Makroautofagia i mitofagia w zaburzeniach neurodegeneracyjnych: skupienie się na interwencjach terapeutycznych, część 2

3.1.2. Mitofagia w AD

Nagromadzenie uszkodzonych mitochondriów jest cechą charakterystyczną AD. Dysfunkcje mitochondriów i związane z nimi deficyty bioenergetyczne oraz stres oksydacyjny przyczyniają się do agregacji A i hiperfosforylacji tau [154,155], które z kolei są mediatorami defektów mitochondrialnych [156].

Mitochondria są uważane za fabryki energii w komórkach, a uszkodzone mitochondria mogą powodować szereg problemów zdrowotnych, w tym utratę pamięci. Ale są też pozytywne aspekty. Pod warunkiem podjęcia odpowiednich działań możemy skutecznie poprawić stan mitochondriów i poprawić naszą pamięć.

Główną funkcją mitochondriów jest wytwarzanie energii, która może zaspokoić różnorodne potrzeby komórek. Jednak w niektórych przypadkach mitochondria mogą zostać uszkodzone, co skutkuje zmniejszoną produkcją energii, co może prowadzić do problemów zdrowotnych, takich jak utrata pamięci. Ponadto mitochondria mogą również powodować stany zapalne, co dodatkowo wpływa na zdrowie fizyczne.

Jednak w kontekście rozwoju współczesnej medycyny możemy zastosować pewne metody, które pomogą mitochondriom przywrócić zdrowie. Na przykład ćwiczenia aerobowe, zbilansowana dieta i ćwiczenia fizyczne mogą sprzyjać zdrowiu mitochondriów, poprawiając w ten sposób naszą pamięć. Ponadto niektóre naturalne pokarmy, takie jak naturalne zioła i orzechy, również mają dobre działanie naprawcze i ochronne dla mitochondriów, aby utrzymać normalny stan organizmu.

Krótko mówiąc, chociaż uszkodzenie mitochondriów może powodować problemy zdrowotne, powinniśmy w dalszym ciągu aktywnie poszukiwać różnych sposobów na poprawę zdrowia mitochondriów, aby lepiej zachować zdrowie fizyczne i inteligencję. Widać, że musimy poprawić pamięć, a Cistanche może znacznie poprawić pamięć, ponieważ Cistanche to tradycyjny chiński materiał leczniczy o wielu unikalnych efektach, z których jednym jest poprawa pamięci. Działanie Cistanche wynika z różnych zawartych w nim składników aktywnych, w tym kwasu garbnikowego, polisacharydów, glikozydów flawonoidowych itp. Składniki te mogą na różne sposoby promować zdrowie mózgu.

Kliknij Poznaj pamięć krótkotrwałą, jak ją ulepszyć

W związku z tym peptydy A nie były toksyczne dla komórek bez funkcjonalnych mitochondriów (komórki zubożone w mitochondrialne DNA) [157]. Ekspozycja neuronów kory pierwotnej na peptydy A1-42 indukuje otwarcie porów przejściowych w błonie mitochondrialnej [156].

Co więcej, jednoczesna ekspozycja neuronów korowych na aktywację NMDAR za pośrednictwem A i NMDA dodatkowo indukuje depolaryzację mitochondriów i zwiększoną retencję wapnia w mitochondriach [158]. Dodatkowo końcówki synaptyczne narażone na agregaty A wykazywały dysfunkcję mitochondriów, wyższy poziom stresu oksydacyjnego oraz upośledzony transport glutaminianu i glukozy [159].

Co więcej, próbki tkanki mózgowej myszy z mutacją tau wykazywały mitochondrialne defekty oddechowe i wyższą produkcję RFT [160]. Nagromadzenie N-końcowego fragmentu tau zostało powiązane ze zmniejszoną aktywnością mitochondrialnej oksydazy cytochromu c w mózgach ludzkich chorych na AD [161].

Co więcej, niedobór ATP spowodowany defektami mitochondriów aktywuje AMPK, a w konsekwencji autofagię [162], łącząc funkcję mitochondriów z regulacją autofagii.

