MikroRNA kształtują odporność społeczną: potencjalny cel biologicznej kontroli termita Reticulitermes Chinensis

Abstrakcyjny

Owady eusocjalne mogą wykorzystywać różne behawioralne i fizjologiczne mechanizmy obronne przed chorobami, aby unikać, opierać się i tolerować infekcje patogenami w swoich blisko spokrewnionych i skupionych koloniach, co nazywa się odpornością społeczną. Niedawne badania wykazały, że odporność społeczną owadów zapewnia kilka cząsteczek, w tym zapachy chemiczne, jady owadów, białka związane z odpornością itp. Jednak czy i w jaki sposób mikroRNA (miRNA), których prekursory są przetwarzane przez Dicer-1, stymulują społeczne odporność w koloniach owadów jest nadal nieznana. Tutaj zastosowaliśmy system „gospodarz – patogen” (gospodarz: Reticulitermes chinensis; patogen: Metarhizium anisopliae), aby zbadać wpływ miRNA na odporność społeczną w koloniach termitów. Odkryliśmy, że wyciszanie Dicer-1 za pośrednictwem RNAi prowadzi do zmniejszenia stężenia miRNA, znacząco hamuje metabolizm węglowodanów i energii oraz wpływa na inne procesy życiowe, takie jak odpowiedź immunologiczna i reakcje utleniania i redukcji, w całym ciele termita . W obronie behawioralnej wyciszenie Dicera-1 znacząco osłabiło obronne zachowania społeczne, takie jak poruszanie się, pielęgnacja, kanibalizm i zakopywanie w grupach termitów w przypadku napotkania skażenia grzybiczego. W obronie fizjologicznej wyciszenie Dicer-1 i stymulacja miR- 71-5 spowodowały znaczne zmniejszenie aktywności przeciwgrzybiczej termitów. Co więcej, zarówno grupy termitów wyciszonych Dicer, jak i grupy termitów leczonych stymulantem miR-71-5 wykazywały wysoki poziom śmiertelności podczas skażenia grzybami. Nasze odkrycia wykazały ważną rolę miRNA w kształtowaniu odporności społecznej w koloniach termitów, dostarczając informacji niezbędnych do zrozumienia potencjalnych mechanizmów leżących u podstaw behawioralnej i fizjologicznej obrony przed chorobami u owadów, a tym samym kładąc podwaliny pod zwalczanie szkodników w oparciu o miRNA.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Słowa kluczowe Owady eusocial · Grzyby entomopatogenne · Obrona przed chorobami · Dicer-1 · miR-71-5

Kluczowa wiadomość

• Ekspresja genów za pośrednictwem miRNA związana ze społecznymi układami odpornościowymi.

• miRNA wpływają na obronę przed chorobami behawioralnymi w grupach termitów.

• miRNA wpłynęły na fizjologiczną obronę przed chorobami u termitów.

• Termicydy na bazie miRNA można uznać za nowe sposoby biologicznego zwalczania szkodników.

Wstęp

Termity to szkodniki o znaczeniu gospodarczym, które kosztują na całym świecie 30 miliardów dolarów i powodują globalne szkody w uprawach, drzewach, konstrukcjach drewnianych i materiałach celulozowych. Chemiczne pestycydy stanowią skuteczną metodę zwalczania szkodników termitów, ale stwarzają również poważne problemy, zagrażając zdrowiu ludzkiemu i środowisku. Kontrola biologiczna jest cenną alternatywą, która może rozwiązać te problemy. Kilka entomopatogenów, takich jak Metarhizium i Beauveria, zostało z powodzeniem zastosowanych do biologicznego zwalczania szkodników, co jest rozsądne i skuteczne (Verma et al. 2009; Kumar i Upadhyay 2021). Jednakże kontrola biologiczna termitów jest niezadowalająca, głównie ze względu na wyjątkową ochronę przed chorobami w koloniach termitów. Termity, będące owadami eusocjalnymi, wyewoluowały zbiorowe mechanizmy obronne behawioralne i indywidualne fizjologiczne, aby przeciwdziałać wysokiemu ryzyku rozprzestrzeniania się zakaźnych patogenów wśród blisko spokrewnionych współlokatorów (tzw. „odporność społeczna”) (Van Meyel i in. 2018; Liu i in. 2019a). Dobrze udokumentowano, że termity wykorzystują szeroki repertuar mechanizmów obronnych behawioralnych: unikanie jest pierwszą linią obrony i pomaga zapobiegać przedostawaniu się termitów na zanieczyszczone obszary (Yanagawa i in. 2015); zachowanie alarmowe objawia się szybkim, wzdłużnym ruchem oscylacyjnym, mającym na celu ostrzeżenie współlokatorów o obecności patogenów (Rosengaus i in. 1999); pielęgnacja współlokatorów skażonych patogenami może skutecznie usunąć patogeny ze skórek współlokatorów (Liu i in. 2019b); grzebanie i zachowania kanibalistyczne ograniczają przenoszenie patogenów ze zwłok na podatnych współlokatorów (Sun et al. 2016). Odpowiedzi fizjologiczne, takie jak odpowiedź immunologiczna i reakcje utleniania i redukcji, również służą obronie przed chorobami termitów. Odpowiedzi immunologiczne obejmują humoralne peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) oraz fagocytozę i enkapsulację za pośrednictwem odporności komórkowej, które są w stanie hamować replikację i rozprzestrzenianie się patogenów w jamie ciała owada (Hussain i in. 2013; Liu i in. 2015; Lopez-Uribe i wsp. 2016; Hong i wsp. 2018). Reakcje utleniania i redukcji łagodzą szkody powodowane przez toksyny i reaktywne formy tlenu (ROS) podczas infekcji patogenami, przyczyniając się do tolerancji na owady (Liu i in. 2015; Zhao i in. 2020; Zhou i in. 2021). Ponadto wcześniejsze badania nad mechanizmami obronnymi przed chorobami termitów wykazały, że niektóre symbionty jelitowe stanowią ważny element obrony fizjologicznej żywiciela (Rosengaus i in. 2014). Niektóre AMP można stosować jako zewnętrzne środki dezynfekujące na powierzchni naskórka i w materiałach gniazd, w połączeniu z zachowaniami takimi jak pielęgnacja i zagnieżdżanie (Bulmer i in. 2009; Hamilton i Bulmer 2012). Dlatego osłabienie behawioralnej i fizjologicznej obrony termitów może być kluczowym krokiem w celu wzmocnienia efektu biokontroli termitów.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Kliknij tutaj, aby wyświetlić produkty Cistanche Enhance Immunity

【Zapytaj o więcej】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikacja Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Coraz liczniejsze badania wskazują na molekularne podłoże odporności społecznej. Kilka cząsteczek, w tym zapachy chemiczne, wydzieliny zewnętrzne, antybiotyki, białka odpornościowe i chemoreceptory służące obronie behawioralnej i fizjologicznej owadów, zostało zidentyfikowanych za pomocą wielu technik omikowych i chromatografii gazowo-cieczowej ze spektrometrią mas (Seipke i in. 2011; Hussain i in. 2013; Terrapon i in. 2014; Liu i in. 2015; Sun i in. 2016; He i in. 2018). W grupach termitów stęchły zapach patogenów powoduje wzmożenie zachowań związanych z pielęgnacją (Yanagawa i in. 2011). Sygnały śmierci pochodzące ze zwłok termitów wywołują kanibalizm lub zachowania pochówkowe (Sun et al. 2016). Zewnętrzne wydzieliny gruczołów czołowych i ślinowych oraz korzystne działanie przeciwbakteryjne za pośrednictwem korzystnych mikroorganizmów pomagają termitom chronić siebie, współlokatorów, a nawet kolonie (Bulmer i in. 2009; Rosengaus i in. 2000, 2014; Chouvenc i in. 2013). W przypadku mechanizmów genetycznych i biochemicznych warunkujących odporność społeczną owadów można zastosować technologie RNAi i edycji genów. Wykazano, że u termitów wyciszanie za pośrednictwem RNAi terminicyny, gram-ujemnego białka wiążącego 2 (GNBP2), białka wiążącego selen i transglutaminazy (TG) znacząco zmniejsza aktywność przeciwgrzybiczą termitów, a tym samym zwiększa śmiertelność infekcji (Hamilton oraz Bulmer 2012; Zhao i in. 2020; Zhou i in. 2021). Dehydrogenaza izocytrynianowa (IDH) może wpływać na metabolizm termitów, a jej rozregulowanie powoduje zwiększone zmiany apoptotyczne, prowadząc do wysokiego poziomu infekcji i śmiertelności (Liu i in. 2020). Ponadto GNBP2 i TG służą również obronie behawioralnej termitów, wpływając odpowiednio na zachowania kanibalistyczne i pielęgnacyjne (Zhao et al. 2020; Esparza-Mora et al. 2020). Jednakże molekularne podstawy odporności społecznej nie zostały jeszcze jasno poznane, zwłaszcza molekularny mechanizm kierujący skomplikowanymi zachowaniami społecznymi w reakcji na zakaźne patogeny. Co więcej, genetyczny i biochemiczny mechanizm odporności społecznej koncentruje się na kodującym RNA napędzającym odporność społeczną owadów, ale nadal nie jest jasne, czy niekodujące RNA, takie jak miRNA, biorą udział w regulacji odporności społecznej owadów.

