Morin łagodzi uszkodzenia wątroby i nerek wywołane przez aflatoksynę B1- poprzez hamowanie uwalniania pozakomórkowych pułapek heterofilnych, stresu oksydacyjnego i reakcji zapalnych u kurcząt

Po więcej informacji skontaktuj siętina.xiang@wecistanche.com

ABSTRAKCYJNYAflatoksyna B1 (AFB1) jest metabolitem wtórnym wytwarzanym przez Aspergillus favus i pasożytniczy Aspergillus, występujący głównie w zbożach, orzeszkach ziemnych, kukurydzy i innych uprawach, które poważnie zagrażają drobiu, zdrowiu ludzi i środowisku. Morin, związek flawonoidowy wyekstrahowany z roślin Moraceae, posiada właściwości przeciwutleniające, antybakteryjne iprzeciwzapalnyefekty. Jednakże, czy morin ma działanie ochronne na wywołane AFB1-wątrobaorazuszkodzenie nereku piskląt nie było konkretnie zgłaszane. W tym badaniu potwierdziliśmy głównie ochronny wpływ morinu na uszkodzenia wątroby i nerek wywołane przez AFB1- u kurcząt oraz wyjaśniliśmy jego mechanizm. Stwierdzono, że morin może znacząco obniżyć biochemiczne wskaźniki wątrobowe aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST) oraz nerkowe wskaźniki kreatyniny (CRE) i azotu mocznikowego (BUN). Tymczasem badanie histopatologiczne wykazało, że morin skutecznie łagodził AFB1-powodowane uszkodzeniem wątroby, w tym rozerwaniem hepatocytów, obrzękiem i naciekiem komórek zapalnych, oraz skutecznie łagodził uszkodzenia nerek, w tym martwicę komórek nerkowych, złuszczanie i wakuolizację. Dalsze badania mechanizmu wykazały, że morin znacząco hamował uwalnianie heterofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (HET) wywołanych przez AFB1- i obniżał poziom dialdehydu malonowego (MDA), ale zwiększał poziom dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GSH-). Px) i katalaza (CAT) in vivo. Co więcej, ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) wykazała, że ​​morin również znacząco obniżył ekspresję mRNA indukowaną przez AFB1-czynnika martwicy nowotworu (TNF- ), interleukiny-6(I{{10} }) i interleukina-1 (IL-1), indukowalna syntaza tlenku azotu (iNOS), cyklooksygenaza-2 (COX-2), kaspaza-1, kaspaza{ {16}} i kaspaza-11. Podsumowując, wszystkie wyniki potwierdziły, że morin może chronić wywołane przez AFB1- uszkodzenie wątroby i nerek poprzez hamowanie uwalniania HET, regulowanie stresu oksydacyjnego i hamowanie reakcji zapalnej, co sugeruje, że morin może być wykorzystany jako potencjalny lek do zapobiegania i leczenia aflatoksykozy w hodowli drobiu.

Słowa kluczowe:morin, aflatoksyna B1, heterofilne pułapki zewnątrzkomórkowe, odpowiedź zapalna, stres oksydacyjny