Usuwanie niezdrowych mitochondriów w wyniku mitofagii jest upośledzone w AD, chociaż mechanizm nie jest w pełni scharakteryzowany. Poprzednie badania z wykorzystaniem pośmiertnych tkanek hipokampa pacjentów z AD i neuronów pochodzących z AD iPSC wykazały niższy poziom białek związanych z mitofagią, niższy poziom PINK1 i BNIP3L/NIX oraz inaktywację białek inicjujących mitofagię, takich jak fosfo-ULK1 [163].

Upośledzenie mitofagii opisano także w modelach APP i nadekspresji tau [164]. Rola wadliwej mitofagii w patogenezie AD została dodatkowo potwierdzona przez poprawę pamięci w mysich modelach APP/PS1 po skorygowaniu mitofagii neuronalnej [163]. Badania na modelach AD wykazały, że insercja tau do błony mitochondrialnej znosi mitofagię zależną od Parkinsona [165].

Co więcej, nadekspresja komórek leczonych mitofaginą A z przywróconą parkinem i poprawa funkcji mitochondriów [166]. Pomimo zwiększonej translokacji parkiny do mitochondriów, obecność niestrawionych mitochondriów w lizosomach wskazuje na słabą wydajność lizosomalną w AD we wczesnych stadiach [167].

Poziomy białek biorących udział w rozszczepieniu mitochondriów, etapie niezbędnym do izolowania uszkodzonych mitochondriów przed ich pochłonięciem przez autofagosom, są podwyższone w mózgach AD [168].

Konsekwentnie, w AD zaobserwowano zmienioną morfologię mitochondriów w kierunku fragmentacji, która nasila się, gdy wzrasta poziom A i p-tau, a białka te oddziałują z białkiem związanym z rozszczepieniem Drp1 [169].

Upośledzenie ruchu postępowego przyczynia się do dysfunkcji mitochondriów wykazywanej w neuronach z transgenicznych modeli AD [170]. Wadliwy ruch postępowy upośledza fuzję starych mitochondriów z nowo utworzonymi organellami w somie, hamując w ten sposób ich naprawę za pośrednictwem fuzji. ​​Ponadto wadliwy ruch wsteczny opisany w AD [129] ogranicza usuwanie wadliwych mitochondriów w somie przez autofagię.

Obniżone poziomy SIRT1 opisane w AD upośledzają również aktywację białek autofagii, stabilizację inmitochondriów PINK1 i regulację receptorów mitofagii Nix/BNIP3L i LC3 [171].

Co więcej, w chorobie Alzheimera zmniejsza się poziom mitochondrialnego SIRT3, co skutkuje słabszą aktywacją p62 za pośrednictwem FOXO3- [172]. W AD odnotowano obniżone wewnątrzkomórkowe poziomy NAD+ [173], a wyczerpanie poziomów NAD+ może również zmniejszyć aktywność sirtuin.

Zatem obniżony poziom i aktywność SIRT może upośledzać mitofagię, prowadząc do akumulacji uszkodzonych mitochondriów w chorobie Alzheimera.

3.2. Choroba Parkinsona

PD jest chorobą neurodegeneracyjną wynikającą ze zwyrodnieniowej utraty neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej pars Compacta (SNpc), co prowadzi do niedoboru dopaminy [174].

Typowymi cechami tej choroby są niestabilność postawy, bradykinezja i chód, którym często towarzyszy hiposmia i wyraźne powikłania żołądkowo-jelitowe w postaci gastroparezy i zaparć [175].

Cechą histopatologiczną PD jest obecność agregatów włóknistych zwanych ciałami Lewy’ego (LB), których głównym składnikiem jest –synukleina (aSyn) [176]. aSyn jest natywnie rozwiniętym białkiem o wielu przypisanych funkcjach w rozwoju neuronów i sygnalizacji synaptycznej [177].

Jednak niektóre badania wskazują, że brak aSyn typu dzikiego (WT) nie ma znaczenia dla podstawowej funkcji neuronów [178], co sugeruje, że utrata funkcji aSyn nie powoduje PD. Pomimo intensywnej debaty oligomery aSyn są toksyczne dla komórek neuronowych [179].

3.2.1. Autofagia w PD

Autofagię po raz pierwszy powiązano z chorobą Parkinsona, gdy Anglade i wsp. odkryli, że śmierć neuronów dopaminergicznych w SNpc w mózgach pacjentów z chorobą Parkinsona pośmiertnie była powiązana z deregulacją autofagiczną [180].