Dicer-1, endonukleaza RNazy III, jest niezbędna na ostatnim etapie biosyntezy miRNA. miRNA to endogenne, 18–25 nt, niekodujące RNA, które negatywnie regulują ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym poprzez parowanie zasad pomiędzy regionem nasion w miRNA a dopasowanym regionem w docelowym mRNA (Gomez-Orte i Belles 2009; Wang i in. 2013; Yang i wsp. 2014; Lucas i wsp. 2015). Ponieważ produkcja miRNA zależy od Dicer-1, funkcje miRNA w modulowaniu procesów biologicznych owadów można badać poprzez straty funkcjonalne Dicer-1. Dzięki zastosowaniu mutantów Dicer-1 muszek owocowych udowodniono, że miRNA działają w embriogenezie i morfogenezie neuronów węchowych (Lee i in. 2004; Berdnik i in. 2008). Wyciszając Dicer-1 za pośrednictwem RNAi, badacze sprawdzili, że miRNA odgrywają kluczową rolę w regulowaniu procesów rozwojowych podczas metamorfozy owadów, takich jak karaluchy i szarańcza (Gomez-Orte i in. 2009; Wang i in. 2013). Co więcej, miRNA biorą również udział w modulowaniu zachowań owadów. miR-8 i miR-429 regulują wywołane wirusem zachowanie wspinaczkowe u robaków bawełnianych poprzez bezpośrednią kontrolę ekspresji BrZ2 (Zhang i in. 2018). miR-133 reguluje syntezę dopaminy, a tym samym hamuje agregację behawioralną u szarańczy (Yang et al. 2014). W oparciu o takie dowody dotyczące funkcji miRNA w fizjologii i zachowaniu owadów, chcieliśmy określić wpływ miRNA na fizjologię i zachowanie termitów związane z odpornością społeczną, stosując układ „żywiciel–patogen” (gospodarz: Reticulitermes chinensis; patogen: Metarhizium anisoplia). Nasze badanie obejmowało głównie trzy aspekty badań nad odpornością społeczną: wpływ miRNA na (1) cząsteczki in vivo odpowiedzialne za odporność społeczną; (2) behawioralna reakcja obronna, taka jak poruszanie się na obszarach skażonych grzybami, pielęgnacja w stosunku do współlokatorów skażonych grzybami i kanibalizm/pochówek w stosunku do zwłok skażonych grzybami; oraz (3) fizjologiczną reakcję obronną, taką jak działanie przeciwgrzybicze. Ponadto przetestowaliśmy wpływ rozregulowania miRNA na śmiertelność termitów skażonych grzybami, aby ocenić wpływ miRNA na kontrolę biologiczną termitów. Nasze badanie ujawniło potencjalny mechanizm leżący u podstaw behawioralnej i fizjologicznej obrony przed chorobami oraz nowe cele w zakresie zwalczania szkodników.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Materiał i metody

Termity

Wszystkie termity eksperymentalne w naszym badaniu były pracownikami termita R. chinensis. Zebrano je na wzgórzu Shizi w Wuhan w prowincji Hubei w Chinach. Termity hodowano w plastikowych pojemnikach (40×20×20 cm) zawierających małe bloki sosnowe w laboratorium w temperaturze 25±1 stopnia, wilgotności względnej 80% i 24 godzinach ciemności.

Entomopatogeny, skażone termity i zwłoki

Entomopatogenny grzyb M. anisopliae (szczep IBCCM321.93) hodowano na agarze z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) przez 2 tygodnie w temperaturze 25±1 stopnia, wilgotności względnej 80% i 24 godzinach ciemności. Konidia grzybowe zawieszono przy użyciu 1% Tween 80 i przechowywano w temperaturze 4 stopni przez maksymalnie 3–4 tygodnie. Przed każdym doświadczeniem zawiesinę konidiów badano pod kątem kiełkowania. Ustaliliśmy, że zawiesina konidiów stosowana do skażenia termitów charakteryzowała się szybkością kiełkowania przekraczającą 90%. Aby przygotować termity skażone grzybami, odwłoki termitów skażono 0,3 µl kropelką zawiesiny konidiów (108 konidiów/ml) za pomocą pipety (0,1–2,5 µl, Transferpette). Następnie termity skażone grzybem natychmiast umieszczono w lodówce w temperaturze 4 stopni na godzinę, aby zahamować ich ruch i wytrącić konidia grzybowe na ich skórkach (Liu i in. 2015). Aby przygotować zwłoki skażone grzybami, termity zebrano w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie zamrożono w ciekłym azocie na 20 sekund w celu zabicia termitów. Zwłoki zanurzano w zawiesinie konidiów (108 konidiów/ml), a następnie umieszczano na sterylnej szalce Petriego z wilgotną bibułą filtracyjną na 0 i 2 dni hodowli (Sun et al. 2016).

Synteza dsRNA i symulatora miRNA

Fragment Dicer-1 (1697 bp; materiał uzupełniający 1-Tekst S1) amplifikowano za pomocą specyficznych starterów (do przodu: 5′-CTG CGA CAG ATC ATT GCA CG-3′; do tyłu: 5′ -CAC TGG CTG TTT TGG CAC TC-3′), a produkty ich PCR oczyszczono przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen Scientific, USA), wklonowano do wektora pMD 18-T (TaKaRa, Japonia), a następnie transformowano przy użyciu chemicznie kompetentnej komórki DH5 (Tsingke Biotechnology, Chiny). Pojedynczą kolonię z pożywki bulionowej lizogennej (LB) z ampicyliną wysłano do Tsingke Biotechnology Co. Ltd. w celu sekwencjonowania. Dopasowanie sekwencji pokazało, że naszym fragmentem był Dicer-1. Sekwencję promotora T7 (5′-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3′) dodano do końca 5′ starterów amplifikacji Dicer-1 (519 bp; do przodu: 5′ -GTG ATG CTG GAG TTG GGT TT-3′; Rewers: 5′-AGA ATG AGT CGC CCA ATG TC-3′) i GFP (467 bp; Forward: 5′-CTT GAA GTT GAC CTT GAT GCC-3′; Rewers: 5′-TGG TCC CAA TTC TCG TGG AAC- 3′) szablony dsRNA (materiał uzupełniający 1-tekst S1). Produkty PCR matryc dsRNA ekstrahowano hydroksybenzenem/chloroformem/alkoholem izoamylowym (25:24:1) (Solarbio, Chiny). dsRNA wygenerowano przy użyciu zestawu do transkrypcji T7 RNAi (Vazyme Biotech, Chiny), a następnie oczyszczono za pomocą hydroksybenzenu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (50:49:1) (Solarbio). Na koniec oceniano dsRNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) i przechowywano w temperaturze 80°C.

