach SlLYK10 i SlLYK12 uczestniczą w regulacji symbiozy AM, SlLYK1 bierze udział w indukowanej chityną odpowiedzi immunologicznej, a SlLYK13 bierze udział w śmierci komórki [57 ,64]. Homolog AtCERK1 z jabłek, MdCERK1, poprawia odporność na Alternaria alternata [59]. Chitynaza-A Pteris ryukyuensis (PrChiA) ma działanie wiążące chitynę i przeciwgrzybicze [65], podczas gdy chitynaza-A Equisetum arvense (EaChiA) nie [66]. Główną różnicą strukturalną między PrChiA i EaChiA jest liczba domen LysM [66], ale nie ma danych sugerujących, że jest to związane z różnicami w działaniu przeciwgrzybiczym. Ponadto zidentyfikowano również obecność białek LysM w jabłkach, winogronach, ziemniakach i jabłoniach i udowodniono, że biorą one udział w indukowanych chityną odpowiedziach immunologicznych [59,67-69]. Białka LysM grochu, petunii i lucerny biorą udział w symbiozie rośliny AM [70–73].

3. LysM hamuje sygnalizację chitynową u grzybów

Wiele patogenów grzybowych koduje egzosomalne efektory zawierające tę samą domenę LysM, co receptory chitynowe roślin. Większość patogenów grzybiczych hamuje odporność roślin indukowaną chityną poprzez blokowanie wykrywania lub sygnalizacji chityny [74-79]. Ecp6 w Cladosporium flavum, pierwszy odkryty efektor domeny LysM, chelatuje chitynę podczas infekcji [74]. Oligosacharydy chityny uwolnione ze ściany komórkowej grzybni inwazyjnej w wyniku lizy komórkowej lub zdegradowane przez chitynazy roślinne wiążą się z oligomerami chityny, aby uniemożliwić roślinom percepcję, blokując odporność roślin wyzwalaną przez chitynę [74,75]. Następnie odkryto partię grzybowych efektorów LysM zaangażowanych w hamowanie odporności roślin.

Zewnątrzkomórkowe białka strukturalne LysM Colletotrichum higginsianum ChELP1 i ChELP2 grzyba ascomycete powodującego chorobę antraknozy u roślin odgrywają podwójną rolę w przyczepianiu, funkcji komórek i wywoływanej chityną immunosupresji roślin. ChELP1 i ChELP2 odgrywają ważną rolę w utrzymaniu wirulencji grzybów i ich zdolności do penetracji komórek naskórka Arabidopsis i błon celofanowych [79]. Metaloproteaza fungalizyny w grzybie antraknozy kukurydzy Colletotrichum graminicola (Cgfl) zawiera nie tylko dwie domeny LysM, ale także metaloproteinazy cynku konserwatywnej domeny katalitycznej HEXXH i jest szeroko konserwowana u grzybów. Po zarażeniu kukurydzy Cgfl ulega swoistej ekspresji podczas fazy biotroficznej i wykazano, że grzyb wykorzystuje zarówno strategie, w których pośredniczy Cgfl, jak i białko LysM, aby kontrolować sygnały chitynowe poprzez tłumienie aktywności chitynazy gospodarza [80]. Podobnie, grzyb zarazy ryżu Magnaporthe oryzae opiera się nie tylko na białku LysM SLP1, ale także na homologu białka z rodziny 9 aktywności pomocniczej (Aa9) MoAa91 (z M. oryzae), który jest wymagany do rozpoznawania powierzchni, jak również do tłumienia indukowanej chityną odpowiedzi immunologiczne roślin. MoAa91 jest regulowany przez sygnalizację białkiem G (RGS) i białka podobne do RGS, które są wymagane do rozwoju appressorium, a także podlega negatywnej regulacji przez czynnik transkrypcyjny MoMsn2. Mutant MoAa91 tworzył niedojrzałe komórki adherentne na sztucznie indukowanym interfejsie, a mutanty z delecją genów znacznie zmniejszały patogeniczność.