Monomeryczny aSyn jest białkiem krótkotrwałym i dlatego jego fizjologiczny poziom jest utrzymywany głównie przez układ ubikwityna-proteasom (UPS) [181]. Jednakże w przypadku wewnątrzkomórkowego przeciążenia aSyn, usuwanie natywnego aSyn przez UPS staje się niewystarczające, co przesuwa eliminację monomerów aSyn na szlak autofagosom-lizosom (ALP) [182].

Co ciekawe, badanie z udziałem myszy, którym wstrzyknięto ludzki adenowirus aSyn do istoty czarnej, wykazało, że poziom wielu białek autofagicznych ulega zwiększeniu w początkowej fazie choroby, co sugeruje wzrost autofagii na tym etapie [183]. Jednakże badania pośmiertne wskazują na wzrost poziomu LC3 II i spadek katepsyny D, co wskazuje na upośledzenie funkcji szlaku ALP [121].

Co więcej, wyniki badań histologicznych pokazują, że LC3 II jest często zlokalizowany we wtrąceniach aSyn [184], co implikuje nie tylko wadliwy proces autofagiczny, ale także, że makroautofagia jest odpowiedzialna za usuwanie agregatów aSyn [185].

CMA jest silnie upośledzona w PD, ponieważ w mózgach pacjentów z PD obserwuje się zmniejszoną ekspresję LAMP2a i Hsc70 [121,186]. Co ciekawe, pozostałe pęcherzyki dodatnie pod względem LAMP2a znajdowały się w pobliżu . Obserwacje te są zgodne z faktem, że aSyn zawiera pentapeptyd podobny do KFERQ, 95VKKDQ99, o silnej specyficzności wobec pęcherzyków lizosomalnych [187,188].

W oligomerach aSyn ten pentapeptyd jest nadal dostępny i umożliwia agregatom wiązanie się z receptorami lizosomalnymi, blokując import aSyn do lizosomu, co częściowo wyjaśnia defekty obserwowane w CMA komórek neuronalnych w PD [185]. Dalsze badania wykazały, że modyfikacje potranslacyjne w aSyn również utrudniają szlak CMA i przyczyniają się do ogólnej toksyczności komórkowej [189].

Rzeczywiście, specyficzne hamowanie CMA osiągnięte przez obniżenie poziomu LAMP2a wydaje się być odpowiedzialne za zwiększone poziomy natywnej aSyn w neuronach korowych szczura [190]. Dodatkowo zmniejszenie ekspresji LAMP2a w obwodzie nigrostriatalnym szczurów prowadzi do śmierci komórek dopaminergicznych, czemu towarzyszy wzrost poziomu białka aSyn i wzrost ekspresji LC3 [191].

Zatem CMA wydaje się być niezwykle istotnym szlakiem degradacji aSyn WT. Glukocerebrozydaza (GBA) jest białkiem lizosomalnym odpowiedzialnym za rozszczepianie glukocerebrozydu i glukozylosfingozyny w świetle tych pęcherzyków.

Niedobór GBA prowadzi do akumulacji substratu w lizosomie, co ma szkodliwy wpływ na szlak endolizosomalny. Co ciekawe, heterozygotyczne mutacje w locus GBA są uważane za główny czynnik ryzyka rozwoju PD [192]. U homozygotycznych mutantów GBA rozwija się choroba Gauchera, w wyniku której u dużej części rozwija się parkinsonizm [193].

Związek pomiędzy patologiami GBA i aSyn stwierdzono u pacjentów z zaburzeniami z ciałami Lewy’ego, czyli spektrum chorób z alternatywnymi postaciami parkinsonizmu. U tych pacjentów obecność wtrętów aSyn była silnie skorelowana z obecnością zmutowanego GBA w SNpc mózgów pośmiertnych [194].

Co ciekawe, w neuronach dopaminergicznych pochodzących z iPSC heterozygotycznych pacjentów z GBA PD, wykazujących zmniejszoną aktywność GBA, stwierdzono wzrost liczby i powiększenie lizosomów [195], któremu towarzyszył zwiększony poziom oligomerów aSyn w neuronach pochodzących z PD, w porównaniu z komórkami kontrolnymi .