Symulantem miR-71-5 był mały dwuniciowy RNA zaprojektowany zgodnie z sekwencją miR-71-5 (21 nt, materiał dodatkowy 1-Tekst S1). Matryca symulanta miR-71-5 składała się z dwóch dwuniciowych DNA zawierających promotor T7: jeden został wygenerowany przez oligonukleotyd A1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A -3′) i oligonukleotyd A2 (5′-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) przy użyciu touchdown PCR; drugi został wygenerowany przez oligonukleotyd B1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAA A-3′) i oligonukleotyd B2 (5′-TTT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) przy użyciu PCR przyziemienia. Symulator kontrolny zaprojektowano zgodnie z sekwencją GFP (19 nt, materiał uzupełniający 1-tekst S1). Matrycę płynu symulującego kontrolę pozyskały także dwa dwuniciowe DNA zawierające promotor T7: jeden został wygenerowany przez oligonukleotyd C1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT AA{{33} }′) i oligonukleotyd C2 (5′-TTA ACT TCA GGG TCA GCT TGC CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) przy użyciu touchdown PCR; drugi został wygenerowany przez oligonukleotyd D1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC AA-3′) i oligonukleotyd D2 (5′-TTG CAA GCT GAC CCT GAA GTT CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) przy użyciu PCR przyziemienia. MiR-71-5 i imitatory kontrolne wygenerowano przy użyciu zestawu transkrypcyjnego T7 RNAi, a następnie ekstrahowano mieszaniną hydroksybenzen/chloroform/alkohol izoamylowy (50:49:1). Ekstrakt oceniano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i NanoDrop 2000 i przechowywano w temperaturze -80°C.

Cistanche korzyści dla mężczyzn-wzmocnienie układu odpornościowego

Zasilanie dsRNA

Termity głodzono przez 12 godzin przed karmieniem (Zhou i in. 2008; Hamilton i Bulmer 2012). W sumie 18 termitów umieszczono na szalce Petriego z komórkami (D =35 mm) z kawałkiem bibuły filtracyjnej (D =18 mm) zwilżonej 60 µl wody wolnej od RNaz zawierającej 80 µg dsDicer-1, 80 µg dsGFP, 60 µg płynu symulującego miRNA lub 60 µg płynu symulującego kontrolę. W przypadku testów biologicznych Dicer-1 karmienia dsRNA, termity mogły połknąć zwilżony bibułkę na 24 godziny przed eksperymentami. Termity traktowane GFP uznano za kontrole. W przypadku biologicznych testów karmienia symulującym miRNA, termitom pozwolono połknąć zwilżony bibułkę na 48 godzin przed eksperymentami. Kontrolne termity poddane działaniu płynu symulującego uznano za kontrole.

RT-qPCR

Do ekspresji genów przy użyciu RT-qPCR wykorzystano pięć lub sześć replik z trzech kolonii. Trzy termity na powtórzenie na zabieg połączono w celu ekstrakcji całkowitego RNA przy użyciu zestawu Direct-zol™ RNA Miniprep Kit (Zymo Research, USA). Czystość i stężenie wyekstrahowanego RNA określono przy użyciu NanoDrop 2000. RNA przekształcono w cDNA przy użyciu zestawu odczynników PrimeScript™ RT z gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Japonia). RT-qPCR przeprowadzono za pomocą systemu QuantStudio™ 3 Real-Time PCR System (Thermo Scientific) przy użyciu ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech). Konkretne podkłady wymieniono w materiałach uzupełniających 2-Tabela S1.

stężenie miRNA

Do określenia stężenia miRNA wykorzystano sześć powtórzeń z trzech kolonii przy użyciu zestawu MiPure Cell/Tissue miRNA Kit (Vazyme Biotech, Chiny). Po trzy termity na powtórzenie na leczenie połączono w celu uzyskania miRNA. Czystość i stężenie wyekstrahowanych miRNA oznaczono za pomocą NanoDrop 2000.

Sekwencjonowanie de novo i analiza transkryptomu dla

Fifteen termites from three colonies per treatment were pooled for total RNA extraction using TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA). The concentration, quality, and integrity of the total RNA were determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific). Sequencing libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, USA) and sequenced on a HiSeq platform (Illumina) by Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. (China). Sequencing data were filtered by Cutadapt (v1.15) software. For the transcriptome sequencing project without a reference genome, Trinity (v2.5.1) software was used to montage clean reads for the transcripts for later analysis. NR (NCBI non-redundant protein sequences), GO (Gene Ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome), Egg NOG (Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups), and Swiss-Prot databases were used for gene functional annotation. Furthermore, DESeq (1.30.0) was used to analyze the differentially expressed genes under the condition of |log2FoldChange(FC)|>1 i s<0.05. The genes were then mapped to GO terms, and the terms with significant enrichment were calculated by hypergeometric distribution under the condition of p<0.05 to reveal the possible functions of the candidate genes. Additionally, the genes were mapped to KEGG pathways to determine their possible functions. 

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Lokomocja

Przeanalizowano dziewięć powtórzeń z trzech kolonii, aby porównać odległość ruchu termitów-1-wyciszonych Dicer z termitami leczonymi GFP. Po jednym dniu podawania doustnego dsDicer-1 lub dsGFP, po jednym termicie na powtórzenie na każde traktowanie umieszczono na nowej szalce Petriego z komórkami (średnica =90 mm) z kawałkiem bibuły filtracyjnej zwilżonej zawiesiną konidiów (108 konidiów/ml). Następnie za pomocą czarnego markera śledziliśmy ruch termita na przezroczystej pokrywie przez 10 sekund. Odległość ruchu mierzono za pomocą siatki papierowej (1×1 mm).

Pielęgnacja

Przeanalizowano dziewięć powtórzeń z trzech kolonii, aby porównać liczbę zachowań pielęgnacyjnych u termitów wyciszonych- 1-Dicer i termitów leczonych GFP. Po jednym dniu doustnego podawania dsDicer-1 lub dsGFP, trzy termity na powtórzenie na leczenie umieszczono na nowej szalce Petriego z komórkami (D =35 mm) z kawałkiem zwilżonej bibuły filtracyjnej (D{{ 4}} mm), a następnie zanieczyszczony konidiami grzybowymi (108 konidiów/ml). Zachowania nagrywano na wideo przez 15 minut przy użyciu aparatu cyfrowego HD (SONY, Japonia). Filmy skanowano co 10 sekund, aby zaobserwować, czy zachowania pielęgnacyjne (usta termitów w stronę ciał współtowarzyszy) występowały u termitów skażonych grzybami.

Kanibalizm

Dziewięć powtórzeń z trzech kolonii analizowano pod kątem wpływu Dicer{{0}} w porównaniu z GFP na kanibalizm w stosunku do zwłok skażonych grzybami. Sześć termitów na powtórzenie na zabieg umieszczono na szalce Petriego z komórkami (D=35 mm) z kawałkiem wilgotnej bibuły filtracyjnej (D=18 mm) zawierającej dsDicer-1 lub dsGFP. Pozwolono im na jeden dzień doustnego karmienia dsRNA, a następnie jedno skażone grzybem zwłoki inkubowane przez 0 dni umieszczono na szalce Petriego z komórkami, gdzie hodowano sześć traktowanych termitów. Po jednym dniu wspólnego odchowu zwłoki skażone grzybem zostały albo całkowicie zjedzone (wysoki wynik w teście=2), częściowo zjedzone (niski wynik w teście=1) albo niezjedzone (brak wyniku w teście{{10 }}) (Materiał uzupełniający 1-Rys. S1) przez sześć termitów.

Pogrzeb

Dziewięć powtórzeń z dwóch kolonii przeanalizowano pod kątem wpływu Dicer-1 w porównaniu z GFP na zachowanie podczas pochówku zwłok skażonych grzybami. Sześć termitów na powtórzenie na zabieg umieszczono na szalce Petriego z komórkami (D=35 mm) z kawałkiem wilgotnej bibuły filtracyjnej (D=18 mm) zawierającej dsDicer-1 lub dsGFP. Pozwolono im na jeden dzień doustnego podawania dsRNA. Następnie jedno zwłoki skażone grzybem inkubowano przez 2 dni i do szalki Petriego, na której hodowano sześć traktowanych termitów, dodano ziemię. Po jednym dniu wspólnego odchowu zwłoki skażone grzybem zostały albo całkowicie zakopane (wysoki wynik w teście=2), częściowo zasypane (niski wynik w teście=1) albo nie zakopane (brak wyniku w teście{{10 }}) (materiał dodatkowy 1-ryc. S2) przez sześć termitów.