WPROWADZANIE

Aflatoksyna jest rodzajem wtórnego metabolitu o wysokiej toksyczności i niskiej masie cząsteczkowej wytwarzanej przez grzyby, takie jak Aspergillus flavus, Aspergillus pasożytniczy i specyficzny Aspergillus, które mają silną toksyczność, mutagenność i rakotwórczość, wśród których najsilniejszą toksyczność ma aflatoksyna B1 (AFB1) (Rawal et al, 2010). Zanieczyszczenie AFB1 było związane z bezpieczeństwem żywienia, produkcją zwierzęcą i bezpieczeństwem żywności, a nawet zagrażało zdrowiu ludzkiemu. Dlatego ważne jest rozwiązanie problemu zanieczyszczenia AFB1 w paszy oraz problemów resztkowych u zwierząt i produktów zwierzęcych. Narażenie na aflatoksyny w czasie ciąży stanowi zagrożenie dla zdrowia płodu, który może przenosić się z matki na płód poprzez krew pępowinową i mleko matki (Denning i wsp., 1990). Doniesiono, że poziom AFB1 w surowicy z żółtaczką z niedoborem 6-dehydrogenazy fosfoglukozy u noworodków i stwierdzono, że 58% noworodków i 75% matek uzyskało wynik pozytywny (Raafat i wsp., 2021). Jako najważniejszy rakotwórczy wątrobowokomórkowy AFB1 jest główną przyczyną raka wątrobowokomórkowego (HCC) na świecie, a badania wykazały, że AFB1 i wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) działają w połączeniu, aby jeszcze bardziej zwiększyć częstość występowania HCC (Rushing i Selim, 2019). ).AFB1-indukowanystres oksydacyjnyjest jednym z ważnych sposobów, w jaki wywierana jest jego toksyczność (Abdel-Wahhab i Aly, 2003). Jednak głębsze mechanizmy leżące u podstaw aflatoksykozy i skuteczniejsze leki w profilaktyce i leczeniu wciąż pozostają do zbadania.

Morin (strukturę chemiczną pokazano na rysunku 1), to rodzaj naturalnego pigmentu wyekstrahowanego z roślin Moraceae, który należy do flawonoidów i ma właściwości biologiczne, w tym przeciwzapalne (Wei i in.), (Li i in., 2020), i przeciwutleniacz 2015), przeciwbakteryjny (Wei i in., 2015), przeciwmiażdżycowy (Zhou i in., 2017), obniżający poziom cukru we krwi i przeciwstresowy, i jest szeroko stosowany w klinicznym leczeniu choroby wieńcowej, cukrzycy i raka. Doniesiono, że morin może wywierać działanie przeciwbakteryjne na Staphylococcus aureus, Bacillus i Micrococcus flavus poprzez zakłócanie syntezy bakteryjnego DNA i hamowanie aktywności trifosforanu adenozyny (ATPazy) (Xu i wsp. 2001). Niektóre badania pokazują, że morin może hamować TLR4/NF-xB i aktywować szlaki sygnalizacyjne Nrf2 i HO, aby chronić ostre wywołane przez LPSuszkodzenie wątrobyu myszy (Tian i wsp., 2017). Morin może również skutecznie poprawić zwłóknienie wątroby wywołane azotanem dietyloamonowym u szczurów poprzez moderowanie transdukcji sygnału Hippo/YAP i TGF- 1/Smad (Perumal i wsp., 2017). Obecnie istnieją doniesienia, że ​​różne związki, takie jak witaminy A, Cand E (Alpsoy i Yalvac, 2011) oraz eugenol, mogą opierać sięstres oksydacyjnyodpowiedź AFB1. Jednak jako tradycyjny lek przeciwutleniający, czy morin może również odgrywać rolę ochronną w wątrobie i?uszkodzenie nereku kurcząt z aflatoksykozą nie zgłoszono.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET) to pierwsza linia obrony organizmu przed zewnętrznymi patogenami wykrytymi w ostatnich latach. NET to struktura sieciowa z DNA jako szkieletem, zmodyfikowana przez cytrulinowany histon 3 (citH3) i elastazę (Wei i wsp.,

2019b), o działaniu przeciwbakteryjnym (Brinkmann i wsp., 2004), przeciwwirusowym (Saitoh i wsp., 2012) i przeciwpasożytniczym (Wei i wsp., 2016). Heterofilowe pułapki zewnątrzkomórkowe (HET) pełnią podobną funkcję do NET, z wyjątkiem tego, że HET nie wykazują ekspresji mieloperoksydazy (MPO) (Chuammitri et al., 2009). Wykazano, że N. canine może indukować uwalnianie psich NET in vitro, aby oprzeć się infekcji (Wei i wsp., 2016). Potwierdzono również badanie, które może zmniejszyć wybuchy oddechowe u karpia abamektyny (AVM) poprzez hamowanie aktywacji szlaku sygnałowego PI3K-ERK, hamując w ten sposób uwalnianie NET u karpia (Zheng i wsp., 2020). Podobnie jak abamektyna, morin jest uznanym lekiem terapeutycznym, czy jej działanie terapeutyczne jest związane z uwalnianiem NET, wymaga to dalszych badań.

