Wyciszenie MiR-103a-3p łagodzi odkładanie się szczawianu wapnia w nerkach szczurów poprzez aktywację osi UMOD/TRPV5

Utrzymanie równowagimetabolizm wapnia (Ca2+).w nerkach ma kluczowe znaczeniezapobieganie tworzeniu się kamieni nerkowych. Funkcjonalnie należy odkryć mikroRNA (miRNA) uczestniczące w tym procesie. Wywołaliśmy uszkodzenie komórek NRK-52E przezleczenie szczawianami. Rolę przejściowego potencjalnego receptora, członka V 5 kanału kationowego (TRPV5) w komórkach indukowanych szczawianem badano za pomocą transfekcji z nadekspresją TRPV5, qRT-PCR, Western blot, MTT i wykrywania adhezji kryształów. Po zidentyfikowaniu ekspresji uromoduliny (UMOD) w uszkodzonych komórkach potwierdziliśmy interakcję między TRPV5 i UMOD za pomocą testów koimmunoprecypitacji (CoIP) i biotynylacji na powierzchni komórki. Przeprowadzono walidację regulującego UMOD TRPV5 pod względem żywotności, adhezji kryształów i stężenia Ca2+ w komórkach indukowanych szczawianem. Do identyfikacji UMOD nakierowanego na miRNA wykorzystano analizę bioinformatyczną i test lucyferazy. Rolę osi UMOD/TRPV5 regulującej miR-103a-3p wykryto w eksperymentach ratunkowych. Skonstruowaliśmy model szczurzy potraktowany glikolem etylenowym (EG) w celu zbadania osi miR-103a-3p/ UMOD/TRPV5 in vivo za pomocą barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E), analizy Western blot i immunohistochemii (IHC). Zwiększenie poziomu TRPV5 chroniło komórki NRK-52E przed uszkodzeniem wywołanym szczawianem poprzez zwiększenie żywotności komórek i hamowanie adhezji CaOx. UMOD został zubożony w komórkach indukowanych szczawianem i pozytywnie oddziaływał z TRPV5. Wyciszenie UMOD odwróciło wpływ nadekspresji TRPV na komórki indukowane szczawianem. miR-103a-3p celował w UMOD i pośredniczył w regulacji osi UMOD/TRPV5 w komórkach indukowanych szczawianem. Obniżenie poziomu miR-103a-3p łagodzi CaOx indukowany przez EGodkładanie się w tkankach nerekin vivo poprzez aktywację osi UMOD/TRPV5. miR-103a-3p wyciszający złagodził odkładanie się CaOx w nerkach szczurów poprzez aktywację osi UMOD/TRPV5.

ZIOŁOWY FORMUŁA DLAOKŁADANIE W TKANKACH NEREK

1. Wprowadzenie

Kamica moczowa, jedna z najbardziejchoroby powszechne w urologii, spowodowane są wytrącaniem się w nerkach przesyconych kryształów z moczu [1]. Choć nie są tak agresywne jak nowotwory złośliwe, kamica moczowa od dawna wywiera poważny wpływ na zdrowie człowieka ze względu na wysoką częstość występowania i nawroty [2]. Badania potwierdziły, że pojawienie się kamieni moczowych jest wieloczynnikowe i wiąże się z uwarunkowaniami genetycznymi, metabolizmem, klimatem środowiskowym i nawykami związanymi ze stylem życia [3, 4]. Większość przypadków tej choroby stanowią kamienie szczawianu wapnia (CaOx), a u większości pacjentów z kamieniami zawierającymi Ca2+- występuje połączenie hiperkalciurii [5]. Badania fizykochemiczne potwierdziły, że nasycenie CaOx w moczu jest powiązane ze stężeniem Ca2+ oraz że zwiększone stężenie wapnia w moczu predysponuje lub sprzyja powstawaniu kamicy nerkowej zawierającej Ca2+- [6]. Kamienie nerkowe mogą prowadzić do nadciśnienia, przewlekłej choroby nerek i schyłkowej niewydolności nerek. Badania wykazały, że działania zapobiegawcze, obejmujące określone interwencje farmakologiczne oraz zalecenia dotyczące zmian w stylu życia i sposobie odżywiania, można wdrożyć po kompleksowej ocenie metabolizmu [7, 8]. Różne badania na ludziach sugerują, że diety zawierające większe spożycie warzyw i owoców odgrywają rolę w zapobieganiu kamieniom nerkowym [9–11]. Obecnie należy przeprowadzić szczegółowe badania nad molekularnym mechanizmem hiperkalciurii wywołanej nieprawidłowym metabolizmem wapnia w powstawaniu kamieni nerkowych.