Działanie przeciwgrzybicze

Przeanalizowano sześć powtórzeń z trzech kolonii pod kątem wpływu Dicer{{0}} i miR-71-5 na zdolność termitów do hamowania wzrostu grzybów. Połączono pięć termitów na powtórzenie na zabieg i rozdrobniono przy użyciu ciekłego azotu, a następnie rozpuszczono w 100 µl 0,9% soli fizjologicznej. Homogenat wirowano przy 6000 x g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni, aby uzyskać 80 µl supernatantu. Następnie supernatant ponownie odwirowano, uzyskując 50 µl supernatantu. Aby uzyskać działanie przeciwgrzybicze, zastosowano mikropłytkę z 96-dołkami do pomiaru absorbancji próbek, kontroli wzrostu i standardowych ślepych prób w celu obliczenia ograniczenia wzrostu grzybów: (1) 50 µl dekstrozy ziemniaczanej (PD), 2 Do próbki zmieszano µl konidiów grzybowych (108 konidiów/ml) i 5 µl supernatantu na studzienkę; (2) 50 µl dekstrozy ziemniaczanej (PD), 2 µl konidiów grzybowych (108 konidiów/ml) i 5 µl 0,9% roztworu soli na dołek zmieszano w celu kontroli wzrostu grzybów; (3) W celu uzyskania standardowej ślepej próby zmieszano 50 µl dekstrozy ziemniaczanej (PD) i 7 µl 0,9% soli fizjologicznej na dołek. Po 24 godzinach hodowli na wytrząsarce o stałej temperaturze (150 obr/min przy 25 ± 1 stopień) przeprowadzono pomiary w spektrofotometrze mikropłytkowym (600 nm; Thermo Scientific).

Przetrwanie

Aby określić wpływ doustnego karmienia dsDicer-1 na przeżycie termitów, wykorzystano termity z trzech kolonii w celu określenia przeżycia wyciszonego Dicer-1- (w sumie 42 termity, 14 termitów na kolonię) i GFP- poddane obróbce (w sumie 42 termity, 14 termitów na kolonię) termity podczas skażenia grzybami. Do kontroli wykorzystano 56 termitów z dwóch kolonii, aby określić przeżywalność wyciszonych termitów Dicer-1- (w sumie 28 termitów, 14 termitów na kolonię) i termitów traktowanych GFP (łącznie 28 termitów, 14 termitów na kolonię). Podczas przeprowadzania eksperymentów hodowano siedem termitów na szalce Petriego z komórkami (D =35 mm) z kawałkiem bibuły filtracyjnej (D =18 mm) zwilżonej wodą wolną od RNaz zawierającą dsDicer{{17} } lub dsGFP, podczas gdy termity skażono grzybami, a następnie hodowano przez dziesięć dni w celu codziennej obserwacji ich przeżycia. Aby określić wpływ doustnego karmienia symulantem miR-71-5 na przeżycie termitów, wykorzystano termity z trzech kolonii w celu określenia przeżywalności miR-71-5 (w sumie 42 termity, 14 termitów na kolonię) i kontroli ( łącznie 42 termity, 14 termitów na kolonię) termity poddane działaniu płynu symulującego podczas skażenia grzybami. Dodatkowo wykorzystano 56 termitów z dwóch kolonii, aby określić przeżywalność miR- 71-5 (w sumie 28 termitów, 14 termitów na kolonię) i kontrolnych (w sumie 28 termitów, 14 termitów na kolonię) termitów traktowanych płynem symulującym. Podczas przeprowadzania eksperymentów hodowano siedem termitów na szalce Petriego z komórkami (D=35 mm) z kawałkiem bibuły filtracyjnej (D= 18 mm) zwilżonej wodą wolną od RNaz zawierającą miR{{35} } symulator lub symulator kontroli. Po dwóch dniach karmienia doustnego termity zakażono grzybem, a następnie hodowano przez dziesięć dni w celu codziennej obserwacji ich przeżycia. Martwe termity zostały na czas usunięte.

Analiza statystyczna

Wszystkie analizy danych przeprowadzono w programie IBM SPSS wersja 19. Do wykrycia, czy zbiory danych mają rozkład normalny, wykorzystano test Shapiro – Wilka. Biorąc pod uwagę, że ekspresja genów, kanibalizm i dane dotyczące pochówku były nieprawidłowo rozłożone, zastosowano test Wilcoxona. Alternatywnie, dane dotyczące stężenia miRNA, lokomocji, pielęgnacji i aktywności przeciwgrzybiczej miały rozkład normalny i zastosowano test t dla par. Przeżycie analizowano metodą Kaplana-Meiera dla długości życia w różnych warunkach leczenia. Poziom istotności wynosił p<0.05 in this study.

Wyniki

Profil ekspresji mRNA termitów wyciszonych Dicer-1

Aby określić wpływ Dicer{{0}} na profil ekspresji genów termitów, przeprowadzono sekwencjonowanie mRNA termitów wyciszonych Dicer-1-. Po 1 dniu doustnego podawania dsDicer-1 ekspresja Dicer-1 (ryc. 1A; n=6, p < 0,05; test Wilcoxona), a co za tym idzie stężenie miRNA (ryc. 1B; df =5, s. 1<0.05; paired t-test) were significantly decreased in termites. A total of 1262 mRNAs were significantly altered in the whole bodies of Dicer-1-silenced termites (upregulated: 562 mRNAs; downregulated: 700 mRNAs; Fig. 1C and Supplementary material 2-Table S2). The differentially expressed genes (DEGs) were mapped to the salivary secretion, glycolysis, citrate cycle, and 29 other KEGG pathways (Fig. 1D–F and Supplementary material 2-Table S3). In addition, the DEGs were clustered into the ATP generation from ADP, structural constituent of the cuticle, defense response, glutathione transferase activity, oxidation–reduction process, and 171 other GO terms (Fig. 2 and Supplementary material 2-Table S4).

Ryc. 1 Profil ekspresji genów w całych ciałach termitów-1-z licencją Dicer. Wyrażenie Dicer-1. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. *P<0.05. B The concentration of miRNAs. The data are shown as the mean±SEM. *p<0.05. C The number of diferentially expressed genes (DEGs). D The DEGs mapped to salivary secretion. ATP1B, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta; ATP2B, Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1; PKC, Protein kinase C alpha type; CALM, Calmodulin-like protein; LYZ, Lysozyme C. E The DEGs mapped to glycolysis. GPI, Glucose-6-phosphate isomerase; PFKC, ATP-dependent 6-phosphor fructokinase; TIM, Triosephosphate isomerase; GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PGK, Phosphoglycerate kinase; MINPP1, Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1; GPMA, 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase; ENO, Enolase. F DEGs mapped to citrate cycle. PCK, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP]; PYC, pyruvate carboxylase; MDH1, malate dehydrogenase; SUCD, succinate–CoA ligase [ADP-forming]. Red letters indicate upregulation; blue letters indicate downregulation

Ryc. 2 Mapy cieplne DEG pogrupowane w terminy GO związane z obronnością. Generacja ATP z ADP. B Składnik strukturalny naskórka. C Reakcja obronna. D Aktywność transferazy glutationowej. E Proces utleniania i redukcji

Weryfikacja RT – qPCR DEG z mRNA-seq

Glikoliza, cykl cytrynianowy i wytwarzanie ATP z ADP były powiązane z metabolizmem węglowodanów i energii, w którym osiem DEG (dehydrogenaza{{0}gliceraldehydofosforanowa, 23-zależna od bisfosfoglicerynianu mutaza fosfoglicerynianowa, enolaza, izomeraza triozofosforanowa, zależna od ATP 6-fosfofruktokinaza, karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa [GTP], ligaza bursztynianowo-CoA [podjednostka alfa{{6} tworząca ADP) i dehydrogenaza jabłczanowa) zostały znacząco obniżone po zastosowaniu preparatu Dicer -1 wyciszanie (ryc. 3A–H; n=6, p < 0,05; test Wilcoxona), sugerujące zaburzenia glikolizy, cyklu cytrynianowego, wytwarzania ATP, a co za tym idzie metabolizmu węglowodanów i energii w całym organizmie uciszonych termitów Dicer-1-. DEG (defensyna i terminicyna) w AMP kodowanych w odpowiedzi obronnej. Ekspresja tych genów była znacznie zwiększona u termitów wyciszonych Dicer-1- w porównaniu z termitami leczonymi GFP (ryc. 3I, J; n=5 lub 6, s<0.05; Wilcoxon test). In the oxidation–reduction process, cytochrome P450 9e2 and peroxiredoxin-4 were significantly altered after Dicer-1 silencing in termites (Fig. 3K, L; n = 6, p<0.05; Wilcoxon test). These results implied an important effect of Dicer-1 on the immune response and oxidation–reduction reaction in whole-body of the termites. The effect of Dicer‑1 on behavioural disease defences in termite groups 

Aby określić wpływ Dicer-1 na reakcję behawioralną na skażenie grzybami, przetestowaliśmy cztery ważne mechanizmy obronne behawioralne: poruszanie się, pielęgnacja, kanibalizm i pochówek u wyciszonych termitów Dicer-1-. Nasze wyniki pokazały, że lokomocja (ryc. 4A, t=7.013, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S3 and Video S1), grooming (Fig. 4B, t=5.949, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S4 and Video S2), cannibalistic (Fig. 4C, n =9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S1 and Video S3) and burial (Fig. 4D; n=9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S2 and Video S4) behaviors were significantly reduced in Dicer-1-silenced termites compared to GFP-treated termites, suggesting an important role of Dicer-1 in driving behavioral disease defenses in termite colonies.

