Wielokolorowe obrazowanie białek wiążących wapń w ludzkich kamieniach nerkowych w celu wyjaśnienia wpływu białek na wzrost kryształów

edmund.chen@wecistanche.com

Nerkakamica jest częstym schorzeniem, dotykającym 1,7–14,8 procent populacji przynajmniej raz w życiu1,2. W maksymalnie 50 procentach przypadków choroba powraca w ciągu 5 lat od pierwszego epizodu. Pomimo wagi tego problemu zdrowotnego terapia zapobiegawcza tworzenia kamieni jest niedostępna. Zrozumienie patogenezynerkatworzenie się kamieni jest niezbędne do ograniczenia występowania i nawrotównerkachoroba kamieni3. Około 80 procentnerkakamienie to kamienie ze szczawianu wapnia (CaOx)4,5. Kamienie CaOx składały się z ~90 procent fazy mineralnej, tj. CaOx, który jest dalej kategoryzowany na monohydrat szczawianu wapnia [Ca(C2O4)·H2O](COM) i dihydrat szczawianu wapnia [Ca(C2O4)·2H2O](COD) oraz stosunkowo niewielki ułamek materii organicznej, który został uznany za Department of Nefrro‑Urology, Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University, 1‑Kawasumi, Mizuho‑cho, Mizuho‑Ku, Nagoya 467‑8601, Japonia . 2Institute for Advanced Co-Creation Studies, Osaka University, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japonia. 3Graduate School of Engineering, Osaka University, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japonia. 4Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University, 1-5, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522, Japonia. 5 Wydział Nauk o Ziemi, Uniwersytet Tohoku, 6‑3 Aza‑Aoba, Aramaki, Aoba‑ku, Sendai 980‑8578, Japonia. 6Narodowe Muzeum Przyrody i Nauki, 4‑1-1‑1 Amakubo, Tsukuba 305‑0005, Japonia. 7Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217‑14, Hayashi‑cho, Takamatsu, Kagawa 761‑0395, Japonia. 8Laboratorium cienkich sekcji Tajiri, 3‑1‑11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577‑0849, Japonia. 9Institute of Laser Engineering, Osaka University, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japonia. *E-mail: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp

Słowa kluczowe:nerka; kamień nerkowy; choroba nerek; nerkowy; fizjologia nerek

CISTANCHE POPRAWI NIEWYDOLNOŚĆ NEREK/NEREK

jako matryca białkowa6. PatogenezanerkaTworzenie kamieni obejmuje wieloetapowe procesy obejmujące złożone interakcje między składnikami mineralnymi a macierzą białkową7,8. Ponad 100 gatunków białek zostało zidentyfikowanych wnerkakamienie9–11. Wśród nich wiadomo, że kilka białek, w szczególności białka wiążące wapń, odgrywa zasadniczą rolę w procesach tworzenia kamieni CaOx12-16. Specyficzne działanie tych białek było intensywnie badane na wielu etapach tworzenia się kamieni, w tym zarodkowania kryształów, wzrostu kryształów, agregacji kryształów i adhezji kryształów, w licznych badaniach krystalizacji in vitro17-19. Badania in vitro są przydatne do oceny wpływu określonych białek na określone etapy tworzenia kamieni. Jednak w rzeczywistych środowiskach powstawania kamieni, liczba białek działa jednocześnie, a skład moczu pod względem stężeń białek, jonów wapnia i szczawianów zmienia się. Ta troska zmotywowała nas do zbadania prawdziwego człowiekanerkakamienie, aby znaleźć prawdziwy wpływ białek na wzrost kryształów. W większości wcześniejszych badań identyfikacja białek wnerkakamienie przeprowadzono metodą spektroskopii masowej po kruszeniu i ekstrakcji9–11. W ten sposób traci się informację o przestrzennym rozmieszczeniu białek w kamieniu. W bardzo ograniczonych badaniach identyfikacja białek wnerkakamienie przeprowadzono z pociętymi odcinkami kamieni nerkowych, w których kryształy CaOx są całkowicie usuwane przez odwapnienie20,21. To podejście jest przydatne do znalezienia rozkładu białka wnerkakamienie, które potencjalnie pomagają zrozumieć specyficzny wpływ białka na tworzenie się kamieni. Jednak ogromna ilość informacji na temat formowania się kamienia, zarejestrowanych wnerkakryształy kamienia, giną w tej metodzie. Znaczenie informacji mineralnych kamieni nerkowych, które można uzyskać poprzez identyfikację faz krystalicznych i klasyfikację tekstury kryształów prowadzoną przy użyciu przekrojów plastra i polerowanych cienkich przekrojównerkakamienie za pomocą mikroskopii optycznej zostały wykazane przez ponad 70 lat wcześniejszych badań22,23.