TRPV5 jest ważnym białkiem regulującym transport Ca2+ przez błony komórkowe [12]. W tkankach nerek TRPV5 występuje głównie w kanaliku dystalnym krętym (DCT) i kanaliku zbiorczym (CNT), który jest odpowiedzialny za regulację wchłaniania zwrotnego Ca2+ z moczu i utrzymanie homeostazy Ca2+ w organizmie [13] . Dostępne dowody sugerują, że obniżona ekspresja TRPV5 może być istotnym czynnikiem patogenetycznym w powstawaniu hiperkalciurii i kamicy nerkowej zawierającej Ca2+- [14].

Tabela 1: Sekwencje starterów stosowane w qRT-PCR.

Uromodulina (UMOD), znana również jako białko Tamma-Horsfalla, jest glikoproteiną występującą najczęściej w moczu [15], która ulega ekspresji głównie w komórkach nabłonka kanalików nerkowych, pełniąc różnorodne funkcje fizjologiczne, takie jak równoważenie metabolizmu wodno-elektrolitowego, regulacja odporności , zapobiegając kamieniom nerkowym i chroniąc przed infekcjami dróg moczowych [16–18]. Obecnie istnieje niewiele doniesień na temat specyficznego mechanizmu molekularnego UMOD w powstawaniu kamieni nerkowych.

MikroRNA (miRNA) to klasa małych, niekodujących, jednoniciowych cząsteczek RNA o długości około 20–22 nukleotydów, powszechnie występująca u ssaków [19]. Dojrzałe miRNA mogą regulować potranskrypcyjną ekspresję docelowych genów, wiążąc się całkowicie lub częściowo komplementarnie z 3′-UTR docelowego mRNA, co powoduje degradację lub hamowanie syntezy translacji białek [20]. Ponieważ miRNA dramatycznie wpływają na czynności fizjologiczne człowieka, takie jak wzrost i rozwój, apoptoza komórek i metabolizm, uważa się, że są one bardzo obiecujące w zapobieganiu i leczeniu chorób [21]. W ostatnich latach gorącym tematem stały się badania dotyczące roli miRNA w powstawaniu i rozwoju kamieni nerkowych [22, 23].

Dlatego w tym badaniu zbadano związek między UMOD i TRPV5 w zapobieganiu tworzeniu się kamieni nerkowych i wyjaśniono rolę miR-103a-3p w ukierunkowaniu i regulacji UMOD, przyczyniając się do głębszego zrozumienia patogenezy kamieni nerkowych i dostarczenie nowych pomysłów na profilaktykę i leczenie tej choroby.

2. Materiał i metody

2.1. Hodowla komórkowa i leczenie szczawianami.

Linię komórek nabłonkowatych nerki szczura NRK{{0}}E (GNR 8) uzyskano z Chińskiego Centrum Kolekcji Typów Kultury (CCTCC) (Szanghaj, Chiny). Do hodowli przygotowano DMEM (12800017, Gibco, USA) zmieszany z wodą destylowaną, 7,5% roztworem NaHCO3 (25080094, Gibco, USA) i 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (BC-SE-FBS02, Bio kanał, Chiny). komórki w inkubatorze (37 stopni C i 5% CO2). Po subhodowli komórki indukowano rozcieńczonym szczawianem (0,75 mmol/l, 135623, Sigma Aldrich, USA) przez 48 godzin (h), jak opisano wcześniej [24]. 2.2. Transfekcja komórkowa. Do badania mechanizmu molekularnego stosuje się plazmid z nadekspresją TRPV5- (Bes-mR-001007572, Ber sinBio, Guangzhou, Chiny), plazmid z nadekspresją UMOD (Bes-mR-001278605, BersinBio, Guangzhou, Chiny), mały interferujący RNA przeciwko UMOD (siUMOD) (5′-CTCTTT TATCACACTTGATATGA-3′, GenePharma, Szanghaj, Chiny), inhibitor miR-103a-3p (GenePharma, Szanghaj, Chiny) i miR-103a-3p mimic (BersinBio, Guangzhou, Chiny) poddano różnym transfekcjom w komórkach NRK- 52E, przy czym przygotowywano odpowiednie kontrole. Przed transfekcją komórki NRK-52E hodowano na płytce 6-studzienkowej (2 x 106 komórek/studzienkę). Aż do osiągnięcia około 80% konfluencji komórek, plazmid z nadekspresją TRPV5-, plazmid z nadekspresją UMOD, siUMOD, inhibitor miR-103a-3p lub mimetyk transfekowano do NRK-52E komórek przy użyciu czasu liponowego 2000 (11668019, Invitrogen, USA) zgodnie z protokołem producenta. Następnie transfekowane komórki NRK- 52E poddano ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i Western blot w celu oceny jakości, a następnie potraktowano szczawianem.