Dalsze badania wykazały, że MoAa91 jest wydzielany do przestrzeni egzosomalnej, gdzie wiąże się z chityną i oligosacharydami chityny, konkurując z receptorem immunologicznym ryżu CEBiP, co skutkuje zahamowaniem odpowiedzi immunologicznej roślin indukowanej chityną [81]. Białko ZtGT2 z patogenu pszenicy Zymoseptoria tritici ma za zadanie utrzymywanie najbardziej zewnętrznej powierzchni ściany komórkowej grzyba, pomagając w rozbudowie strzępek na powierzchniach stałych. Jest szeroko rozpowszechniony u grzybów, a jego utrata spowodowała utratę zjadliwości patogenu na powierzchni żywiciela, wynikającą z upośledzenia ekspansji strzępek. Mutacja w ortologu ZtGT2 w patogennym grzybie Fusarium graminearum spowodowała konstytutywną zwiększoną ekspresję kilku transbłon i wydzielanych białek, w tym ważnej domeny LysM Zt3LysM, efektora wirulencji wiążącej chitynę z domeną LysM. Chociaż adhezja do powierzchni liści była niezmieniona u pokrewnych mutantów F. graminearum, poważne upośledzenie wzrostu strzępek u mutantów spowodowało podobną utratę patogeniczności u tego taksonomicznie niespokrewnionego grzyba na kłosach pszenicy [82].

Mycosphaerella graminicola powodująca chorobę plamistości Septoria tritici pszenicy przenosi efektory Mg1LysM i Mg3LysM, które są homologami białka efektorowego zewnątrzkomórkowego białka 6 (Ecp6) z biotroficznego grzyba pleśniowego patogenu Cladosporium fulvum. Wcześniejsze prace wykazały, że te grzybicze efektory mogą wiązać chitynę, co z kolei chroni strzępki grzyba przed chitynazami pochodzenia roślinnego, prawdopodobnie pomagając patogenowi uniknąć odpowiedzi immunologicznej gospodarza aktywowanej przez receptory chitynowe CERK1 i CEBiP [76,77]. Białko strukturalne LysM Magnaporthe grisea wydzielające białko efektorowe, wydzielane białko LysM 1 (SLP1) i efektor LysM Rhizoctonia solani (RsLysM) hamują odporność wyzwalaną chityną poprzez wiązanie chityny, ale nie mogą chronić strzępek przed hydrolizą [76,77, 83]. Badanie 18 przypuszczalnych białek LysM w Penicillium spp. stwierdzili, że poziomy ekspresji PeLysM1, PeLysM2, PeLysM3 i PeLysM4 były znacząco zwiększone podczas infekcji patogenem, ale nie wpłynęły na wirulencję grzybów. Udowodniono również, że PeLysM3 reguluje kiełkowanie i tempo wzrostu zarodników [84].

Jednak grzybicze LysM nie zawsze są zaangażowane tylko w manipulowanie odpornością roślin, co powoduje szkodliwe skutki dla żywiciela. Wydzielany efektor LysM zidentyfikowany z modelowego gatunku grzyba mikoryzy arbuskularnej (AM) Rhizophagus nieregularny (RiSLM) jest jednym z białek efektorowych o najwyższej ekspresji w grzybni wewnątrzkorzeniowej podczas symbiozy z żywicielem Medicago truncatula. Eksperymenty wiązania in vitro wykazały, że RiSLM wiąże się z oligosacharydami chityny, chroniąc ściany komórkowe grzybów przed chitynazą. Ponadto RiSLM może skutecznie zakłócać odpowiedź immunologiczną wyzwalaną przez chitynę w celu obalenia odporności wyzwalanej chityną podczas symbiozy, co wskazuje na wspólną rolę efektorów LysM zarówno u grzybów symbiotycznych, jak i patogennych w pewnym momencie ewolucji [85, {{2} }]. Z podobnej notatki, korzystny grzyb Trichoderma viride wykorzystuje efektory, takie jak Tal6, które sekwestrują oligomery GlcNAc, zakłócając w ten sposób percepcję pochodzącej z grzybów N-acetyloglukozaminy przez maszynerię nadzorującą roślinę, co prowadzi do ochrony strzępek grzybów przed chitynazami żywiciela [87].