Brak analizy do oceny dystrybucji białek z nieskazitelnymi kryształami CaOx wnerkakamienie były poważną przeszkodą w zrozumieniu formowania się kamienia. Skoordynowana ocena rozmieszczenia białek i faz krystalicznych/morfologii może dostarczyć istotnych informacji na temat historii powstawania kamieni. Wielokrotne barwienie immunofluorescencyjne (barwienie multi-IF) zostało wykorzystane do wykazania dystrybucji dwóch lub więcej białek w wielu typach tkanek miękkich próbek biologicznych24. Zastosowanie tej techniki do tkanek kostnych, które składają się z porowatych kryształów fosforanu wapnia, również dostarczyło istotnych informacji na temat dynamicznej regulacji homeostazy mineralnej kości25. Nie zostało to jednak wykorzystane do zbadanianerkakamienie złożone z gęstych i twardych kryształów, chociaż zastosowano pojedyncze barwienie immunofluorescencyjne w celu wykazania rozmieszczenia określonego białka w odwapnionychnerkakamienie, które nie przechowują informacji mineralnych20,21. W badaniu tym zbadano warunki, które umożliwiają barwienie multi-IFnerkapróbki kamienia, aby zachować oryginalne informacje o minerałach. Zbadaliśmy dystrybucję trzech różnych białek, osteopontyny (OPN),nerkowyfragment protrombiny 1 (RPTF-1) i kalgranulina A (Cal-A) w cienkich skrawkach kamieni CaOx. Białka te są powszechne w większości kamieni CaOx i są znane jako białka wiążące wapń, które potencjalnie wpływają na tworzenie kamieni CaOx26-28. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsze badanie, w którym wiele białek macierzy jest ko-wizualizowanych w anerkazłóg. Dalej interpretujemy różne efekty in vivo każdego białka na wzrost kryształów CaOx w oparciu o ich rozkłady, właściwości fizykochemiczne i złożone zmiany środowiska fizycznego każdego białka podczas tworzenia kamieni CaOx.

CISTANCHE POPRAWI DIALIZACJĘ NEREK/NEREK

Wyniki

Na podstawie obserwacji mikroskopowych połączonych z analizą FT-IR, domenynerkaPróbki kamienia podzielono na trzy rodzaje tekstur, które są zgodne z opisanymi w Schubert i Brien23: nieregularna tekstura złożona z euedrycznych kryształów ChZT (Typ 1, określany jako euedryczny agregat ChZT; ryc. 1c), mozaikowa tekstura złożona z nieregularnie zorientowanego COM kryształy (Typ 2, określane jako mozaika COM; Rys. 1f) i koncentrycznie laminowane kryształy COM (Typ 3, określane jako koncentryczne COM; Rys. 1i). Większość obserwowanych próbek kamieni CaOx składała się z tych trzech tekstur (tab. 1). Protokół barwienia Multi-IF zastosowany do próbek biologicznych został zastosowany do analizy cienkich skrawkównerkapróbki kamienia przygotowane typową metodą geologiczną. W przypadku aplikacji warunki wytrawiania cienkiego skrawka przed barwieniem zostały dostosowane i stwierdzono, że wizualizacja była skuteczna tylko wtedy, gdy wypolerowany cienki skrawek był lekko wytrawiony (za pomocą roztworu cytrynianu o pH 6,0 przez 1 min. ) przed typowym procesem barwienia. Barwienie multi-IF umożliwiło wspólną wizualizację trzech białek w różnych kolorach (OPN: zielony, RPTF-1: niebieski i Cal-A: czerwony) w trzech różnych teksturach kamienia.

