Aktywacja makrofagów przez cukry o niskiej masie cząsteczkowej z Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstract］

Aby zbadać efekt aktywacji immunologicznej i mechanizm sacharydów o niskiej masie cząsteczkowej z:Cistanche deserticola(LMSC) na mysich makrofagach otrzewnowych, RAW264. 7 komórek. RAW264. 7 komórek podzielono na normalną grupę kontrolną, grupę kontroli pozytywnej LPS i grupy leczone LMSC. RAW264. 7 komórek potraktowano różnymi stężeniami LMSC od 3,91 do 62,5 g·L － 1. Do wykrywania fagocytarnej aktywności makrofagów zastosowano oznaczenie czerwieni obojętnej. Uwalnianie NO wykryto przy użyciu zestawu NO i poziomów ekspresji białek związanych z aktywacją makrofagów (TNF- , IL-6, IKK , p-IKK , IκB , p-IκB , NF-κB i p-NF-κB) zostały wykryte metodą Western blot. Wyniki wykazały, że LMSC ma wpływ aktywacyjny na makrofagi; może znacznie zwiększyć uwalnianie NO w RAW264. 7 komórek i promują ekspresję cytokin TNF- i IL-6. Ponadto LMSC istotnie zwiększyła fosforylację IKK , IκB i NF-κB p65. Co więcej, jeden z głównych składników LMSC, mannitol, znacznie zwiększył aktywność fagocytarną makrofagów. Wyniki te pokazały, że LMSC może aktywować makrofagi poprzez regulację w górę ścieżki sygnalizacyjnej NF-κB, a mannitol może być jednym z głównych aktywnych składników LMSC．

［Słowa kluczowe］ Sacharydy o niskiej masie cząsteczkowej; Cistanche deserticola; aktywacja immunologiczna; makrofag; czynnik zapalny; NF-κB

Cistanche deserticola YC Mato roślina należąca do rodzajuCistanche deserticolaYC Ma. Jego mięsista łodyga może być używana jako lekarstwo. Pełni funkcje odżywiania yang nerek, odżywiania esencji i krwi oraz nawilżania jelit. Jest znany jako „pustynny żeń-szeń”. Składniki chemiczne Cistanche obejmują glikozydy fenyloetanowe, glikozydy irydoidalne, cukry, lignany i wiele innych. Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że Cistanche ma wiele aktywności biologicznych, takich jak neuroprotekcja, działanie przeciwnowotworowe, regulacja odporności, działanie przeciwzapalne i przeciwutleniające [1]. Badania wykazały, że wywar z Cistanche i polisacharydów może znacząco poprawić zdolność fagocytarną i funkcję wydzielniczą makrofagów [2-3]. Jednak nie ma raportu na temat badań aktywności węglowodanów o niskiej masie cząsteczkowej. Dlatego w tym badaniu wykorzystano system hodowli in vitro RAW264. 7 mysich makrofagów otrzewnowych w celu zbadania aktywności immunomodulacyjnej i powiązanych mechanizmów węglowodanów o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche. Badania te mogą dostarczyć więcej dowodów eksperymentalnych dla kompleksowego zrozumieniaEfekt immunomodulujący Cistanchew przyszłości, aby dalej kierować jego zastosowaniem klinicznym.

Cistanche deserticola ma wiele efektów, kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

1. Materiały

RAW264. 7 komórek zakupiono z Centrum Komórkowego Chińskiej Akademii Nauk Medycznych; płodową surowicę bydlęcą (FBS) zakupiono z PAN Biotech, Niemcy; antybiotyki i podłoże DMEM zakupiono w Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Lipopolisacharyd z Escherichia coli O55:B5 (LPS) zakupiono w Sigma Company, USA. Zestaw tlenku azotu (NO) zakupiono w Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering. Zestaw do chemiluminescencji ECL zakupiono w Thermo Fisher, USA; przeciwciało zakupiono z Cell Signaling Technology, USA; Całkowite glikozydy Cistanche cistanche, cukry niskocząsteczkowe cistanche oraz polisacharydy cistanche zostały wyprodukowane samodzielnie przez naszą grupę badawczą. Udział masowy glikozydów cistanche ogółem wynosił 78,76 procent. Udział masowy cukrów o niskiej masie cząsteczkowejCistanche deserticolawynosi 58. 00 procent i ułamek masowyCistanche deserticolapolisacharydów jest 65,24 proc. Tanon-5200System podziału obrazowania wielożelowego został zakupiony od Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Czytnik mikropłytek Sunrise-Basic został zakupiony w firmie TECAN.