N-glikozylacja jako modyfikacja potranskrypcyjna jest typowym mechanizmem efektorów szeroko stosowanym przez patogeny grzybowe do modulowania ich zdolności do unikania odporności gospodarza [88]. N-glikozylacja Slp1 za pośrednictwem Alg{3}} jest wymagana dla stabilności białka i powinowactwa chityny. N-glikozylacja za pomocą Slp1 jest wymagana do uniknięcia wrodzonej odporności gospodarza [88]. ChELP1 i ChELP2 również są N-glikozylowane [79]. Badania te sugerują, że N-glikozylacja jest niezbędna i jest powszechną modyfikacją grzybowych efektorów LysM w celu osiągnięcia ultrawysokiego powinowactwa chityny [88]. Identyfikacja i porównanie na dużą skalę białek N-glikozylacji na różnych etapach rozwoju biologicznego patogennego grzyba Magnaporthe oryzae wykazało, że zidentyfikowano 559 miejsc N-glikozylacji 355 białek; większość z nich bierze udział w różnych procesach rozwoju biologicznego, takich jak grzybnia, konidia oraz przyczepianie i różnicowanie komórek [89].

4. LysM blokuje manipulację odpowiedziami odpornościowymi między roślinami a patogenami

Obecny pogląd na indukowalne reakcje obronne w interakcjach roślina-patogen jest dobrze ujęty w tak zwanym modelu zygzakowatym. W tym modelu pierwsza indukowana obrona jest aktywowana przez PRR, a PRR to receptory powierzchniowe komórki, które rozpoznają MAMP [90]. Ta odpowiedź obronna obejmuje miejscowe wzmocnienie ściany komórkowej, wytwarzanie reaktywnych form tlenu oraz wytwarzanie i uwalnianie związków przeciwdrobnoustrojowych, które razem zapobiegają większości inwazji drobnoustrojów [1,3,7,90]. Kiedy patogeny skutecznie pokonują mechanizmy obronne żywiciela za pomocą wydzielanych efektorów, ustala się podatność wyzwalana przez efektory, która jest kluczowym elementem modelu zygzakowatego [1]. Białka LysM, ważne elementy obecne zarówno w roślinach, jak i grzybach, powinny odgrywać ważną rolę w wzajemnej modulacji odporności między roślinami a patogenami.

Podczas interakcji grzyb-roślina, kiedy grzyby przebijają się przez pierwszą barierę rośliny i atakują powierzchnię żywiciela, roślinne białka LysM działają jako PRR, rozpoznając chitynę i indukując odporność. Roślina wykorzystuje wydzielniczą chitynazę do hydrolizy ściany komórkowej grzyba w celu uwolnienia wolnej oligochityny. Następnie sygnały obronne są przekazywane przez kinazę cytoplazmatyczną LysM w dół, wyzwalając odpowiedź immunologiczną rośliny w celu powstrzymania proliferacji grzybów. I odwrotnie, grzyby wydzielają białka LysM w celu stłumienia odporności indukowanej chityną. Białka LysM drobnoustrojów chronią ścianę komórkową grzybów przed hydrolizą, wiążąc się z najbardziej zewnętrzną powierzchnią lub konkurując z roślinnymi receptorami LysM o wiązanie fragmentów chityny i ostatecznie pokonując odporność roślin, aby ułatwić infekcję grzybiczą.