Co więcej, knockdown GBA w prążkowiu szczura doprowadził do akumulacji oligomerycznego aSyn, poprzedzonej zakłóceniem szlaku autofagicznego. Beclin-1 może pośredniczyć w działaniu GBA, ponieważ jego aktywność ulega obniżeniu wraz ze spadkiem aktywności GBA, z jednoczesnym zmniejszeniem LC3 II [196].

Kinaza powtórzeniowa 2 bogata w leucynę (LRRK2) jest powiązana z formą autosomalnej dominującej postaci choroby Parkinsona, która jest również głównym czynnikiem ryzyka idiopatycznej choroby Parkinsona. Oprócz wielu funkcji komórkowych, LRRK2 odgrywa znaczącą rolę w autofagii, biorąc udział w kilku odrębnych fazach tego procesu [197].

Badanie z wykorzystaniem zależnego od wieku modelu myszy typu knock-in LRRK2 wykazało, że neurony śródmózgowia miały większą liczbę pęcherzyków LAMP2a-dodatnich w porównaniu z myszami WT [197], co sugeruje gromadzenie się pęcherzyków lizosomalnych. Wzrost ten był związany z gorszą wydajnością CMA, ponieważ klirens specyficznych dla lizosomów substratów z motywem KFERQ był niższy w komórkach śródmózgowia z nokautem LRRK2.

Jest to zgodne z dowodami wykazującymi, że LRRK2 reguluje aktywność podzbioru GTPaz Rab, które są odpowiedzialne za mobilizację błon, składanie pęcherzyków i transport [198,199]. G2019S jest najczęstszą mutacją w chorobie Parkinsona związanej z LRRK2-ChP i Uważa się, że zmutowany LRRK2 zatrzymuje proces autofagiczny.

Na przykład zróżnicowane komórki neuronalne SH-SY5Y wyrażające tę zmutowaną formę LRRK2 wykazywały znacznie mniejsze neuryty i nieprawidłową akumulację pęcherzyków LC3 [200]. Co więcej, u myszy niosących mutanta G2019S LRRK2 nastąpił wzrost wczesnych i późnych pęcherzyków autofagicznych, co miało szkodliwy wpływ na liczbę neuronów posiadających hydroksylazę tyrozynową (TH) i na morfologię neuronów kory mózgowej [201].

Obserwacje te można potwierdzić faktem, że uważa się, że aktywność LRRK2 wpływa na makroautofagię poprzez Beclin-1 na szlaku niezależnym od mTOR [202]. Ponieważ wyższą ekspresję natywnej aSyn uważa się za czynnik ryzyka rozwoju idiopatycznej PD [203 ], makroautofagia odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu obfitości dowolnej komórki.

Co ciekawe, odkrycia pokazują, że ekspresja zmutowanych form aSyn lub nadekspresja WT aSyn blokuje autofagię [204], nadając kluczową rolę w tym procesie w postępie choroby. Potwierdzając te obserwacje, Vogiatzi i współpracownicy odkryli, że WT aSyn wzrosła 1,5- do 3,8-krotnie w komórkach PC12 po podaniu 3-metyladeniny (3-MA), inhibitor makroautofagii [190].

Dodatkowo, wysianie włókienek aSyn powoduje powstanie odpornych na degradację wtrąceń aSyn, z negatywnym skutkiem w makroautofagii. Komórki zawierające agregaty aSyn wykazują nagromadzenie autofagosomów [205], co można wytłumaczyć faktem, że wtrącenia aSyn promują błędną lokalizację mATG9, białka, które ułatwia transport błonowy w celu fagoforeformacji [204].

Niedawno zaobserwowano, że ekspresja A30P aSyn w pierwotnych hodowlach neuronów dopaminergicznych śródmózgowia zatrzymuje przepływ autofagiczny, obserwowany przez zmniejszenie białka LC3 związanego z autofagosomem przy jednoczesnym wzroście poziomów SQSTM1/p62 [206].

Co więcej, w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej pochodzących od pacjentów z PD stwierdzono, że białka autofagiczne, takie jak ULK1 i Beclin1, są rozregulowane, co koreluje z akumulacją [207]. Samoodnawiający się charakter autofagii jest niezbędny dla patofizjologii PD, a niemożność recyklingu źle sfałdowanych lub zagregowane białka mają głęboki wpływ na komórki nerwowe [61].