2. Metoda

2. 1 Metoda neutralnej czerwieni do pomiaru aktywności fagocytarnej makrofagów

Weź mysie makrofagi otrzewnowe w fazie wzrostu logarytmicznego, po trypsynizacji, policz komórki, dostosuj liczbę komórek do 5 × 104 komórek/ml i zaszczep je na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej, 100 μl/dołek , w 37°C Hodowano w warunkach 5% CO2, po tym jak komórki przylgnęły do ​​ściany, odrzucić supernatant hodowli, dodać pożywkę DMEM (10% FBS plus 1 procent P/S), LPS (1 mg·L － 1) i Cistanche cistanche odpowiednio Glikozydy całkowite,CistancheCałkowite polisacharydy i cukry o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche cistanche (odpowiednio 3,91 ~ 62,5 g·L -1, przefiltrowane przez filtr membranowy przed podaniem) były hodowane. Po hodowaniu przez 48 godzin dodać 100 µl 0,075% roztworu soli fizjologicznej o obojętnej czerwieni do każdego dołka, kontynuować hodowlę przez 4 godziny, odessać supernatant, przemyć 3 razy PBS, dodać lizat komórkowy (lodowaty kwas octowy -etanol 1:1) 100 μl, umieść w 4 stopniach na 2 godziny i zmierz absorbancję (A540 nm) po lizie komórek.

2. 2 Wykrywanie ilości uwalnianego NO w supernatancie komórkowym

Zaszczepić RAW264. 7 komórek na płytce 48-dołkowej (1 × 105 komórek/ml, 500 μl/dołek), zaaspirować pożywkę do hodowli komórkowej po całonocnej inkubacji, dodać pożywkę DMEM (10 procent FBS plus 1 procent P/S), 500 μL każdego z LPS (1 mg·L -1) i całkowitych glikozydów Cistanche cistanche, całkowitych polisacharydów i cukrów o niskiej masie cząsteczkowej (odpowiednio 3,91 ~ 62,5 g·L -1). Po 24 godzinach hodowli indukcyjnej zebrano supernatant. Określ stężenie NO w supernatancie komórkowym każdej grupy za pomocą zestawu NO, postępuj zgodnie z instrukcjami, a na koniec wykryj absorbancję (A570 nm) za pomocą czytnika mikropłytek

2. 3. Western blot

Zaszczepić RAW264. 7 komórek na płytce 6-dołkowej, zaaspirować pożywkę do hodowli komórkowej po całonocnej inkubacji, dodać pożywkę DMEM (10 procent FBS plus 1 procent P/S), LPS (1 mg·L － 1) iCistanchewszystkie polisacharydy i cukry o niskiej masie cząsteczkowej (3,91 ~ 62,5 g·L -1) były po 2 ml, a supernatant odrzucono po 24 godzinach hodowli indukcyjnej. Komórki przemyto dwukrotnie PBS i odrzucono. Po trypsynizacji komórki są pipetowane. Odwirować, usunąć supernatant, dodać 100 µl NP40 Lysis Buffer i poddać lizie na lodzie przez 40 min. Po odwirowaniu pobrano supernatant i oznaczono stężenie białka metodą BCA, a stężenie białka każdego histonu wyrównano równomiernie. Weź taką samą ilość próbek białka i rozdziel je na 12% SDS-PAGE pod stałym ciśnieniem. Następnie za pomocą zbiornika do elektroforezy transferowej Bio-Rad przenieś membranę stałym prądem 350 mA przez 1 godzinę i przenieś białko na membranę PVDF (wstępna obróbka membrany PVDF: namocz w metanolu i zrównoważ buforem transferowym). Po zablokowaniu za pomocą 5 procent odtłuszczonego mleka (skonfigurowanego z TBST zawierającym 0,1 procent Tween-20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, membranę przemyto 3 razy TBST i membranę inkubowano w rozcieńczalniku pierwotnego przeciwciała białkowego w temperaturze 4 stopień w nocy. Membranę płukano 3 razy TBST co drugi dzień i dodawano odpowiedni rozcieńczalnik w celu inkubacji przez 1 godzinę. Membranę płukano 3 razy TBST, a paski rozwijano za pomocą wywoływacza chemiluminescencji ECL.