Odkryliśmy, że każde białko wykazywało charakterystyczny wzorzec dystrybucji w zależności od jego lokalizacji w COM i COD. Agregaty euhedrylne ChZT stwierdzono w 7 próbkach na 15 próbek (tab. 1). Agregaty euhedrylne ChZT były obecne głównie na obrzeżach CaOxnerkakamienie (ryc. 1a–c). Wiadomo, że kryształy TES COD mają kształt czworokątnej dwupiramidy składającej się z powierzchni29. Wiele bipiramid ChZT ma również powierzchnię {110} na wierzchołkach obu piramid (ryc. 2b i ryc. uzupełniający S1). Obraz barwiony wielo-IF kryształów COD pokazano na Fig. 2a, a OPN okresowo pojawia się na powierzchni {110} COD, jak pokazano za pomocą białych strzałek na Fig. 2c. Ta powierzchnia jest tą samą powierzchnią wierzchołka bipiramidy, która nie pojawia się w typowym wzroście kryształów ChZT in vitro29. RPTF-1 pojawił się w postaci równoległych warstw wzdłuż powierzchni, z odstępami w mikrometrach, jak pokazano żółtą strzałką na rys. 2d. Ta kryształowa twarz jest charakterystyczna dla typowego wzrostu ChZT29. Cal-A był obecny poza kryształami ChZT, nie wykazując preferencyjnej adsorpcji na określonych powierzchniach (ryc. 2e). Te same wzorce rozmieszczenia zaobserwowano w innych próbkach kamienia (rysunek uzupełniający S2). Tekstura mozaikowa COM jest najbardziej rozpowszechnioną teksturą w kamieniach CaOx (ryc. 1d–f). Tę teksturę zaobserwowano w 12 próbkach z 15 (tabela 1). Barwienie Multi-IF mozaiki COM pokazano na ryc. 3a,b. OPN i RPTF-1 były obecne w kryształach COM (ryc. 3c, d). Odwrotnie, Cal-A był obecny wyłącznie wzdłuż granic ziaren (tj. na powierzchni ziaren COM) (rys. 3e). Następnie przeanalizowaliśmy profil intensywności linii białek, jak pokazano na ryc. 3a, aby szczegółowo ocenić każdy wzór rozmieszczenia białek (żółta linia na ryc. 4a). OPN i RPTF-1 wykazały wyższą intensywność w obszarze kryształu, podczas gdy Cal-A wykazał niższą intensywność w

powierzchnia kryształu (ryc. 4b). Wysoka intensywność Cal-A była obserwowana wyłącznie wzdłuż granic kryształów. Te rozkłady białek były widoczne w wielu próbkach, chociaż rozmiary i kształty ziaren COM różniły się (rysunek uzupełniający S3). Koncentryczna COM jest również typową teksturą w kamieniach CaOx (ryc. 1g–i). Znaleźliśmy tę teksturę w 10 próbkach z 15 (tabela 1). OPN, RPTF-1 i Cal-A zostały rozmieszczone w warstwach koncentrycznych (rys. 5a). OPN i RPTF-1 były obecne jako stałe i regularne warstwy w kryształach COM, tworząc przedział skali µm (ryc. 5b,c). Natomiast rozkład Cal-A składał się z nieregularnych i stosunkowo szerokoprzedziałowych warstw zlokalizowanych na zewnętrznej powierzchni kamienia (ryc. 5d). Obserwacja SEM wykazała warstwę szczelinową w pobliżu każdej warstwy Cal-A (ryc. 6a,b). Obie powierzchnie tworzące przestrzeń szczeliny były zajęte maleńkimi osadami, które wyraźnie różniły się od głównych kryształów COM tworzących koncentryczny COM (ryc. 6c, d). Profile intensywności linii tych białek w koncentrycznym COM wykazały skoki w każdym profilu białka (ryc. 4c, d). Profile OPN i RPTF-1 były podobne (tj. 5,58±2,70 µm/warstwę OPN i 5,99±2,56 µm/warstwę RPTF-1) (tabela uzupełniająca S1). Jednak warstwy Cal-A miały wyraźnie duże odstępy (tj. 23,17±18,57 µm/warstwę) niż OPN i RPTF-1. Podobne wzorce rozkładu i odstępy zaobserwowano w większości pozostałych 9 próbek, chociaż warstwa Cal-A nie była widoczna w kilku próbkach (rysunek uzupełniający S4 i tabela S1).