2.3. Ekstrakcja RNA i qRT-PCR.

Całkowity RNA i miRNA z komórek NRK-52E ekstrahowano przy użyciu zestawu Cell RNA Kit (19231ES50, Yeasen, Chiny) i zestawu MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit (19331ES50, Yeasen, Chiny). Następnie zastosowano zestaw HiScript II One-Step RT-PCR Kit (P612-01, Vazyme, Chiny) w celu przeprowadzenia reakcji z ekstraktem zgodnie z instrukcją obsługi. Warunki amplifikacji ustawiono następująco: 50 stopni C przez 30 minut, 94 stopnie C przez 3 minuty, a następnie 30 cykli (94 stopnie C przez 30 s, 60 stopni C przez 30 s i 72 stopnie C przez 40 s), i 72 stopnie C przez 5 min. Test qRT-PCR przeprowadzono w systemie ABI 7500 (Applied Biosystems, USA). Względną ekspresję mRNA analizowano metodą 2−ΔΔCt [25], przy czym do normalizacji używano -aktyny lub U6. Wszystkie sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1.

2.4. Western Blot.

Całkowite białko z próbek (komórki E NRK-52E i tkanki nerek szczurów) poddano lizie przy użyciu buforu lizującego RIPA (R0010, Solarbio, Chiny) i oznaczono ilościowo za pomocą zestawu BCA Protein Assay Kit (BI-WB005, Sbjbio, Chiny). Równe ilości białka rozdzielono za pomocą elektroforezy w 10% siarczanie dodecylu sodu w żelu poliakryloamidowym (P0690, Beyotime, Chiny) i przeniesiono na membrany PVDF (AR0136- 02, Boster, Chiny). Po potraktowaniu buforem blokującym (P0252, Beyotime, Chiny) membrany inkubowano z anty-TRPV5 (ab137028, 83 kDa, 1/10000), anty-UMOD (ab207170, 110 kDa, 1/1000) i anty-{ Przeciwciała {20}}aktynowe (ab8226, 42 kDa, 1/1000) w temperaturze 4 stopni C przez noc. Następnie do inkubacji membran przez 2 godziny w temperaturze pokojowej użyto przeciwciał wtórnych, w tym przeciw króliczej IgG (ab97051, 1/2000) i przeciw mysiej IgG (ab205719, 1/2000). Względną detekcję białek przeprowadzono w iBright Imaging System (CL750, Invitrogen, USA) przy użyciu buforu ECL (WBK1S0100, Millipore, USA) do wizualizacji. - Aktyna pełniła funkcję kontroli wewnętrznej.

2.5. Test żywotności komórek.

Zawiesiny komórek przygotowano zgodnie z opisem w tym badaniu [24]. Komórki NRK-52E wysiano na 96-studzienkowe płytki do hodowli przy gęstości 5000 komórek/studzienkę i 10 µl metylotiazolilodifenylo- Roztwór bromku tetrazolu (MTT) (40201ES72, Yeasen, Chiny) zastosowano do traktowania komórek w każdej studzience w temperaturze 37 stopni C przez 4 godziny, a następnie poddano działaniu SDS-HCL. W celu oceny żywotności komórek zmierzono wartość gęstości optycznej (OD) przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek (VL0L00D0, Thermo Fisher, USA).