Dlatego też w naszym badaniu zbadano mechanizm działania morin na wywołane przez AFB1- uszkodzenie wątroby i nerek u kurcząt, a także zbadano jego działanie ochronne. Oczekuje się, że dostarczy on eksperymentalnych podstaw do klinicznego wdrożenia morinu w weterynarii oraz dostarczy danych eksperymentalnych i referencji dotyczących zapobiegania i kontroli zatrucia mykotoksynami.

MATERIAŁY I METODY Odczynniki i materiały

AFB1 (A6636, czystość większa lub równa 98 procent, Sigma-Aldrich [Shang-hail Trading Co., Ltd., Szanghaj, Chiny). Morin (czystość Większa lub równa 98 procent) zakupiono od Chengdu Pusi Biological Co., Ltd. (Chengdu, Chiny). Zestaw testu dsDNA Pico Green (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Zestaw AST, ALT, BUN i CRE otrzymano z Instytutu Inżynierii Biologicznej w Nanjing Jiancheng (Nanjing, Chiny). Zestaw GSH-Px SOD, CAT i MDA uzyskano z Instytutu Inżynierii Biologicznej w Nanjing Jiancheng (Nanjing, Chiny). RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit otrzymano z mieszanki głównej Thermo.qPCR otrzymanej z Roche (Mannheim, Niemcy).

Ustanowienie modeli zwierzęcych

Dwadzieścia pięć jednodniowych piskląt zakupiono z fermy hodowlanej Foshan (Foshan, Guangdong) i pisklęta karmiono adaptacyjnie przez jeden dzień. Zakładanie modelu zakażonego pisklęcia rozpoczęto drugiego dnia. Badane pisklęta zostały losowo podzielone na 5 grup: grupa kontrolna, grupa AFB1 (5 mg/kg), grupa leczona morinem (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg). grupie wstrzyknięto dootrzewnowo morin w celu zapobiegania i ponownie wstrzyknięto 16 godzin później. 24 godziny później pobrano krew, pisklęta uśmiercono i pobrano tkanki wątroby i nerek. Całą realizację eksperymentu przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Foshan (FSUeae2019112501).

Wykrywanie HET w surowicy

Zebrana krew była stacjonarna, odwirowywana przy 12 000 obr./min przez 10 min, a górna surowica została wyekstrahowana, rozcieńczona 5-krotnie barwnikiem TE, a następnie dodano taką samą ilość Pico Green. Na koniec, wyniki eksperymentów zaobserwowano za pomocą fluorescencyjnego czytnika mikropłytek.

Wykrywanie ALT i AST w surowicy

Pomiar poziomu ALT i AST w surowicy za pomocą zestawu i wyniki eksperymentalne wykrywano przy długości fali 510 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Wykrywanie BUN i CRE w surowicy

Poziomy CRE i BUN w surowicy badano odpowiednimi zestawami, a wyniki doświadczalne wykrywano przy długości fali 510 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Ocena histopatologiczna tkanki wątroby i nerek

Zebrane próbki tkanki wątroby i nerek utrwalono w 10% formalinie. Następnie tkankę odwodniono, zatopiono i wybarwiono hematoksyliną i eozyną (Wet al, 2021). Wreszcie do obserwacji zmian patologicznych wykorzystano hybrydowy mikroskop obrotowy.