W niniejszym badaniu proporcje trzech tekstur w kamieniach CaOx i rozkłady trzech białek w trzech teksturach nie miały wyraźnego związku z wiekiem i płcią kamieniarza, chociaż ilość badanych kamieni nie była wystarczająca do analizy korelacji . Wiadomo, że OPN, RPTF-1 i Cal-A są obecne w kamieniach CaOx na podstawie wykrywania z ekstraktów proszków kamieni za pomocą elektrolizy9-11. Rozkłady OPN w mikroskali w odwapniających kamieniach CaOx techniką immunocytochemiczną wykazały rozkłady OPN w koncentrycznych blaszkach kamieni CaOx21,30. Obecna metoda żywo zwizualizowała lokalizacje trzech różnych białek we wcześniej uważanych „warstwach organicznych” (ryc. 7a,b). Wzorzec dystrybucji OPN, który pokazujemy w niniejszym badaniu w koncentrycznym COM, jest zgodny z wcześniejszymi obserwacjami. Odkryliśmy ponadto, że rozkład RPTF-1 w koncentrycznym COM jest prawie taki sam jak w OPN, podczas gdy rozkład RPTF-1 w kryształach COD jest inny niż w OPN. Odwrotnie, wzór dystrybucji Cal-A jest całkowicie różny od pozostałych dwóch białek. Te różne rozkłady OPN, RPTF-1 i Cal-A w mikroskali rejestrują historię formowania się kamieni CaOx.

Dyskusja

Podstawowy czynnik kontrolujący wbudowywanie białek do kryształów.Zarówno OPN, jak i RPTF{{0}} były obecne w euedrycznych kryształach ChZT, mozaikowych ziarnach COM i koncentrycznych COM (ryc. 2a, 3a i 5a). To odkrycie potwierdza, że ​​białka te są włączone zarówno do kryształów COD, jak i COM. Cal-A był obecny na zewnątrz euedrycznych kryształów ChZT i wokół mozaikowych ziaren COM (ryc. 2e i 3e). W przypadku koncentrycznego COM przestrzeń szczeliny zwykle występująca wokół warstw Cal-A sugeruje, że warstwy Cal-A nie są zawarte w kryształach, ale są rozmieszczone na powierzchni kryształów (rys. 5d i 6a-d). Te rozkłady wskazują, że OPN i RPTF-1 mają tendencję do inkorporowania do kryształów CaOx, podczas gdy Cal-A jest słabo inkorporowany. Na adsorpcję białek i włączanie ich do kryształów CaOx teoretycznie wpływa siła wiązania ich aminokwasowych łańcuchów bocznych i inne specyficzne właściwości odpowiednich białek, takie jak ujemny ładunek elektrostatyczny31,32. Ładunek netto wskazuje, że OPN i RPTF-1 są bardziej naładowane ujemnie niż Cal-A, z punktami izoelektrycznymi OPN, RPTF-1 i Cal-A wynoszącymi 3,5, 2,5–3.{{28} } i odpowiednio 6,5–7,033–35. Wiadomo, że OPN, RPTF-1 i Cal-A mają domeny wiążące wapń36–38. Domeny te mogą dodatkowo działać jako lokalne miejsca wiązania do rosnących powierzchni kryształów. Domeny wiążące wapń OPN, RPTF-1 i Cal-A mogą wiązać odpowiednio 10, 7 i 2 jony wapnia36–38. Tus, masowe i lokalne powinowactwa tych białek do dodatnio naładowanego Ca na powierzchni CaOx powodują różną wydajność włączania tych białek do CaOx. Wzrost kryształów przebiega poprzez włączanie jednostek wzrostu do stopni i miejsc załamań pojawiających się na powierzchni kryształów39,40 . Zgodność trójwymiarowa między białkami a rosnącymi powierzchniami kryształów określi