Ryc. 3 Weryfikacja RT-qPCR DEG z mRNA-seq. A – H Geny związane z metabolizmem węglowodanów i energii. I – J Geny związane z odpowiedzią immunologiczną. K–L Geny związane z reakcjami utleniania i redukcji. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. *P<0.05

Wpływ Dicer-1 i miR-71-5 na zdolności przeciwgrzybicze termitów

Aby określić wpływ miRNA na reakcję fizjologiczną na skażenie grzybami, przetestowaliśmy całkowitą aktywność przeciwgrzybiczą termitów wyciszonych przez Dicer. Nasze wyniki wykazały, że aktywność przeciwgrzybicza została znacząco zmniejszona (ryc. 5A; t=−3,046, df=5, p<0.05; paired t-test) in Dicer-1-silenced termites. Furthermore, miR-71-5 was selected for further testing to determine its role in physiological defense, which was chosen according to the comparative profiling of miRNAs and mRNAs in fungus-contaminated versus naive termites and miRNA-mRNA analysis (data unpublished). We found that the antifungal activity (Fig. 5B; t=−4.000, df=5, p<0.05; paired t-test) was significantly reduced in termites treated with miR-71-5 simulants compared to those treated with simulant controls. These results suggested that miRNAs played an important role in driving physiological disease defenses in termites.

Ryc. 4 Wpływ rozregulowania miRNA na obronne zachowania społeczne w grupach termitów. A Poruszanie się, B Pielęgnacja, C Kanibalizm i D Zachowania związane z pochówkiem u wyciszonych grup Dicer-1-w porównaniu z grupami termitów leczonych GFP. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. *P<0.05, **p<0.01

Ryc. 5 Wpływ rozregulowania miRNA na obronę fizjologiczną u termitów. Aktywność przeciwgrzybicza termitów-1-wyciszonych Dicer w porównaniu z termitami leczonymi GFP. B Aktywność przeciwgrzybicza miR-71-5 w porównaniu z termitami kontrolnymi leczonymi płynem symulującym. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. *P<0.05

Dicer-1 i miR-71-5 wpłynęły na przeżycie termitów skażonych grzybami

Ponieważ zarówno symulanty dsDicer-1, jak i miR-71-5 prowadziły do ​​zmniejszonej aktywności przeciwgrzybiczej termitów, przetestowaliśmy ich potencjał w zakresie biologicznego zwalczania termitów. Odkryliśmy, że wyciszone termity Dicer-1-zanieczyszczone grzybem wykazywały znacznie zmniejszoną przeżywalność w porównaniu z innymi leczonymi termitami (grzyb dsDicer-1+w porównaniu z dsGFP+grzyb: χ2=81.839, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsDicer-1+Tween 80: χ2=63.070, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsGFP+Tween 80: χ2=65.474, p<0.001). GFP-treated termites contaminated with fungus showed significantly decreased survival compared to the termites without fungal contamination (dsGFP+fungus versus dsDicer-1+Tween 80: χ2=58.636, p<0.001; dsGFP+fungus versus dsGFP+Tween 80: χ2=68.849, p<0.001). There was no significant difference between dsDicer-1- and dsGFP-treated termites without fungal contamination (χ2=2.037, p=0.154) (Fig. 6A). Additionally, the survival of fungus-contaminated termites treated with the miR- 71-5 simulant was signifcantly decreased compared to that of other treated termites (miR-71-5+fungus vs. control+fungus: χ2=63.593, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. miR- 71–5+Tween 80: χ2=60.585, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. control+Tween 80: χ2=67.129, p<0.001). The survival of fungus-contaminated termites treated with the simulant control was significantly decreased compared to that of the termites without fungal contamination (control+fungus vs. miR-71-5+Tween 80: χ2=61.065, p<0.001; control+fungus vs. control+Tween 80: χ2=68.064, p<0.001). There was no significant difference in survival between termites treated with the miR-71-5 simulant and simulant control without fungal contamination (miR-71-5+Tween 80 vs. control+Tween 80: χ2=1.000, p=0.317) (Fig. 6B). These results suggested a good effect of miRNAs coupled with entomopathogens in biologically controlling termites.

Dyskusja

miRNA pełnią wiele funkcji, takich jak regulacja metabolizmu węglowodanów i energii, odpowiedzi immunologicznej, reakcji utleniania i redukcji oraz innych procesów życiowych w całych ciałach termitów. Zgodnie z oczekiwaniami, dsDicer-1 połknięty przez termity spowodował wyciszenie Dicer-1, a następnie zmniejszył stężenie miRNA, co sugeruje pomyślną indukcję rozregulowania miRNA. Analiza transkrypcji wykazała, że ​​wyciszenie Dicer-1 było powiązane z 32 szlakami KEGG i 175 terminami GO. W koloniach owadów społecznych wydzielina śliny może działać jako zewnętrzny środek dezynfekujący i działać w powiązaniu z zachowaniami społecznymi, takimi jak trofalaksja, pielęgnacja i zakładanie gniazd, aby opiekować się potomstwem, współlokatorami i koloniami (Bulmer i in. 2009; Hamilton i in. 2011 ;Hamilton i Bulmer 2012). Glikoliza, cykl cytrynianowy i wytwarzanie ATP z ADP biorą udział w metabolizmie węglowodanów i energii. Ponieważ narastanie odpowiedzi immunologicznych i wykonywanie zachowań społecznych jest kosztowne energetycznie, zaburzenia metabolizmu węglowodanów i energii mają negatywny wpływ na te procesy (Liu i in. 2020; Hassan i in. 2021a, b; Xu i in. 2021a, b). Strukturalny składnik naskórka łączy się ze skórkami owadów, tworząc pierwszą barierę zapobiegającą inwazji patogenów na hemocoel (Syazwan i in. 2021). Kilka DEG zaangażowanych w reakcję obronną, aktywność transferazy glutationowej oraz proces utleniania i redukcji jest w stanie kodować peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP), białka detoksykacyjne i enzymy antyoksydacyjne w celu zwiększenia odporności i tolerancji owadów na patogeny (Liu i in. 2015, 2019a). Te funkcje związane z obroną prawdopodobnie przyczynią się do odporności społecznej w koloniach termitów. Pozostałe ścieżki KEGG i terminy GO były zaangażowane w układ nerwowy, układ trawienny, długowieczność, rozwój itp. (Materiał uzupełniający 2-Tabela S3 i S4). Ponadto niektóre DEG (np. geny metabolizmu węglowodanów i energii) u wyciszonych termitów Dicer-1 pochodziły od drobnoustrojów (materiał uzupełniający 2-Tabela S2), które prawdopodobnie były symbiontami jelitowymi i mogły być ważnymi składnikami uczestnicząc w procesach życiowych gospodarzy. Dlatego miRNA prawdopodobnie będą miały globalny wpływ na całe ciało termita.