Dlatego badania sugerują, że upośledzona autofagia może być czynnikiem etiologicznym patogenezy PD. Na przykład specyficzna ablacja ATG7, niezbędna do autofagosomu elongacji w neuronach dopaminergicznych starszych myszy, indukuje charakterystyczne cechy PD, takie jak słabość motoryczna, utrata neuronów TH-dodatnich i odkładanie się aSyn [208].

Co więcej, wyczerpanie się ATG7 prowadzi do obecności wtrąceń aSyn zawierających p62- w neuronach dopaminergicznych SNpc i znacznego wzrostu liczby poliubikwitynowanych substratów [209]. Chociaż defekty autofagii mają charakter przekrojowy w stosunku do modeli PD, związek przyczynowości wymaga dalszego zbadania.

3.2.2. Mitofagia w PD

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w patogenezie PD [210]. Niewydolność mitochondrialna, w tym zmniejszona aktywność kompleksu I, dobrze opisana w badaniach pośmiertnych mózgów pacjentów z idiopatyczną chorobą Parkinsona [211,212], wraz ze zwiększonym stresem oksydacyjnym w neuronach nigrostriatalnych [213] i niższą zdolnością mitochondriów do buforowania Ca2+ [214] , są dobrze znanymi cechami procesu neurodegeneracyjnego w chorobie Parkinsona, co podkreśla ogromne znaczenie usuwania uszkodzonych mitochondriów w chorych neuronach. Opisano, że oligomery aSyn powodują uszkodzenia mitochondriów.

Rzeczywiście, zarówno WT, jak i zmutowana aSyn są importowane do mitochondriów w liniach komórkowych [215], hodowanych neuronach dopaminergicznych i mózgach pacjentów z chorobą Parkinsona [216]. Jednakże A53T aSyn ma szybsze tempo akumulacji w mitochondriach, upośledzając aktywność kompleksu I i powodując zaostrzenie produkcji ROS [217]. Co więcej, badanie z wykorzystaniem dopaminergicznych hodowli neuronów wykazało, że agregaty aSyn zachowujące pSer129 aSyn wiążą się preferencyjnie z mitochondriami, a nie z WT aSyn, co prowadzi do upośledzenia fosforylacji oksydacyjnej [218].

Rzeczywiście, zmutowany aSyn stymuluje fragmentację mitochondriów i promuje obecność kardiolipiny na powierzchni mitochondriów [219]. Kardiolipina jest sygnałem zagrożenia wywoływanym przez mitochondria, które łączą się z LC3 w celu zainicjowania mitofagii [220].

Co ciekawe, aSyn może wiązać się z kardiolipiną, konkurując w ten sposób z LC3 i zatrzymując mitofagię [219]. Dynamiczna interakcja między Parkinem i PINK1 pozwala na prawidłową identyfikację uszkodzonych mitochondriów.

Co zaskakujące, mutacje w genach Parkin i PINK1 są odpowiedzialne za autosomalne recesywne postacie choroby Parkinsona o wczesnym początku [221]. W mózgach tych pacjentów z PD znaleziono patologiczne dowody, takie jak zmniejszona populacja neuronów w SNpc i glioza włóknista [222]. W PD aktywność Parkina zwiększa funkcję Drp1, aby promować rozszczepienie mitochondriów, i zmniejsza funkcję Mfn1/2, aby zapobiec fuzji, w wyniku czego powstają mniejsze mitochondria, które łatwiej jest pochłonąć w fagoforach [223].

Co ciekawe, zmutowane formy parkiny nie lokalizują się w mitochondriach po uszkodzeniu depolaryzacyjnym, co prowadzi do zahamowania mitofagii [224]. Co więcej, białka zlokalizowane w OMM, które regulują zdarzenia apoptotyczne, takie jak Bcl-XL i Mcl-1, hamują rekrutację Parkina do mitochondriów, blokując mitofagię [225].

Dodatkowo liczba p62-dodatnich mitochondriów podatnych na selektywną degradację jest zmniejszona w komórkach wykazujących ekspresję zmutowanej parkiny [226], co może mieć miejsce w wyniku sekwestracji parkiny do nierozpuszczalnych agregatów [227]. Myszy transgeniczne bez choroby Parkinsona wykazują wzrost poziomu pSer129 aSyn, ale nie całkowitego poziomu aSyn [228]. Taka ablacja może powodować łagodne defekty nigrostriatalne [229], związane ze zmienioną morfologią mitochondriów [230].