W ten sposób białka LysM łączą manipulację odpornością między roślinami a patogenami. Zostało to dobrze wykazane w Verticillium spp. W bawełnie kilka białek LysM ma pewien wpływ na odporność bawełny na werticillium, w tym Gh-LYK1, Gh-LYK2 i GhLYK5 [58], poprzez ich zdolność wiązania chityny. U V. dahliae wpływ LysM z Vd2 przyczynia się do zjadliwości patogenu i wiąże chitynę w celu stłumienia wywołanych chityną odpowiedzi immunologicznych, chroniąc w ten sposób strzępki grzybów przed hydrolizą przez enzymy hydrolityczne rośliny [91]. Patogeny nie tylko wykorzystują efektory LysM do blokowania odporności roślin poprzez interakcję z polimerem chityny w celu ochrony grzybni, ponieważ Verticillium alfalfa wydziela również białko wiążące chitynę Verticillium nonalfalfae (VnaChtBP) zawierające domenę motywu wiążącego węglowodany 18 (CBM18), która oddziałuje z polimer chityny [92]. Ponadto niedawne badania nad V. dahliae wykazały, że delecja genu deacetylazy polisacharydowej (VdPDA1) poważnie wpłynęła na patogenność V. dahliae [93]. VdPDA1 ma silną aktywność deacetylazy oligomeru chityny na rozpuszczalnych oligosacharydach chityny w środowisku alkalicznym. Dalsze badania wykazały, że deacetylowane oligosacharydy chitynowe utrudniają rozpoznawanie receptorów LysM, prowadząc do blokowania przekazywania sygnałów immunologicznych wrażliwych na chitynę w przestrzeni wewnątrzkomórkowej, co tłumi odpowiedź immunologiczną gospodarza podczas gospodarza-V. interakcja dalii [93]. Dlatego grzyby chorobotwórcze mogą blokować sygnalizację chitynową poprzez (1) wydzielanie efektorów ciała pozakomórkowego o wysokim powinowactwie do oligomerów chityny, (2) wydzielanie efektorów, które konkurują z chityną o wiązanie z roślinnymi kinazami receptora LysM, (3) deacetylację chityny w celu uniknięcia odpowiedzi immunologicznej

5. Wnioski i perspektywy przyszłych badań

Koewolucyjny wyścig zbrojeń między grzybami a roślinami skutkuje odpowiedzią obronną roślin na grzybową chitynę poprzez manipulację odpornością między roślinami a patogenami. Grzyby, które odniosły sukces, wyewoluowały białka efektorowe LysM, które zakłócają odpowiedzi immunologiczne roślin, w których pośredniczy LysM, co ostatecznie prowadzi do podatności roślin. Z kolei rośliny wyewoluowały receptory LysM, aby stymulować reakcje obronne. Uważa się, że kiedy grzyby ewoluują w celu wytworzenia nowych efektorów LysM lub zakłócania odporności gospodarza w inny sposób, rośliny będą również reagować nowymi receptorami LysM, aby utrzymać odporność roślin.

Daleko od zrozumienia białek LysM w roślinach i grzybach, priorytetowe kwestie, które będą napędzać badania w najbliższej przyszłości, obejmują: (1) obecne zrozumienie grzybowych efektorów LysM i ich mechanizmów hamujących w roślinnej sygnalizacji chitynowej wymaga dalszego postępu, w tym pojawiających się rola innych grzybiczych efektorów zaangażowanych w wzajemną modulację odporności zarówno przez gospodarza, jak i patogen lub odkrycie nieznanych roślinnych receptorów LysM itp.; (2) identyfikacja różnych/wspólnych cech białek LysM roślin i grzybów oraz ich ewolucyjnych powiązań (ułatwiłoby to zrozumienie koewolucji tego, w jaki sposób LysM łączy manipulację odpornością między roślinami a patogenami); (3) z wyjątkiem funkcji manipulacji odpornością podczas interakcji roślina-grzyb, jakie są inne funkcje białek LysM, zwłaszcza u grzybów (oprócz członków zaangażowanych w manipulację odpornością, funkcje biologiczne niektórych innych członków białek LysM są nadal niejasny); oraz (4) grzybowe białka LysM działają jako efektory, chroniąc ścianę komórkową przed hydrolizą przez chitynazy roślinne i manipulując odpornością podczas interakcji roślina-grzyb. Jednak rola białek LysM w symbiozie AM również wymaga dalszych badań, aby ułatwić wykorzystanie korzystnych mikroorganizmów dla zdrowia roślin i zapewnić trwałe bezpieczeństwo żywnościowe.

Autorskie Wkłady:

X.-YY i X.-FD wymyślili temat artykułu. S.-PH napisał oryginalny projekt. W przygotowaniu i recenzji manuskryptu uczestniczyli J.-JL, J.-PL i WJ. ND i J.-YC zapewnili pomoc przy redagowaniu. Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu.

Finansowanie:

Ta praca była wspierana przez granty z chińskiego Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju (2018YFE0112500), Elite Youth Program (Chińska Akademia Nauk Rolniczych, CAAS) dla J.-YC, grant z programu innowacji w dziedzinie nauk rolniczych i technologii dla X. -FD oraz grant Chińskiej Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (32001845) dla WJ

Oświadczenie instytucjonalnej komisji rewizyjnej:

Nie dotyczy.