CISTANCHE POPRAWI BÓL NEREK/NEREK

zakres wbudowywania białka w powierzchnię kryształu. Białka o silnej zdolności wiązania do miejsc i etapów wzrostu są zwykle włączane do rosnącego kryształu bardziej efektywnie41-43. Opisane obecnie rozkłady i powinowactwa trzech białek do wapnia sugerują, że silne powinowactwo OPN i RPTF-1 ułatwia wiązanie i włączanie do kryształów COD i COM. Odwrotnie, Cal-A, który ma mniejsze powinowactwo, przywiera tylko do powierzchni kryształu, ale nie jest wbudowywany w kryształ. Wcześniejsze badanie, które wykazało wyższe szybkości włączania peptydów do COM przez bardziej ufosforylowane peptydy, potwierdza to wyjaśnienie43. Dyskusje te pozwolą nam przewidzieć rozkłady wielu innych białek na podstawie ich właściwości wiązania wapnia.

Selektywna absorpcja in vivo i hamujący wpływ OPN i RPTF‑1 na wzrost kryształów CaOx.Uważa się, że euedryczne kryształy ChZT, które są obecne głównie na obrzeżach kamienia CaOx, rosną z charakterystyczną laminowaną teksturą, w której tak zwana „warstwa materii organicznej” i „warstwa mineralna” występują naprzemiennie podczas wzrostu kryształów44,45. Chociaż dokładne przyczyny przesunięcia warstwy pozostają niejasne, potencjalne wyjaśnienia obejmują zmiany środowiska u ludzkiego gospodarza,nerkafizjologia i biochemiczne zmiany moczu oraz mechanizmy kinetycznego sprzężenia zwrotnego, które tworzą oscylacyjne struktury strefowe występujące w minerałach8. Obecne wyniki pokazują, że OPN i RPTF-1 tworzą laminowaną teksturę odpowiadającą odpowiednio {110} i {101} powierzchniom COD jako białka wewnątrzkrystaliczne, podczas gdy Cal-A nie jest zawarty w laminowanej teksturze (ryc. 2c -mi). Ten dowód in vivo powierzchniowej selektywnej adsorpcji/inkorporacji białek na/wnerkakryształy kamienne wskazują, że rozkłady białek nie są identyczne z tradycyjną „warstwą materii organicznej” obserwowaną pod mikroskopem optycznym (ryc. 7a). Dowody in vitro na selektywną adsorpcję OPN na krysztale COD przedstawili Chien i in. (2009 i 2018)46,47. Zgodnie z tymi doniesieniami, OPN wiąże się z typową krystalograficzną powierzchnią {110} ChZT i włącza się do fazy mineralnej, co jest zgodne z naszymi wynikami (ryc. 7b). Selektywna adsorpcja/inkorporacja powierzchni wynika prawdopodobnie ze zdolności wiązania wapnia każdego białka i/lub różnych zgodności molekularnych między grupami funkcyjnymi na cząsteczkach białka i rozmieszczenia jonów sieci na każdej powierzchni kryształu.

Według doniesień większość białek hamuje wzrost kryształów CaOx podczas tworzenia kamieni48,49. Uważa się, że hamowanie wzrostu kryształów przez peptydy następuje poprzez przypinanie i/lub blokowanie załamania41-43. W poprzednich badaniach in vitro OPN i RPTF-1 były znane jako inhibitory wzrostu kryształów CaOx48,49. Jednak zakres zahamowania wnerkaformacja kamienia pozostaje niejasna.