Ryc. 6 Wpływ dysregulacji miRNA na przeżycie grup termitów skażonych grzybami. Przetrwanie termitów wyciszonych- 1-Dicer w porównaniu z termitami traktowanymi GFP z lub bez skażenia grzybiczego; B Przeżycie miR-71-5 w porównaniu z termitami kontrolnymi, którym podawano płyn symulujący, z lub bez zanieczyszczenia grzybiczego. Różne litery wskazują na istotne różnice, s. 23<0.05

Metabolizm węglowodanów i energii, odpowiedź immunologiczna oraz reakcje utleniania i redukcji są ważne dla miRNA w napędzaniu odporności społecznej. Zachowanie zwierząt jest procesem zależnym od energii, dlatego też niektóre inhibitory energii powodują, że zwierzęta poruszają się powoli, a nawet umierają (Davidson 1930; Schuler i Casida 2001). W koloniach termitów zaburzenia glikolizy lub cyklu cytrynianowego powodują obniżenie poziomu ATP i hamują zachowania lokomocyjne (Hassan i in. 2021a, b; Xu i in. 2021a, b). Zaburzenia cyklu cytrynianowego zmniejszają także działanie przeciwgrzybicze termitów, prowadząc do zwiększonej infekcji i śmiertelności (Liu i in. 2020). Ponadto, ponieważ donoszono, że symbionty w jelitach termitów uczestniczą w obronie przed chorobami żywiciela, dostarczając enzymy (Rosengaus i in. 2014) i metabolity (Inagaki i Matsuura 2018), zaburzenia metaboliczne w symbiontach jelitowych prawdopodobnie zmniejszały immunokompetencję pochodzącą od symbiontów i w związku z tym zmniejszona obrona przed chorobami termitów. W naszym badaniu potwierdzono, że osiem genów metabolicznych jest znacząco obniżonych, co sugeruje zaburzenia glikolizy i cyklu cytrynianowego w całych ciałach termitów wyciszonych Dicer-1-. Zasugerowaliśmy, że metabolizm węglowodanów i energii za pośrednictwem miRNA jest ważnym mechanizmem biochemicznym napędzającym odporność społeczną i że zakłócenie tego procesu prawdopodobnie zmniejszy behawioralną i fizjologiczną obronę przed chorobami w koloniach termitów. Układ odpornościowy owadów indukuje dużą liczbę cząsteczek efektorowych do zwalczania patogenów in vivo. Defensyny to zwarte, bogate w cysteinę i odporne na proteazy AMP o szerokim spektrum działania przeciwko bakteriom, grzybom i innym pasożytom (Weber 2021). Termicyna to specyficzna dla termitów defensyna przeciwgrzybicza, której wyciszenie skutkuje zmniejszoną aktywnością przeciwgrzybiczą, a tym samym zwiększoną śmiertelnością termitów skażonych grzybami (Hamilton i Bulmer 2012). Detoksykacja owadów i układy antyoksydacyjne często działają w połączeniu z układem odpornościowym, co skutecznie zmniejsza ryzyko pojawienia się toksyn i RFT podczas interakcji żywiciel-patogen (Syazwan i in. 2021). Monooksygenazy cytochromu P450 odpowiadają za katalizowanie utleniania i metabolizmu toksyn patogenów oraz wytwarzanie wolnych rodników, czyli ROS (Shankar i Mehendale 2014). Do rodziny peroksyredoksyn zaliczają się enzymy antyoksydacyjne, które katalizują redukcję ROS (Xu i in. 2021a; b). Nasze wyniki potwierdziły, że wyciszanie Dicer2001 znacząco zmieniło ekspresję genów defensyny, tricyny, cytochromu P450 9e2 i peroksiredoksyny-4, co wskazuje, że miRNA odgrywały ważną rolę w regulowaniu odpowiedzi immunologicznej i reakcje utleniania i redukcji w całym ciele termita. Dlatego sugerujemy, że metabolizm węglowodanów i energii, odpowiedź immunologiczna oraz reakcje utleniania i redukcji mogą uczestniczyć w mechanizmie napędowym odporności społecznej w kształcie miRNA, a ich zakłócenie może negatywnie wpływać na odporność społeczną w koloniach termitów.

cistanche tubulosa – poprawiają układ odpornościowy

Rzeczywiście, rozregulowanie miRNA ma negatywny wpływ na ruch, a tym samym obronę behawioralną w koloniach termitów. W przeciwieństwie do owadów samotnych, owady społeczne wyewoluowały bogaty repertuar mechanizmów obronnych behawioralnych, wspólnie wykrywających obecność patogenów, ograniczających rozprzestrzenianie się patogenów i zmniejszających ryzyko infekcji u osobników (Van Meyel i in. 2018; Liu i in. 2019a). Starsze robotnice wykonują niebezpieczne prace poza gniazdem i łatwo ulegają zakażeniu. Kiedy są zakażone, współlokatorzy mają tendencję do skupiania się w kierunku zarażonych pracowników i pielęgnowania ich (Liu i in. 2019b). Zarówno zanieczyszczone robotnice, jak i ich opiekunowie zwiększają dystans od reszty naiwnych współlokatorów. Pielęgniarki zabierają lęgi głębiej w głąb kolonii, aby zwiększyć odległość od zarażonych robotnic (Stroeymeyt i in. 2018). Wyniki te pokazują, że zwiększanie dystansu fizycznego między członkami kolonii jest skuteczną strategią ograniczania przenoszenia patogenów [określaną jako „odporność organizacyjna” (Liu et al. 2019a)], a poruszanie się powinno być ważnym zachowaniem społecznym, ponieważ w sposób adaptacyjny dostosowuje odległość między zarażonymi osobnikami a naiwnymi współlokatorami. Hassan i współpracownicy odkryli, że termity znacznie usprawniły swoją lokomocję podczas skażenia grzybami, co dodatkowo wykazało poruszanie się w odpowiedzi na patogeny (Hassan i in. 2021a, b). Ponadto zabiegi pielęgnacyjne, kanibalizm i grzebanie są dobrze znane w postępowaniu ze skażonymi osobnikami i zwłokami w koloniach owadów społecznych. U termitów zanieczyszczonych grzybami zachowanie pielęgnacyjne następuje natychmiast, przed kiełkowaniem (Liu i in. 2019b). Natomiast zachowania kanibalistyczne mają miejsce dopiero wtedy, gdy zarażone osoby staną się widocznie chore (Davis i in. 2018). W przypadku postępowania z zwłokami świeże zwłoki są często uważane za nagrodę żywieniową i wywołują kanibalizm, wytwarzając sygnał wczesnej śmierci. Z kolei rozkładające się zwłoki są uważane za ryzyko infekcji i powodują pochówek, wytwarzając sygnały późnej śmierci (Sun et al. 2016). Tutaj odkryliśmy, że wyciszenie Dicer-1 znacząco hamuje lokomocję i inne ruchy, takie jak czynności pielęgnacyjne, kanibalizm i grzebanie, co sugeruje, że rozregulowanie miRNA miało ogólny wpływ na ruch termitów i w konsekwencji wpływało na obronę behawioralną przed patogenami, patogenami skażone współlokatorki i skażone patogenami zwłoki w koloniach termitów. Jeśli chodzi o mechanizm napędowy, metabolizm węglowodanów i energii za pośrednictwem miRNA można uznać za jeden z najważniejszych czynników biochemicznych (patrz powyższa dyskusja). Dlatego miRNA mogą kształtować behawioralną obronę termitów.

Rozregulowanie miRNA miało również negatywny wpływ na fizjologiczną obronę termitów. Termity zwykle zwiększają swoją zdolność przeciwgrzybiczą poprzez regulację w górę genów odpornościowych w celu wzmocnienia ich fizjologicznej obrony (Liu i in. 2015). Substancje przeciwgrzybicze pochodzące z symbiontów jelitowych zapewniają termitom zdolność hamowania wzrostu grzybów w celu wzmocnienia ich fizjologicznych mechanizmów obronnych (Rosengaus i in. 2014). Dlatego też całkowita aktywność przeciwgrzybicza była skutecznym wskaźnikiem fizjologicznej obrony termitów przed chorobami. Ostatnie badania wykazały, że nie tylko geny odporności, ale także geny metabolizmu węglowodanów i antyoksydantów uznano za ważne elementy wpływające na aktywność przeciwgrzybiczą termitów (Liu i in. 2020; Zhao i in. 2020; Zhou i in. 2021). Pozbawione fauny termity były bardziej podatne na skażenie grzybami (Rosengaus et al. 2014). Chociaż zwiększona ekspresja genów odpornościowych, takich jak defensyna i tricyna, rozregulowanie miRNA za pośrednictwem Dicer-1-zmniejszyło ekspresję metabolizmu węglowodanów i genów przeciwutleniających u termitów lub symbiontów jelitowych, a zatem znacząco zmniejszyło całkowitą aktywność przeciwgrzybiczą termitów. Ponadto termity leczone środkiem symulującym miR-71-5 również wykazywały spadek całkowitej aktywności przeciwgrzybiczej, co dodatkowo sugeruje negatywny wpływ rozregulowania miRNA na fizjologiczną obronę termitów. Co więcej, grupy termitów karmione płynem symulującym dsDicer-1 lub miR-71-5 były bardziej podatne na skażenie grzybicze, co wykazało wzrost śmiertelności z powodu infekcji. Dlatego miRNA mogą kształtować odporność społeczną, stymulując zarówno behawioralną, jak i fizjologiczną obronę przed chorobami w koloniach termitów.