2. 4 analiza danych

Dane wyrażono jako x ± s, a istotność różnicy testowano przy użyciu oprogramowania statystycznego GraphPad Prism 6 do jednokierunkowej analizy wariancji. Weź P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Wyniki

3. 1. Wpływ cukrów niskocząsteczkowych, glikozydów ogółem i polisacharydów Cistanche cistanche na aktywność fagocytarną RAW264. 7 komórek

Badania nad chemicznymi składnikami Cistanche pokazują, żeCistanchezawiera głównieglikozydy fenyloetanoidowe, glikozydy irydoidalne i węglowodany. W tym doświadczeniu wybrano całkowite glikozydy cistanche (w tym glikozydy alkoholu fenetylowego i glikozydy irydoidowe), cukry niskocząsteczkowe i cukry. Trzy miejsca aktywne wszystkich polisacharydów zbadano pod kątem ich wpływu na aktywację RAW264. 7 komórek. Zarówno polisacharyd Cistanche cistanche, jak i cukier o niskiej masie cząsteczkowej cistanche mogą znacznie zwiększyć aktywność fagocytarną RAW264. 7 komórek, ale aktywność fagocytarna całej grupy, której podawano glikozydy, nie zmienia się znacząco. Ponadto lek kontroli pozytywnej LPS również znacząco poprawił aktywność fagocytarną RAW264. 7 komórek, jak pokazano na Rysunku 1. Powyższe wyniki sugerują, że cukry i polisacharydy o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche mogą mieć wpływ na aktywację RAW264. 7 komórek.

3. 2. Wpływ glikozydów całkowitych, cukrów niskocząsteczkowych i polisacharydów całkowitych Cistanche na zawartość tlenku azotu (NO) w supernatancie komórkowym

W celu dalszego zbadania efektu aktywacji trzech aktywnych miejsc Cistanche na RAW264. 7 komórek oznaczono zawartość NO w supernatantach komórkowych stymulowanych różnymi lekami. Wyniki wykazały, że uwalnianie NO w grupie LPS było znacznie wyższe niż w ślepej grupie kontrolnej (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchenie miał znaczącego wpływu. Powyższe wyniki wskazują, że zarówno polisacharydy, jak i cukry o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche mogą sprzyjać uwalnianiu NO z RAW264. 7 komórek. Wśród nich szczególnie istotny jest wpływ niskocząsteczkowych cukrów Cistanche, co pokazano na rysunku 2.

3. 3. Wpływ cukru niskocząsteczkowego Cistanche cistanche na ekspresję białka TNF- i IL-6 w RAW264. 7 komórek

TNF- jest ważnym mediatorem zapalnym, który pojawia się w procesie aktywacji RAW264. 7 komórek, które mogą promować syntezę i uwalnianie innych cytokin (takich jak IL-6). Wyniki wykazały, że ekspresja TNF- i IL-6 została znacznie zwiększona po stymulacji niskocząsteczkowego cukru Cistanche cistanche, co sugeruje, że niskocząsteczkowy cukier Cistanche może promować ekspresję TNF - i IL-6 w RAW264. 7 komórek, aktywując w ten sposób odporność komórkową Fagocytoza, patrz Ryc. 3.

3. 4. Regulacyjny wpływ cukru niskocząsteczkowego Cistanche cistanche na szlak sygnałowy IKK /IκB /NF-κB

W celu zbadania potencjalnego mechanizmu aktywacji cukrów niskocząsteczkowych Cistanche cistanche w aktywacji RAW264. 7 komórek, autorzy zbadali jego wpływ regulacyjny na klasyczny szlak sygnałowy IKK /IκB /NF-κB. Cukier o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche cistanche może znacząco zwiększyć fosforylację NF-κB i fosforylację jego kluczowych białek sygnałowych IKK i IκB oraz zmniejszyć ekspresję całkowitego białka IκB, co wskazuje, że ma działanie aktywujące na IKK/ szlak sygnałowy IκB/NF-κB. Podobny efekt regulacyjny ma również lek kontroli pozytywnej LPS. Podsumowując, cukry o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche mogą aktywować szlak sygnałowy IKK /IκB /NF-κB, powodując w ten sposób syntezę i uwalnianie cytokin, takich jak TNF- i IL-6, a w końcu wywołując układ odpornościowy. aktywacja RAW264. 7 komórek, patrz rysunek 4.

3. 5. Badanie przesiewowe składników aktywnych o działaniu aktywującym makrofagi w cukrach niskocząsteczkowych Cistanche

Nasze laboratorium przeanalizowało cukry niskocząsteczkowe zawarte wCistanchewe wczesnym stadium i stwierdził, że zawiera głównie mannitol (16,53 procent), sacharozę (8,34 procent), fruktozę (25,38 procent) i glukozę (7,75 procent) oraz inne składniki. Dlatego autor użył metody neutralnej czerwieni, aby zbadać efekt aktywacji powyższych składników na makrofagi. Mannitol może znacząco zwiększać aktywność fagocytarną makrofagów w sposób zależny od dawki, podczas gdy działanie innych składników nie jest znaczące. Sugeruje to, że mannitol może być jednym z kluczowych składników aktywnych cukrów o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche cistanche w celu aktywacji makrofagów, jak pokazano na rycinie 5.