Obecna obserwacja pokazuje, że większość kryształów ChZT w kamieniu nerkowym ma typowy pokrój kryształów z twarzami (rys. 2b). Powierzchnie kryształów, które mają stosunkowo wolne tempo wzrostu, są na ogół dobrze rozwinięte40. To finansowanie wskazuje, że tempo wzrostu powierzchni COD jest powolne w porównaniu z innymi powierzchniami (np. {110}). Preferencyjną adsorpcję RPTF-1, która potencjalnie spowalnia wzrost kryształów przez wprowadzenie do ChZT, stwierdzono jako strukturę laminowaną wraz z powierzchniami (rys. 2d). Z drugiej strony, znaleźliśmy {110} powierzchnie jako struktury laminowane OPN wewnątrz kryształu COD (ryc. 2c). Powierzchnie {110} pojawiły się, gdy laminowana struktura OPN jest bardziej rozwinięta niż {110} powierzchnie kryształów COD wolnych od OPN uzyskane w badaniu in vitro46. Strona {110} ChZT z preferencyjną adsorpcją OPN nie jest ścianą kryształu, która pojawia się na ChZT o typowym pokroju kryształów47. Tus, absorpcja OPN na {110} ekstremalnie spowolniłaby względną szybkość wzrostu powierzchni, a spowolnienie to było na tyle powolne, że pojawiły się {110} ścianki. Innymi słowy, pojawienie się ścian {110} zmienia ogólny pokrój kryształów w wielu próbkach kamieni nerkowych. Kryształy COM pojawiają się jako tekstura mozaikowa lub tekstura koncentryczna (ryc. 3a i 5a). Zarówno OPN, jak i RPTF-1 są jednorodnie obecne w ziarnach COM w strukturze mozaikowej (rys. 3c,d). Tus, wpływ tych białek na tempo wzrostu tego typu COM nie jest jasny. W koncentrycznym COM kryształy przypominające listwę ułożone są promieniście od środka na zewnątrz50. Kryształowe powierzchnie kryształów przypominających listwę nie są jasne, ale zewnętrzna powierzchnia kulistego COM, która jest wystawiona na działanie moczu, powinna mieć te same krystalograficzne powierzchnie. Obecne wyniki wyraźnie pokazują, że OPN i RPTF-1 mają podobne profile linii dystrybucji, w których rozprowadzają się okresowo w koncentrycznej COM jako warstwy o podziałce około 4 do 6 µm (ryc. 4c, d, 5b, c i Tabela uzupełniająca S1). Wskazuje to, że OPN i RPTF-1 mają nieznaczną różnicę w adsorpcji i włączaniu na określonych powierzchniach kryształów COM wystawionych na działanie moczu. Poprzednie prace in vitro wykazały, że OPN ma wpływ hamujący na wzrost COM {100}, {121} i {010} twarze 51. Gdy weźmie się pod uwagę ten efekt hamujący, obecny wynik wskazuje, że koncentryczny wzrost COM został zahamowany przez OPN i prawdopodobnie przez RPTF-1, ponieważ RPTF-1 ma podobną zdolność wiązania wapnia, a zatem ma podobną skuteczność włączania do COM.

Rysunek 7. Schemat rozmieszczenia białek w trzech głównych teksturach w CaOx. (a) Rozmieszczenie matrycy białkowej jest rozważane w poprzednich badaniach (kolor biały: faza mineralna kolor czarny: materia organiczna). (b) Specyficzna dystrybucja białek stwierdzona w niniejszym badaniu (zielony: osteopontyna (OPN), niebieski: fragment protrombiny nerkowej 1 (RPTF-1) i czerwony: kalgranulina A (Cal-A). Typ 1 idiomorficzny ChZT, typ 2 mozaika COM i koncentrycznie laminowany COM Type3.