Ryc. 7 Potencjalne mechanizmy leżące u podstaw odporności społecznej w koloniach termitów i nowe cele biologicznego zwalczania szkodników. miRNA szeroko wpływają na cały organizm termitów, w tym na metabolizm węglowodanów i energii, odpowiedź immunologiczną B, reakcje utleniania i redukcji C itp. D Stwierdzono, że metabolizm węglowodanów i energii odgrywają ważną rolę w regulacji zarówno zachowania, jak i aktywności przeciwgrzybiczej termitów. Dlatego metabolizm węglowodanów i energii za pośrednictwem miRNA prawdopodobnie będzie jednym z genetycznych i biochemicznych czynników napędzających behawioralną (taką jak poruszanie się, pielęgnacja, kanibalizm i pochówek) i fizjologiczną (aktywność przeciwgrzybicza) obronę przed chorobami w koloniach termitów. E Odpowiedź immunologiczna pomogła termitom zahamować replikację i rozprzestrzenianie się patogenów w jamie ciała. Reakcja utleniania i redukcji chroniła termity przed uszkodzeniami powodowanymi przez toksyny i ROS w wyniku interakcji „żywiciel-patogen”. Dlatego odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem miRNA i reakcja utleniania i redukcji odgrywają ważną rolę w napędzaniu fizjologicznej obrony przed chorobami u termitów. F miRNA kształtowały odporność społeczną, stymulując behawioralną i fizjologiczną obronę przed chorobami w koloniach termitów. Celując w miRNA, moglibyśmy sztucznie zwiększyć podatność kolonii termitów na entomopatogeny, a w konsekwencji poprawić biologiczną kontrolę termitów.

Według naszej wiedzy jest to pierwszy raport na temat potencjalnego mechanizmu miRNA leżącego u podstaw odporności społecznej w koloniach termitów. miRNA mogą wpływać na wydzielanie śliny, metabolizm węglowodanów i energii, wytwarzanie naskórka, reakcje immunologiczne, reakcje utleniania i redukcji itp. Wśród nich metabolizm węglowodanów i energii jest prawdopodobnie ważnym czynnikiem biochemicznym napędzającym mechanizmy obronne behawioralne, takie jak poruszanie się, pielęgnacja, kanibalizm, i grzebanie w koloniach termitów. Ponadto metabolizm węglowodanów i energii, odpowiedź immunologiczna oraz reakcje utleniania i redukcji prawdopodobnie będą uczestniczyć w napędzaniu fizjologicznej obrony termitów, takiej jak działanie przeciwgrzybicze.

Dlatego odporność społeczna w kształcie miRNA może wpływać na podatność kolonii termitów na grzyby entomopatogenne; stąd miRNA mogą być skutecznymi celami biologicznej kontroli termitów (ryc. 7). Liczne badania wykazały, że wyciszanie genów docelowych za pośrednictwem RNAi może prowadzić do śmierci owadów, co ma znaczny potencjał w zakresie zwalczania szkodników owadzich. W zwalczaniu szkodników termitów Zhou i in. (2008) jako pierwsi obrali za cel geny endoglukanazy i heksamerów poprzez karmienie dsRNA, wykazując wykonalność termitycydów na bazie RNAi. Aby zwiększyć efekt śmiertelny w koloniach termitów, zastosowano termicydy na bazie RNAi w połączeniu z zakaźnymi grzybami entomopatogennymi. Wyciszanie tricyny, GNBP2, TG, IDH i innych genów kodujących za pośrednictwem RNAi w połączeniu z Metarhizium może znacząco zwiększyć podatność współlokatorów na konidia grzybowe przenoszone społecznie, a tym samym prowadzić do zwiększonego wskaźnika śmiertelności z powodu infekcji (Hamilton i Bulmer 2012; Liu i in. 2020; Zhao i in. 2020; Zhou i in. 2021). W naszym badaniu wykazaliśmy wykonalność celowania w małe niekodujące RNA poprzez karmienie w celu optymalizacji biologicznej kontroli termitów przy użyciu Metarhizium. W porównaniu z dsRNA specyficznie nakierowanymi na gen, miRNA były w stanie namierzyć szereg genów o tych samych lub różnych funkcjach, wywierając w ten sposób szerokie spektrum wpływu na procesy życiowe termitów. Dlatego też, celując w miRNA, grupy termitów wykazywały zmniejszoną behawioralną i fizjologiczną obronę przed chorobami zarówno na poziomie grupowym, jak i indywidualnym, co sugeruje szerokie spektrum hamowania odporności społecznej termitów. W rezultacie celując w miRNA, grupy termitów wykazywały wysoki poziom śmiertelności podczas skażenia grzybami, co sugeruje, że miRNA można zastosować jako termicydy w celu wzmocnienia biologicznej kontroli termitów poprzez zmniejszenie ich odporności społecznej. Dlatego miRNA można uznać za potencjalne nowe cele w zwalczaniu szkodników owadzich.

Bibliografia

Berdnik D, Fan AP, Potter CJ, Luo L (2008) Szlak przetwarzania mikroRNA reguluje morfogenezę neuronów węchowych. Curr Biol 18: 1754–1759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2008.09.045

Bulmer MS, Bachelet I, Raman R, Rosengaus RB, Sasisekharan R (2009) Celowanie w funkcję efektorową przeciwdrobnoustrojową w odporności owadów jako strategia zwalczania szkodników. Proc Natl Acad Sci USA 106:12652–12657. https://doi.org/10.1073/pnas.0904063106

Chouvenc T, Efstathion CA, Elliott ML, Su NY (2013) Rozszerzona odporność na choroby wyłaniająca się z gniazda odchodowego podziemnego termita. Proc R Soc B 280:20131885. https://doi.org/10.1098/ rspb.2013.1885

Davidson WM (1930) Rotenon jako kontaktowy środek owadobójczy. J. Econ Entomol 23:868–874. https://doi.org/10.1093/JEE/23.5.868

Davis HE, Meconcelli S, Radek R, McMahon DP (2018) Termity kształtują swoją zbiorową reakcję behawioralną w zależności od stadium infekcji. Nauka Rep 8:14433. https://doi.org/10.1038/ s41598-018-32721-7

Esparza-Mora MA, Davis HE, Meconcelli S, Plarre R, McMahon DP (2020) Hamowanie wydzielanej cząsteczki odpornościowej zakłóca odporność społeczną termitów. Przód Ecol Evol 8:75. https://doi.org/10. 3389/fevo.2020.00075

Gomez-Orte E, Belles X (2009) Metamorfoza zależna od mikroRNA u owadów hemimetabolanowych. Proc Natl Acad Sci USA 106:21678–21682. https://doi.org/10.1073/pnas.0907391106

Hamilton C, Bulmer MS (2012) Molekularna obrona przeciwgrzybicza u podziemnych termitów: interferencja RNA ujawnia rolę końca i GNBP in vivo przeciwko naturalnie spotykanemu patogenowi. Dev Comp Immunol 36: 372–377. https://doi.org/10.1016/j.dci. 2011.07.008

Hamilton C, Lejeune BT, Rosengaus RB (2011) Trofalaksja i profilaktyka: odporność społeczna u mrówki cieśliCamponotus pensylvanicus. Biol Lett 7:89–92. https://doi.org/10.1098/rsbl. 2010.0466

Hassan A, Huang Q, Mehmood N, Xu H, Zhou W, Gao Y (2021a) Zmiana lokomocji termitów i alogroomingu w odpowiedzi na infekcję grzybami chorobotwórczymi. J. Econ Entomol 114:1256–1263. https://doi.org/10.1093/jee/toab071

Hassan A, Huang Q, Xu H, Wu J, Mehmood N (2021b) Wyciszeniefosfofruktokinazagen upośledza glikolizę i powoduje nieprawidłowe poruszanie się u podziemnych termitówReticulitermes chinensisSnydera. Owad Mol Biol 30:57–70. https://doi.org/10. 1111/imb.12672