Odkrycia te można wyjaśnić zdolnością Parkina do modulowania stanu fosforylacji aSyn w Ser129 [231]. Wykazano, że zmutowane formy PINK1 związane z chorobą Parkinsona nie rekrutują dokładnie Parkina do mitochondriów, co skutkuje dysfunkcyjną mitofagią [232]. Dodatkowo ablacja PINK1 prowadzi do wzrostu liczby pofragmentowanych mitochondriów [233], co jest częstą cechą neuronów dopaminergicznych pacjentów z ChP [234].

Chociaż wyczerpanie PINK1 nie ma wpływu na liczbę neuronów dopaminergicznych, neurony prążkowia myszy PINK1-/- wykazują zmniejszoną zdolność do uwalniania dopaminy [235] i są bardziej podatne na egzogenne stresory, takie jak stres oksydacyjny [236].

Obserwacjom tym towarzyszy niższa częstość oddychania u zmutowanych zwierząt i zmniejszona aktywność kompleksu mitochondrialnego I [237], co może wyjaśniać udział tej mutacji w PD. Co zaskakujące, sam niedobór Parkina lub PINK1 nie wywołuje jawnej degeneracji neuronów u gryzoni, co sugeruje, że mogą mieć miejsce inne niezależne procesy mitofagiczne1-Parkina/PINK [228].

Znaczenie dysfunkcji mitochondriów, a co za tym idzie mitofagii, podkreśla fakt, że kilka toksyn mitochondrialnych, w tym 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna (MPTP) i rotenon, często naśladują dysfunkcję molekularną w PD i są wykorzystywane jako modele idiopatycznej PD [238]. Toksyny te atakują mitochondria, hamując kompleks I, cechę zwykle obserwowaną w mózgach pacjentów z chorobą Parkinsona pośmiertnych [212].

MPTP indukuje parkinsonizm poprzez promowanie neurodegeneracji dopaminergicznej i akumulację aSyn [239]. MPTP to związek lipofilowy, który może przenikać przez barierę krew-mózg (BBB), a w astrocytach przekształca się w postać jonową 1-metylo4-fenylopirydyniową (MPP+) [240]. Ta aktywna forma (MPP+) służy jako substrat o wysokim powinowactwie dla transporterów dopaminergicznych przedostających się do komórek neuronowych [241], hamując kompleks mitochondrialny I i w konsekwencji zmniejszając częstość oddychania [239], a także inne efekty cytotoksyczne.

Rzeczywiście, leczenie MPP+ w pierwotnych neuronach dopaminergicznych szczura i komórkach SH-SY5Y sprzyja fragmentacji mitochondriów zależnej od Drp1- [242]. Ponadto w komórkach zróżnicowanych dopaminergicznie PC12 uszkodzeniu mitochondriów wywołanemu MPP+- towarzyszy dramatyczne zmniejszenie szybkości transportu aksonalnego, po którym następuje wyraźny proces neurodegeneracyjny [243].

Podobnie rotenon, inny silny inhibitor kompleksu I, może naśladować fenotypowe cechy choroby Parkinsona. Po wstrzyknięciu myszom rotenon stymuluje selektywną śmierć neuronów dopaminergicznych wraz z pojawieniem się agregatów aSyn i dysfunkcją motoryczną [244]. Ponadto podawanie rotenonu zakłóca przepływ autofagiczny, co objawia się wzrostem LC3 i p62 oraz obniżonym poziomem LAMP2a, zatrzymując selektywną degradację mitochondriów [244].

Warto zauważyć, że rotenon ma poważny wpływ na sieć mikrotubul [245], upośledzając przepływ autofagiczny u szczurów [244] i zmieniając tempo ruchu mitochondriów w neurytach zróżnicowanych komórek SH-SY5Y [246]. Ponieważ mitofagia w dużym stopniu zależy od transportu zależnego od mikrotubul [247], oczekuje się, że mitofagia zostanie upośledzona po ekspozycji na rotenon.

For more information:1950477648nn@gmail.com