In vivo wpływ Cal‑A na wzrost kryształów CaOx.Adsorpcja Cal-A na specyficznych powierzchniach kryształów zarówno kryształów COM, jak i COD nie była widoczna w niniejszym wyniku (rys. 2a i 3a). Cal-A ma niższą zdolność wiązania wapnia niż OPN i RPTF-1 i był obecny na zewnątrz euedrycznych kryształów ChZT i wokół ziaren mozaiki COM bez laminowanej struktury (ryc. 2a, e i 3a, e). Wiadomo jednak, że Cal-A hamuje wzrost kryształów CaOx in vitro28. Tus, Cal-A mógł działać jako cząsteczka środka powierzchniowo czynnego, która wpływa na morfologię i szybkość wzrostu kryształów bez włączania do kryształu39,40,52. W normalnych warunkach moczu (tj. bez nieregularnie wysokiego stężenia Cal-A), Cal-A może mieć mniejszy wpływ hamujący niż OPN i RPTF-1 na wzrost kryształów COM i COD od OPN i RPTF{{17} } hamują rozwój stopni na powierzchniach kryształów poprzez przypinanie i/lub blokowanie przez wbudowanie w kryształy. Dlatego też zdolność białek do wiązania wapnia w kamieniach nerkowych pomogłaby ocenić stopień ich hamującego wpływu na wzrost CaOx. , 5d i tabela uzupełniająca S1). Cal-A został zidentyfikowany w moczu kamieniarzy28. W związku z tym naturalnie powinny wystąpić wahania jego stężenia w moczu. Jednak ze względu na mniejsze powinowactwo do jonów wapnia, niewielkie wahania stężenia Cal-A mogą nie być rejestrowane w teksturze COM. Cal-A jest wydalany z moczem nieokresowo jako białka przeciwzapalne w odpowiedzi na stan zapalny53,54. Tus, nieokresowe warstwy Cal-A mogą od czasu do czasu rejestrować wysokie stężenia Cal-A w moczu z powodu nieregularnych zmian środowiskowych, takich jak infekcja, uraz i krwawienie. Jego hamujący wpływ na wzrost COM będzie silnie zależeć od jego stężenia wokół rosnących kryształów, ponieważ kilka peptydów ma taką zależność od wzrostu kryształów kalcytu42. Cal-A może słabo spowalniać wzrost COM przez częściowe zajmowanie rosnącej powierzchni, gdy jego stężenie wokół kryształu jest niskie, ponieważ białko nie jest podatne na włączanie do CaOx. W koncentrycznym COM warstwy szczelinowe otoczone maleńkimi osadami znalezionymi podczas obserwacji SEM prezentują niemal identyczne miejsca, jak warstwy Cal-A znalezione w obrazowaniu multi-IF (ryc. 6a-d). Dlatego też, gdy warstwa Cal-A staje się gruba z powodu jej nieregularnie wysokiego stężenia w wyniku pewnych zmian biologicznych, Cal-A może działać jako silny inhibitor wzrostu CaOx poprzez szerokie zajmowanie rosnącej powierzchni. Zapalenie, które jest wyzwalaczem wydzielania Cal-A, może również wpływać na inny etap tworzenia się kamieni, ponieważ w eksperymentach z użyciem model kamienia nerkowego myszy16.

Możliwość zastosowania obrazowania multi‑IF do ogólnego tworzenia się kamieni nerkowych.Obecna praca rozszerzyła zastosowanie obrazowania multi-IF białek na twardsze próbki biomineralne, tj. kamienie nerkowe. Nukleację kryształów, wzrost kryształów, agregację kryształów i adhezję kryształów uważano za ważne etapy tworzenia kamieni nerkowych. W badaniach in vitro stwierdzono, że OPN, RPTF-1 i Cal-A są inhibitorami zarodkowania, wzrostu i agregacji CaOx48,49. Obecne rozszerzone zastosowanie obrazowania multi-IF dostarcza dowodów in vivo na hamujący wpływ wzrostu CaOx przez białka, który został sugerowany w poprzednich badaniach in vitro. Badania nad wpływem białek na każdym etapie przeprowadzono w badaniach in vivo na myszach, a także w licznych badaniach in vitro14,15,26. Na przykład, na podstawie eksperymentów in vivo na myszach donoszono o krytycznej renoprotekcyjnej roli OPN jako inhibitora tworzenia kryształów i inhibitora adhezji kryształów26, podczas gdy promowanie adhezji kryształów do komórek nabłonka kanalików przez OPN i wzmocnienie kamienia CaOx tworzenie zostały opisane w oparciu o nowsze eksperymenty in vivo z użyciem myszy z nokautem OPN14,15. Zupełnie inna morfologia kryształów znaleziona w kamieniach nerkowych myszy z nokautem OPN również wspiera działanie OPN na wielu etapach tworzenia kamieni nerkowych. Niniejsza metoda wizualizacji byłaby użyteczna w ocenie efektów białkowych w tych badaniach in vitro na myszach, a nawet przydatna w ocenie różnych etapów tworzenia kamieni nerkowych u ludzi. Ta nowatorska analiza pozwoliłaby nam zinterpretować wpływ różnych białek in vivo na tworzenie się kamieni CaOx, co może otworzyć drogę do badań patologicznych i spersonalizowanej medycyny w leczeniu kamicy nerkowej u ludzi.

Metody

Oświadczenie etyczne. Projekt badawczy przedstawiony w niniejszym artykule został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną podyplomowej szkoły medycznej uniwersytetu w Nagoya City. Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Od wszystkich badanych uzyskano pisemną świadomą zgodę zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez radę komisji etycznej.