Wykrywanie aktywności oksydazy i aktywności enzymów przeciwutleniających

Poziomy oksydazy MDA i oksydazy antyoksydacyjnej GSH-Px, SOD i CAT wykryto za pomocą odpowiednich zestawów (Guo i wsp., 2021). Wśród nich zmierzono SOD i CAT w surowicy, a MDA i GSH-Px w tkance wątroby. Dodatkowo musimy użyć odczynników TBD do ilościowej analizy stężenia białka w próbkach (Cao et al.,2020).

Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym

QRT-PCR zastosowano do wykrycia ekspresji mRNAzapalnyczynniki TNF-a, IL-1 , IL-6, mediator stanu zapalnego COX-2, iNOS i kluczowe czynniki szlaku sygnalizacji kaspazy kaspaza-1,kaspaza{{6} } i kaspazy-11. Do kwantyfikacji fluorescencji PCR w czasie rzeczywistym zastosowano instrument CFX Connect Real-Time System. Startery genu docelowego przedstawiono w Tabeli 1. Detekcja qRT-PCR z zastosowaniem systemu Roche 25 μL, stan wynosił 50 stopni, 2 min; 95 stopni, 10 min; 95 stopni, 15 s; 60 stopni, 60 s, łącznie 40 cykli. GAPDH jako odniesienie wewnętrzne i była metodą przetwarzania danych wykorzystaną w 2-AACT (Qianru i in., 2021).

Analiza statystyczna

Wszystkie dane obliczono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 5.0 stosując jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnego porównania Tukeya. Różnice między grupami uznano za istotne statystycznie na poziomach P<>

WYNIKI

Zmiana masy ciała i współczynnika wątroby u kurcząt

Odnotowywano masę ciała każdego kurczaka i obliczano współczynnik wątrobowy (współczynnik wątrobowy =masa wątroby/masa ciała] x 100). Wyniki wykazały, że tempo wzrostu masy ciała w grupie leczonej morinem (20 mg/kg, 80 mg/kg) było istotnie zwiększone w porównaniu z grupą AFB1 (ryc. 2A), potwierdzając, że morin ma pewien wpływ na masę ciała pisklęta. Jednak współczynnik wątrobowy każdej grupy piskląt nie zmienił się znacząco (ryc. 2B).

Morin znacząco obniża poziom ALT i AST w surowicy

ALT i AST są wskaźnikami uszkodzenia wątroby. Dane wykazały, że AFB1 znacząco zwiększa poziomy ALT i AST, podczas gdy morin wykazywał całkowicie odwrotną tendencję w porównaniu z AFB1 (ryc. 3A i B), co wstępnie sugeruje, że morin ma korzystny wpływ na wywołane przez AFB 1- uszkodzenie wątroby u kurcząt. .

Morin znacząco łagodzi AFB1-powodował uszkodzenie wątroby u piskląt

W celu dalszego potwierdzenia wpływu morinu na AFB 1-powodowane uszkodzenie wątroby, przeprowadzono badanie histopatologiczne. Jak pokazano na rycinie 4, wywołany leczeniem AFB1 obrzęk hepatocytów, fragmentacja i naciek komórek zapalnych w wątrobie, ale morin (20, 40, 80 mg/kg) skutecznie łagodził uszkodzenie tkanki wątroby, co dodatkowo potwierdziło, że morin ma łagodzący wpływ na uszkodzenie wątroby wywołane przez AFB1-u kurcząt.

Morin znacząco obniża poziom BUN i CRE w surowicy

BUN i CRE jako ważne wskaźniki uszkodzenia nerek, stwierdziliśmy, że AFB1 znacząco zwiększyło poziomy BUN i CRE w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy morin wykazywał zupełnie odwrotną tendencję w porównaniu z AFB1 (Rysunek 5A i B), co również wstępnie sugeruje, że morin ma korzystny wpływ na AFB, 1-powodowany uszkodzeniem nerek u kurcząt.