He S i wsp. (2018) Żołnierze termitów przyczyniają się do odporności społecznej poprzez syntezę silnych wydzielin ustnych. Owad Mol Biol 27: 564–576. https://doi.org/10.1111/imb.12499

Hong M, Hwang D, Cho S (2018) Morfologia hemocytów i komórkowa odpowiedź immunologiczna u termitów (Reticulitermes speratus). J. Insect Sci 18:46. https://doi.org/10.1093/jisesa/iey039

Hussain A, Li YF, Cheng Y, Liu Y, Chen CC, Wen SY (2013) Transkryptom związany z układem immunologicznymCoptotermes formosanusPracownicy Shiraki: mechanizm obronny. PLoS ONE 8:e69543. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069543

Inagaki T, Matsuura K (2018) Rozszerzony mutualizm między termitami a drobnoustrojami jelitowymi: symbionty odżywcze przyczyniają się do higieny gniazda. Sci Nat 105:52. https://doi.org/10.1007/ s00114-018-1580-y

Kumar S, Upadhyay RK (2021) Potencjał przeciwtermitowy różnych składników bioorganicznych, ze szczególnym uwzględnieniem rodziny Asteraceae. WJPR 10: 1109–1149. https://doi.org/10.20959/wjpr2 0213-19977

Lee YS i in. (2004) Odrębne role dlaDrosophilaDicer-1 i Dicer-2 w szlakach wyciszania siRNA/miRNA. Komórka 117:69–81. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(04)00261-2

Liu L, Li GH, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2015) Weryfikacja eksperymentalna i podstawy molekularne aktywnej immunizacji przeciwko patogenom grzybowym u termitów. Nauka Rep 5:15106. https://doi.org/ 10.1038/srep15106

Liu L, Wang W, Liu YL, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2019a) Wpływ zachowania alllogrooming na indywidualną odporność wrodzoną u podziemnych termitówReticulitermes chinensis(Isoptera: Rhinotermitidae). J. Insekt Sci 19:6. https://doi.org/10.1093/jisesa/iey119

Liu L, Zhao XY, Tang QB, Lei CL, Huang QY (2019b) Mechanizmy odporności społecznej na infekcje grzybicze u owadów eusocial. Toksyny 11:244. https://doi.org/10.3390/toxins11050244

Liu L, Wang CC, Zhao XY, Guan JX, Lei CL, Huang QY (2020) Zaburzenia metaboliczne zależne od dehydrogenazy izocytrynianowej zakłócają aktywną immunizację przeciwko patogenom grzybiczym u termitów eusocial. J. Pest Sci 93: 291–301. https://doi.org/10.1007/ s10340-019-01164-y

Lopez-Uribe MM, Sconiers WB, Frank SD, Dunn RR, Tarpy DR (2016) Zmniejszona komórkowa odpowiedź immunologiczna w liniach owadów społecznych. Biol Lett 12:20150984. https://doi.org/10.1098/rsbl.2015. 0984

Lucas KJ, Zhao B, Liu S, Raikhel AS (2015) Regulacja procesów fizjologicznych przez mikroRNA u owadów. Curr Opin Insect Sci 11: 1–7. https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.06.004

Rosengaus RB, Jordan C, Lefebvre ML, Traniello JFA (1999) Zachowanie alarmowe patogenu u termitów: nowa forma komunikacji u owadów społecznych. Naturwissenschaften 86:544–548. https://doi.org/ 10.1007/s001140050672

Rosengaus RB, Lefebvre ML, Traniello JFA (2000) Hamowanie kiełkowania zarodników grzybów przez nasutitermes: dowody na możliwą antyseptyczną rolę wydzielin obronnych żołnierza. J Chem Ecol 26:21–39. https://doi.org/10.1023/A:1005481209579

Rosengaus RB, Schultheis KF, Yalonetskaya A, Bulmer MS, DuComb WS, Benson RW, Thottam JP, Godoy-Carter V (2014) -1,3-glukanazy pochodzące z Symbionta u owada społecznego: mutualizm poza żywieniem . Przedni Mikrobiol 5:607. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2014.00607

Schuler F, Casida JE (2001) Cel owadobójczy w podjednostce PSST kompleksu I. Pest Manag Sci 57:932–940. https://doi.org/10. 1002/ps.364

Seipke RF i in. (2011) PojedynczyStreptomycesSymbiont produkuje wiele środków przeciwgrzybiczych, które wspomagają mrówkę hodującą grzybyAcromyrmex octospinosus. PLoS ONE 6:e22028. https://doi.org/10.1371/journ al.pone.0022028

Shankar K, Mehendale HM (2014) Cytochrom P450. W: Wexler P. (red.) Encyklopedia toksykologii. Academic Press, s. 1125–1127 Stroeymeyt N, Grasse AV, Crespi A, Mersch DP, Cremer S, Keller L (2018) Plastyczność sieci społecznościowej zmniejsza przenoszenie chorób u owadów eusocial. Nauka 362: 941–945. https://doi.org/10.1126/science.aat4793

Sun Q, Haynes KF, Zhou XG (2016) Dynamiczne zmiany w sygnałach śmierci modulują ryzyko i korzyści związane z zarządzaniem zwłokami u owada społecznego. Funkcja Ecol 31: 697–706. https://doi.org/10.1111/1365- 2435.12754

Syazwan SA, Lee SY, Sajap AS, Lau WH, Omar D, Mohamed R (2021) Interakcja pomiędzyMetarhizium anisopliaei jego żywiciel, podziemny termitCoptotermes curvignathuspodczas procesu infekcji. Biologia 10:263. https://doi.org/10.3390/biolo gy10040263

Terrapon N i in. (2014) Molekularne ślady alternatywnej organizacji społecznej w genomie termita. Nat Commun 5:3636. https://doi.org/10. 1038/ncomms4636

Van Meyel S, Körner M, Meunier J (2018) Odporność społeczna: dlaczego powinniśmy badać jej naturę, ewolucję i funkcje we wszystkich systemach społecznych. Curr Opin Insect Sci 28: 1–7. https://doi.org/10.1016/j. cois.2018.03.004

Verma M, Sharma S, Prasad R (2009) Biologiczne alternatywy dla kontroli termitów: przegląd. Int Biodeter Biodegr 63:959–972. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2009.05.009

Wang YL, Yang ML, Jiang F, Zhang JZ, Kang L (2013) Rozwój zależny od mikroRNA ujawniony przez wyciszanie genów za pośrednictwem interferencji RNALmDicer1 powiedział:w wędrownej szarańczy. Insekt Sci 20:53–60. https://doi.org/10.1111/j.1744-7917.2012.01542.x

Weber F (2021) Przeciwwirusowa odporność wrodzona: wprowadzenie. W: Bamford DH, Zuckerman M (red.) Encyklopedia wirusologii. Elsevier, s. 577–583 Xu H, Huang QY, Gao YY, Wu J, Hassan A, Liu YT (2021a)IDHpowalenie zmienia zachowanie żerowania termitówOdontocetes Formosanusw różnych kontekstach społecznych. Curr Zool 67:609. https:// doi.org/10.1093/cz/zoab032 Xu Z, Zeng X, Li M, Liao J, Chen Q (2021b) MicroRNA-383 promuje autofagię indukowaną reaktywnymi formami tlenu poprzez regulację w dół peroksyredoksyny 3 w ludzkim glejaku Komórki U87. Exp Ther Med 21:439. https://doi.org/10.3892/etm.2021.9870

Yanagawa A, Fujiwara-Tsujii N, Akino T, Yoshimura T, Yanagawa T, Shimizu S (2011) Stęchły zapach entomopatogenów wzmacnia zachowania zapobiegające chorobom u termitówCoptotermes formosanus. J. Invertebr Pathol 108:1–6. https://doi.org/10.1016/j.jip.2011. 06.001

Yanagawa A, Imai T, Akino T, Toh Y, Yoshimura T (2015) Sygnały węchowe pochodzące od grzybów chorobotwórczych wpływają na kierunek ruchu termitów,Coptotermes formosanus. J Chem Ecol 41:1118–1126. https://doi.org/10.1007/s10886-015-0649-8

Yang ML i in. (2014) MicroRNA-133 hamuje agregację behawioralną poprzez kontrolowanie syntezy dopaminy u szarańczy. PLoS Genet 10:e1004206. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004206