4. Dyskusja

Cistanche cistanche, pasożytnicza roślina z rodziny Lydanaceae, ma działanie immunomodulujące, dlatego powinna zawierać substancje immunomodulujące. W tym eksperymencie autor przeprowadził badanie przesiewowe aktywności fagocytarnej mysich makrofagów otrzewnowych na różnych oczyszczonych częściachCistanchei odkryli, że cukry i polisacharydy Cistanche o niskiej masie cząsteczkowej mają wpływ na aktywację makrofagów, ale całkowite glikozydy Cistanche nie są oczywiste. Jednocześnie autor stwierdził, że cukry o niskiej masie cząsteczkowej mogą aktywować makrofagi w niższych stężeniach, więc autorzy wybraliCistanchecukry niskocząsteczkowe jako przedmiot dalszych badań.

Badając wpływ cukru cistanche o niskiej masie cząsteczkowej na ekspresję cytokin TNF- i IL-6, autorzy stwierdzili, że cukier cistanche o niskiej masie cząsteczkowej znacząco zwiększał ekspresję TNF- i IL-6, co dodatkowo udowodnił, że cukier cistanche o niskiej masie cząsteczkowej ma wpływ na myszy. Makrofagi otrzewnowe mają działanie aktywujące. Dlatego autor dalej badał jego potencjalny mechanizm działania. Przeprowadź badania

Wykazano, że bakteryjny lipopolisacharyd (LPS) może indukować aktywację mysich makrofagów i mysich komórek glejowych poprzez szlaki sygnałowe, takie jak JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK i MAPK [4-8]. Szlak NF-κB jest uznawany za szlak klasyczny, dlatego w tym eksperymencie przetestowano białka sygnałowe na tym szlaku. Wyniki wykazały, że cukry o niskiej masie cząsteczkowej Cistanche mogą znacznie zwiększyć fosforylację NF-κB i fosforylację kluczowych białek sygnałowych IKK i IκB , co sugeruje, że cukry o niskiej masie cząsteczkowejCistanchemoże aktywować mysie giganty otrzewnowe poprzez szlak sygnałowy IKK /IκB /NF-κB. Komórki fagowe uwalniają cytokiny zapalne, a następnie odgrywają rolę w aktywacji odporności komórkowej.

We wczesnym etapie laboratorium, skład chemiczny niskocząsteczkowego ekstraktu cukrowego zCistanche deserticolabył systematycznie analizowany. Stwierdzono, że cukry o niskiej masie cząsteczkowej zawierają głównie monomery, takie jak mannitol, sacharoza, fruktoza i glukoza. Dalsze badania wykazały, że mannitol może znacznie poprawić aktywność fagocytarną makrofagów. Dlatego spekuluje się, że mannitol może być kluczowym składnikiem cukrów o niskiej masie cząsteczkowej, który aktywuje komórkową funkcję odpornościową.

Podsumowując, w badaniu tym wykorzystano makrofagi w systemie hodowli Vitro i stwierdzono, że cukry o niskiej masie cząsteczkowejCistanchemają znaczący wpływ aktywujący na makrofagi i mogą aktywować mysie makrofagi otrzewnowe poprzez szlak sygnałowy NF-κB, a następnie odgrywać pewną rolę. Mannitol zawarty w cukrach o niskiej masie cząsteczkowej może odgrywać ważną rolę w aktywacji fagocytarnej aktywności makrofagów.

Bibliografia

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Techniki uprawy pustyni Cistanche i jej gospodarza Tamarix [M]. Pekin: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Przegląd badań farmakologicznych skutkówCistanche deserticolapolisacharyd [J]. Żywność i leki, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan i in. Aktywacja makrofagów polisacharydu Cistanche [J]. Chiński Biuletyn Farmakologiczny, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Aktywność biologiczna i mechanizm lipopolisacharydu bakteryjnego [J]. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao i in. LPS poprzez szlak p38/MAPK i aktywacja NF-κB indukuje ekspresję HIF-1 w RAW264. 7 komórek [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen i in. Szlak sygnałowy JAK2/STAT3 jest zaangażowany w aktywację mikrogleju［J］ indukowaną przez lipopoli-cukry. Zeszyt III Wojskowego Uniwersytetu Medycznego, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Glikozydy Mulbascum hamują indukowane lipopolisacharydami zapalenie mikrogleju BV-2 i jego mechanizm [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 41(13): 2506.