Morin znacząco łagodzi AFB1-powodował uraz nerek u kurcząt

W celu dalszego potwierdzenia wpływu morinu na AFB 1-powodowane uszkodzeniem nerek przeprowadzono badanie histopatologiczne. Nerki w grupie leczonej AFB1 wykazywały martwicę komórek nerkowych, złuszczanie i wakuolizację, podczas gdy w grupie leczonej morinem, wraz ze wzrostem stężenia morynu (20,40,80 mg/kg), skutecznie łagodził uszkodzenie tkanki nerki (ryc. 6 ).

MorinZnacząco obniżono poziom AFB1-indukowanych HET w surowicy

Aby zbadać mechanizm leżący u podstaw ochrony morinu przed uszkodzeniem tkanek wywołanym przez AFB1-, Pico Green wykrył HET uwalniane w surowicy. Pobrano próbki krwi w celu wykrycia poziomu HETserum. Wynik eksperymentalny wskazywał, że AFB1 wyraźnie indukował wytwarzanie HET w surowicy, podczas gdy morin znacząco hamował wytwarzanie HET w porównaniu z grupą AFB1 (Figura 7). W ten sposób po raz pierwszy potwierdziliśmy, że morin łagodził AFB1-, powodując uszkodzenie wątroby i nerek poprzez hamowanie uwalniania HET.

Morin znacząco łagodzi AFB1-spowodowany stresem oksydacyjnym u piskląt

Poinformowano, że stres oksydacyjny jest kluczowym mechanizmem w toksycznych skutkach AFB1, wykryto funkcję morin na AFB wywołany stresem oksydacyjnym1-. Wynik wskazał, że AFB1 wyraźnie dodał poziomoksydazy MDA, jednocześnie znacznie zmniejszając poziom enzymu przeciwutleniającego GSH-Px, SOD i CAT. Jednak w porównaniu z AFB1 morin skutecznie łagodził nierównowagę między enzymami oksydazy i przeciwutleniaczy (ryc. 8).

Aby zbadać mechanizm leżący u podstaw ochrony morinu przed uszkodzeniem tkanek wywołanym przez AFB1-, Pico Green wykrył HET uwalniane w surowicy. Pobrano próbki krwi w celu wykrycia poziomu HET

Morin znacząco hamował poziomy mRNA AFB1-indukowanych mediatorów stanu zapalnego i czynników zapalnych w wątrobie

Thezapalnyodpowiedź jest ważnym mechanizmem w toksycznych skutkach AFB1; zbadano wpływ morinu na AFB1-powodowane odpowiedzi zapalne. Analiza qRT-PCR została wykorzystana do wykrycia ekspresji mediatorów stanu zapalnego COX-2 i iNOS oraz czynników zapalnych TNF-. IL-1 . IL-6. Wyniki eksperymentalne wskazały, że AFB1 znacznie poprawił poziomy ekspresji tych cytokin, podczas gdy morin znacznie zahamował ekspresję tych cytokin (Figura 9).

Morin znacząco hamował AFB1-indukował ekspresję mRNA kaspazy-1, kaspazy-3 i kaspazy-11

Doniesiono również, że szlak sygnalizacyjny kaspazy bierze udział w procesie stresu oksydacyjnego i odpowiedzi zapalnych. ROS może indukować uszkodzenie błony mitochondrialnej, prowadząc do wypływu cytochromu c i aktywacji szlaku sygnałowego kaspazy. Dlatego wykryliśmy ekspresję mRNA kluczowych czynników szlaku sygnałowego kaspazy. Wynik potwierdził, że AFB1 znacząco zwiększył ekspresję mRNA kaspazy-1, kaspazy-3 i kaspazy-11, podczas gdy morin znacznie obniżył ekspresję tych czynników (Figura 10).