Oświadczenie o świadomej zgodzie:

Nie dotyczy.

Oświadczenie o dostępności danych:

Nie dotyczy.

Podziękowanie:

Z góry przepraszamy wszystkich badaczy, których badań nie można było odpowiednio zacytować ze względu na ograniczenia miejsca. Szczególne podziękowania kierujemy do Krishny V. Subbarao (University of California, Davis) za pomocne sugestie.

Konflikt interesów:

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Bibliografia

1. Zipfel, C. Receptory rozpoznawania wzorców roślin. Trendy Immunol. 2014, 35, 345–351. [Odnośnik]

2. Nürnberger, T.; Kemmerling, B. Receptorowe kinazy białkowe – receptory rozpoznawania wzorców w odporności roślin. Trendy Plant Sci. 2006, 11, 519–522. [Odnośnik]

3. Lu, Y.; Tsuda, K. Intymne powiązanie sygnalizacji za pośrednictwem PRR i NLR w odporności roślin. Mol. Interakcja mikroorganizmów roślinnych. 2021, 34, 3–14. [Odnośnik]

4. Li, B.; Lu, D.; Shan, L. Ubikwitynacja receptorów rozpoznawania wzorców we wrodzonej odporności roślin. Mol. Patol roślinny. 2014, 15, 737–746. [Odnośnik]

5. Chisholm, ST; Coaker, G.; Dzień, B.; Staskawicz, BJ Interakcje żywiciel-drobnoustroj: kształtowanie ewolucji odpowiedzi immunologicznej roślin. Komórka 2006, 124, 803–814. [CrossRef] [PubMed]

6. Yu, X.; Feng, B.; On, P.; Shan, L. Od chaosu do harmonii: odpowiedzi i sygnalizacja po rozpoznaniu wzorca drobnoustrojów. rok Wielebny Fitopatol. 2017, 55, 109–137. [CrossRef] [PubMed]

7. Newman, MA; Sundelin, T.; Nielsen, JT; Erbs, G. MAMP (wzór molekularny związany z drobnoustrojami) wyzwalał odporność u roślin. Przód. Nauka o roślinach. 2013, 4, 139. [CrossRef] [PubMed]

8. Cui, H.; Tsuda, K.; Parker, J. Odporność wyzwalana efektorem: od percepcji patogenu do solidnej obrony. rok ks. Plant Biol. 2015, 66, 487–511. [Odnośnik]

9. Dubey, M.; Vélëz, H.; Broberg, M.; Jensen, DF; Karlsson, M. Clonostachys rosea LysM białka regulują rozwój grzybów i przyczyniają się do ochrony strzępek i cech biokontroli. Przód. Mikrobiol. 2020, 11, 679. [CrossRef] [PubMed]

10. Buist, G.; Steen, A.; Kok, J.; Kuipers, OP LysM, szeroko rozpowszechniony motyw białkowy do wiązania z (peptydowymi) glikanami. Mol. Mikrobiol. 2008, 68, 838–847. [Odnośnik]

11. Dworkin, J. Wykrywanie węglowodanów grzybów i bakterii: czy podobne struktury chityny i peptydoglikanu odgrywają rolę w dysfunkcji układu odpornościowego? Patog PLoS. 2018, 14, e1007271. [CrossRef] [PubMed]

12. Oi, V.; Vuong, T.; Hardy, R.; Reidler, J.; Zwisać, J.; Herzenberg, L.; Stryer, L. Sekwencja nukleotydowa genów 14 i 15 faga Bacillus phi 29: Homologia genu 15 z innymi lizozymami faga. Kwasy nukleinowe Res. 1986, 14, 10001–10008.