DYSKUSJA

AFB1 to najbardziej toksyczna mikotoksyna, która jest główną przyczyną aspergilozy. Przeprowadzono wiele badań dotyczących toksyczności AFB1, w tym hepatotoksyczności, neurotoksyczności i rakotwórczości. Wątroba, jako główny narząd detoksykacji i główne miejsce przemian metabolizmu substancji u zwierząt, jest niezwykle podatna na uszkodzenia AFB1, w których pośredniczą głównie 4 mechanizmy: układ enzymatyczny cytochromu P450 (CYP450), mitochondria, układ odpornościowy i wolne rodniki . Po dostaniu się AFB1 do organizmu jest wchłaniany z dwunastnicy przewodu pokarmowego i przedostaje się do wątroby przez żyłę wrotną, gdzie jest przekształcany w AFBO przez CYP1A2 i CYP3A4 w fazie I metabolizmu układu enzymatycznego CYP450 w hepatocytach (Yang i in. ..2013). Powyższy proces jest najważniejszą przyczyną, dla której AFB1 powoduje zaburzenia w organizmie oraz wywołuje toksyczne i rakotwórcze skutki. AFB1 może również indukować apoptozę hepatocytów poprzez zwiększenie ekspresji receptorów śmierci FAS i TNFR1 oraz zmniejszenie ekspresji receptorów antyapoptotycznych XIAP i Bcl-2(Mughal i wsp.,2017).W poprzednich eksperymentach , potwierdziliśmy, że AFB1 może powodować uszkodzenie wątroby i nerek u kurcząt i wstępnie wyjaśniliśmy mechanizm.

Morin to rodzaj naturalnego flawonoidu, który posiada naturalną strukturę antyoksydacyjną. Chinon powstały w wyniku jego utleniania ma silne działanie przeciwutleniające, które może chronić nienasycone kwasy tłuszczowe na błonie komórkowej przed utlenianiem (Xie i wsp., 2003). Badania potwierdziły, że morin może odgrywać pewną ochronną rolę w uszkodzeniu wątroby wywołanym przez IFOS u myszy poprzez hamowanie stresu oksydacyjnego. zapalenie, a także apoptoza komórek (Ozdemir i wsp.2020). Morin może również łagodzić zapalenie gruczołu mlekowego wywołane przez LPS poprzez hamowanie PI3K/AKT, MAPK, NF-kB. i szlaki sygnałowe NLRP3 (Jiang i wsp. 2020). Jednak powiązane ochronne działanie morinu na wywołane przez AFB 1-uszkodzenia pozostają nieznane. Dlatego w tym eksperymencie badano głównie ochronne działanie morinu na AFB 1-powodujące uszkodzenie wątroby i nerek oraz wyjaśniano jego mechanizm.

Na podstawie dokładniejszej oceny dawki i działania morinu wybrano iniekcję dootrzewnową. Ponadto sposób podawania moryny był zgodny z tym u myszy i szczurów (Jiang i wsp. 2020;

Khamchai i in., 2020). Najpierw zbadano poziomy AST, ALT, BUN i CRE w surowicy, aby potwierdzić, że model toksyczności AFB1 został pomyślnie ustalony. Wskaźniki uszkodzenia wątroby i nerek w grupie AFB1 były znacząco podwyższone, podczas gdy grupy morinów wyraźnie hamowały ekspresję tych enzymów, co wstępnie potwierdziło rolę moryny w ochronie przed AFB 1-powodującym uszkodzenia wątroby i nerek u kurcząt. Jednocześnie stwierdziliśmy, że chociaż nie było znaczącej różnicy we wskaźniku wątrobowym między grupami, tempo wzrostu masy ciała uległo znacznej poprawie w grupie leczonej morinem (20 mg/kg, 80 mg/kg), potwierdzając efekt morin na wadze piskląt. Ponadto badanie histopatologiczne potwierdziło, że morin skutecznie łagodził AFB1-powodowany rozerwaniem hepatocytów, obrzękiem, naciekiem komórek zapalnych oraz martwicą, złuszczaniem i wakuolizacją komórek nerkowych, co dodatkowo potwierdziło ochronny wpływ morinu na uszkodzenia wątroby i nerek u kurcząt. . Następnie zbadaliśmy mechanizm ochronny morinu przeciwko AFB, 1-powodowanemu uszkodzeniem wątroby i nerek u kurcząt.

NET, jako pierwsza linia obrony odporności wrodzonej, jest dla organizmu obosiecznym mieczem. Z jednej strony odgrywa ważną rolę w obronie organizmu przed patogenami. Z drugiej strony będzie powodować uszkodzenia tkanek i uczestniczyć w powstawaniu niektórych chorób, takich jak miażdżyca i zakrzepica (Moschonas i Tselepis, 2019). Badanie potwierdziło, że NET i histony odgrywają ważną rolę w uszkodzeniu komórek nabłonka sutka bydła (BMEC), a hamowanie powstawania nadmiernych NET może łagodzić uszkodzenia związane z zapaleniem wymienia (Wei i wsp. 2019a). Odkryliśmy również, że AFB1 może powodować uszkodzenie wątroby i nerek u piskląt poprzez wywoływanie uwalniania HET. To, czy ochronny wpływ morin na urazy spowodowane AFB1 u piskląt jest związane z HET, jest również ważnym celem naszego eksperymentu. HET działają jako żywotna wrodzona odpowiedź immunologiczna kurczaka, a najlepszy czas na wykrycie HET w surowicy to 24 godziny, dlatego wybrano czas badania. Stwierdzono, że morin znacząco zmniejszał tworzenie HET w surowicy i po raz pierwszy potwierdzono, że morin łagodził AFB1-powodujący uraz u kurcząt poprzez hamowanie uwalniania HET.

W normalnym procesie metabolicznym organizmu redoks jest w dynamicznej równowadze, ale gdy produkcja reaktywnych form tlenu (ROS) w organizmie przekracza ilość przeciwutleniaczy, wystąpi stres oksydacyjny. Stres oksydacyjny jest zaangażowany w wiele chorób wątroby, takich jak fibroproliferacyjna choroba wątroby, alkoholowa choroba wątroby i niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (Cichoz-Lach i Michalak, 2014). MDA jest końcowym produktem peroksydacji lipidów wytwarzanym przez ROS i może niezależnie odzwierciedlać stopień uszkodzenia systemu błonowego oraz stopień ataku wolnych rodników na komórki, dlatego jest uważany za dobry marker do oceny stresu oksydacyjnego (Wang i in. , 2019). SOD jest specyficznym enzymem antyoksydacyjnym, który wymiata anion ponadtlenkowy w wolnych rodnikach ROS, które pośrednio postrzegają zdolność organizmu do usuwania wolnych rodników tlenowych i pełni niezwykle istotną funkcję w badaniach uszkodzenia wątroby (Zhang i wsp. 2018) . GSH-Px jest ważnym wskaźnikiem do pomiaru stanu redoks komórek, który może przeciwdziałać toksyczności rodników tlenowych poprzez bezpośrednie dostarczanie H plus i redukcję

uszkodzenie oksydacyjne wątroby. CAT występują w różnych tkankach zwierząt, zwłaszcza w wątrobie w wysokich stężeniach, które mogą skutecznie rozkładać nadtlenek wodoru na dwutlenek węgla i wodę, aby chronić komórki przed uszkodzeniem oksydacyjnym (Alfonso-Prieto i in., 2009). Wynik wskazał, że AFB1 wyraźnie obniżył poziom enzymów antyoksydacyjnych GSH-Px, SOD i CAT, zwiększył również poziom enzymów antyoksydacyjnych MDA, podczas gdy grupa morin wykazała odwrotną tendencję, skutecznie łagodząc nierównowagę między oksydazą a enzymami antyoksydacyjnymi, co wskazuje że morin może skutecznie hamować wywołany stresem oksydacyjnym AFB1-.