13. De Wit, PJ; Mehrabi R.; Van den Burg, Hawaje; Stergiopoulos, I. Białka efektorowe grzybów: przeszłość, teraźniejszość i przyszłość. Mol. Patol roślinny. 2009, 10, 735–747. [CrossRef] [PubMed]

14. Zhang, XC; Działo, SB; Stacey, G. Ewolucyjna genomika genów LysM w roślinach lądowych. BMC Evol. Biol. 2009, 9, 183. [Odsyłacz]

15. Zhang, XC; Działo, SB; Stacey, G. Molekularna ewolucja kinaz podobnych do receptorów typu motywu lizyny w roślinach. Fizjol Roślinny. 2007, 144, 623–636. [Odnośnik]

16. Miya, A.; Albert, P.; Shinya, T.; Desaki, Y.; Ichimura, K.; Shirasu, K.; Narusaka, Y.; Kawakami, N.; Kaku, H.; Shibuya, N. CERK1, kinaza receptora LysM, jest niezbędna do sygnalizacji elicytora chityny u Arabidopsis. proc. Natl. Acad. nauka Stany Zjednoczone 2007, 104, 19613–19618. [Odnośnik]

17. Shimizu, T.; Nakano, T.; Takamizawa, D.; Desaki, Y.; Ishii-Minami, N.; Nishizawa, Y.; Minami, E.; Okada, K.; Yamane, H.; Kaku, H.; i in. Dwie cząsteczki receptora LysM, CEBiP i OsCERK1, wspólnie regulują sygnalizację elicytora chityny w ryżu. Zakład J. 2010, 64, 204–214. [Odnośnik]

18. Wan, J.; Zhang, XC; Neece, D.; Ramonell, KM; Clough, S.; Kim, Sy; Stacey, MG; Stacey, G. Kinaza podobna do receptora LysM odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji chitynowej i odporności na grzyby u Arabidopsis. Komórka roślinna 2008, 20, 471–481. [Odnośnik]

19. Iizasa, E.; Mitsutomi, M.; Nagano, Y. Bezpośrednie wiązanie roślinnej kinazy podobnej do receptora LysM, LysM RLK1/CERK1, z chityną in vitro. J. Biol. chemia 2010, 285, 2996–3004. [CrossRef] [PubMed]

20. Brotman, Y.; Landau, U.; Pnini, S.; Lisec, J.; Balazadeh, S.; Mueller-Roeber, B.; Zilberstein, A.; Willmitzer, L.; Chet, I.; Viterbo, A. Kinaza podobna do receptora LysM LysM RLK1 jest wymagana do aktywacji reakcji obronnych i odpowiedzi na stres abiotyczny wywołanych nadekspresją chitynaz grzybowych w roślinach Arabidopsis. Mol. Zakład 2012, 5, 1113–1124. [Odnośnik]

21. Chen, L.; Hamada, S.; Fujiwara, M.; Zhu, T.; Thao, NP; Wong, HL; Kryszna, P.; Ueda, T.; Kawasaki, T.; Shimamoto, K. Kompleks opiekuńczy Hop/Sti1-Hsp90 ułatwia dojrzewanie i transport receptora PAMP we wrodzonej odporności ryżu. Cell Host Microbe 2010, 7, 185–196. [CrossRef] [PubMed]

22. Akamatsu, A.; Wong, HL; Fujiwara, M.; Okuda, J.; Nishida, K.; Uno, K.; Imai, K.; Umemura, K.; Kawano, Y.; Shimamoto, K. Moduł OsCEBiP/OsCERK1-OsRacGEF{2}}OsRac1 jest istotnym wczesnym elementem odporności ryżu indukowanej chityną. Cell Host Microbe 2013, 13, 465–476. [Odnośnik]

23. Shinya, T.; Yamaguchi, K.; Desaki, Y.; Yamada, K.; Narisawa, T.; Kobayashi, Y.; Maeda, K.; Suzuki, M.; Tanimoto, T.; Takeda, J. Selektywna regulacja odpowiedzi obronnej indukowanej chityną przez kinazę cytoplazmatyczną podobną do receptora Arabidopsis PBL27. Zakład J. 2014, 79, 56–66. [CrossRef] [PubMed]

24. Yamaguchi, K.; Yamada, K.; Ishikawa, K.; Yoshimura, S.; Hayashi, N.; Uchihashi, K.; Ishihama, N.; Kishi-Kaboshi, M.; Takahashi, A.; Tsuge, S. Kinaza cytoplazmatyczna podobna do receptora, na którą skierowany jest efektor patogenu roślinnego, jest bezpośrednio fosforylowana przez receptor chitynowy i pośredniczy w odporności na ryż. Cell Host Microbe 2013, 13, 347–357. [Odnośnik]

For more information:1950477648nn@gmail.com