Doniesiono, że ROS mogą powodować ekspresję cytokin zapalnych i aktywację szlaków jądrowego czynnika kappa B (NF-xB) i kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAPK) (Li i wsp. 2014). Białko NF-xB zwykle tworzy homo/heterodimery z p65 i p50 i jest nieaktywne w cytoplazmie z powodu tworzenia kompleksu trimerowego z hamującym białkiem IkB (Pantano i wsp., 2006). Po stymulacji przez patogen, IkB zostaje oddzielony od trimeru, a dimer NF-kB jest wystawiony na działanie sekwencji lokalizacji jądrowej (NLS), które szybko wnikają do jądra z cytoplazmy i wiążą się z określonymi sekwencjami na jądrowym DNA, promując transkrypcja pokrewnych genów (Zhang i Ghosh, 2001). TNF- jest najważniejszą cytokiną prozapalną zaangażowaną w aktywację NF-B, indukującą ekspresję IL-18, IL-6, COX -2,iNOS i inne mediatory zapalne niższego rzędu (Rajendran i wsp. 2018). Nasze wyniki wykazały, że AFB1 znacząco promuje ekspresję mRNA czynników zapalnych TNF- , IL-1 , IL-6 i mediatorów zapalnych COX-2 i iNOS, ale grupa morin znacząco hamuje ekspresję tych czynników, co wskazuje, że morin może skutecznie hamować odpowiedź zapalną indukowaną przez AFB1-u kurcząt.

Badania wykazały, że stres oksydacyjny jest jednym z czynników indukujących apoptozę (Chandra et al., 2000), a wiele substancji, które indukują apoptozę, to na ogół utleniacze lub bodźce w metabolizmie oksydacyjnym komórek. Aktywacja NF-kB może prowadzić do transkrypcji genów czynników proapoptotycznych lub hamować ekspresję białek antyapoptotycznych. Tymczasem szlak sygnałowy kaspazy i odpowiedź zapalna są w tandemie. Kaspaza-1 odgrywa ważną rolę w wydzielaniu Il-1, a kaspaza-11 jest homologią ludzkiej zapalnej kaspazy-4 i kaspazy członków rodziny-4kaspazy{{9 }} (Van Opdenbosch i Lamkanfi, 2019). Potwierdziliśmy, że AFB1 znacznie zwiększa ekspresję kaspazy-1, kaspazy-3 i kaspazy-11, podczas gdy morin znacznie zmniejsza ekspresję tych czynników, potwierdzając, że morin może skutecznie hamować aktywację AFB1-indukowany szlak sygnalizacyjny kaspazy u kurcząt.

Na podstawie powyższych wyników potwierdziliśmy, że morin może skutecznie łagodzić AFB1-powodowane uszkodzeniem wątroby i nerek u kurcząt, co może stanowić podstawę eksperymentalną i teoretyczne odniesienie do praktycznego zastosowania morinu. W kolejnych badaniach należy wybrać tryb żywienia morinem, np. wodę pitną, a do potwierdzenia wpływu moryny w hodowli drobiu potrzeba więcej piskląt i starszych kurcząt.

WNIOSEK

Morin, jako naturalny związek powszechnie występujący w chińskich lekach ziołowych i suplementach diety, został w pełni przebadany i potwierdzony pod kątem bezpieczeństwa i uzyskał zadowalające wyniki. Nasze eksperymenty wykazały ponadto, że morin może skutecznie łagodzić AFB 1-powodowane uszkodzeniem wątroby i nerek poprzez hamowanie uwalniania HET, stresu oksydacyjnego i reakcji zapalnej. W związku z tym badanie to pokazuje, że morin ma potencjał jako dodatek paszowy do ochrony wątroby i nerek drobiu, zapobiegania szkodliwym substancjom w paszy i poprawy wydajności drobiu.