Zbieranie kamienia i przygotowywanie odcinków kamiennych. Kamienie nerkowe pobrano od pacjentów i przeanalizowano na uniwersytecie miasta Nagoya w Japonii. Piętnaście próbek kamieni nerkowych CaOx zostało wybranych z naszych tysięcy kolekcji ludzkich kamieni nerkowych w oparciu o informacje z masowej spektroskopii w podczerwieni (IR) i przygotowano cienkie skrawki. Za pomocą analizy IR oszacowano nasypowy skład mineralogiczny kamienia. W badaniu kamieni nerkowych zastosowano metodykę petrologicznego cięcia cienkich przekrojów, pierwotnie zaprojektowaną do badań geologicznych55. Próbki kamieni nerkowych zostały w całości zatopione w żywicy epoksydowej i pocięte. Przekrój oszlifowano ścierniwami (SiC i Al2O3), a następnie polerowaną powierzchnię przyklejono do szklanego szkiełka za pomocą żywicy epoksydowej. Przeprowadzono drugie cięcie, aby wykonać próbkę o grubości 1- mm równolegle do szklanego szkiełka. Próbka została następnie wypolerowana do grubości 20–30 µm i wykończona pastą polerską za pomocą zawiesiny diamentowej.

Mikroskopia polaryzacyjna i spektrofotometria w podczerwieni z transformacją Fouriera.Cechy optyczne każdego kryształu składającego się na kamienie nerkowe obserwowano za pomocą mikroskopii polaryzacyjnej na odcinkach fragmentów kamieni o grubości 20-30 µm. Wskaźnik powierzchni każdej płaszczyzny ChZT został określony przez porównanie obserwacji z typowym kształtem kryształu ChZT obliczonym przez VESTA56. Na podstawie cech optycznych dokonano klasyfikacji kryształów, a następnie analizowano je spektrofotometrem w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT/IR6100, JASCO). Zakres liczby falowej pomiaru wynosił 7800–350 cm-1. Wszystkie pomiary przeprowadzono w temperaturze otoczenia. Wielkość plamki pomiarowej ustalono na 20x20 µm2. Fazy ​​krystaliczne zidentyfikowano na podstawie otrzymanego widma IR z bazą danych RRUFF.

Wielokolorowe barwienie immunofluorescencyjne macierzy białkowej.Skrawki kamieni użyte do analizy faz mineralnych wykorzystano również do analizy rozkładów białek za pomocą barwienia Multi-IF. Cienkie skrawki potraktowano roztworem cytrynianu (pH 6,0) przez 1 min w celu minimalnego trawienia. Skrawki przemywano solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie blokowano przez 60 min w 1% albuminie surowicy bydlęcej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z Tween 20 (PBST). Po zablokowaniu skrawek inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze otoczenia. Podstawowymi stosowanymi przeciwciałami były mysie monoklonalne anty-kalgranulina A (rozcieńczenie 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), królicze poliklonalne anty-osteopontyna (rozcieńczenie 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631). ), oraz fragment 1 monoklonalnego anty-ludzkiej protrombiny owcy (rozcieńczenie 1:500, Cedarlane Ontario, Kanada, CL20111AP). Skrawki następnie płukano 3 razy PBS przez 10 min przed inkubacją z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godz., chroniono przed światłem. Zastosowane fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała drugorzędowe to przeciwciała przeciwko króliczej IgG (H plus L) krzyżowo-adsorbowane sprzężone z Alexa Fluor 488, anty-mysie IgG (H plus L) krzyżowo-adsorbowane sprzężone z Alexa Fluor 546 i anty-owcze IgG (H plus L) Zaadsorbowany krzyżowo sprzężony z Alexa Fluor 647. Po intensywnym 3-krotnym płukaniu PBS przez 10 min, fluorescencję wykrywano przy użyciu konfokalnej mikroskopii autofluorescencyjnej (Nikon A1R). Zebrane długości fal wzbudzenia i emisji obejmowały wzbudzenie 487 nm (emisja zebrana między 500 a 550 nm), wzbudzenie 561 nm (emisja zebrana między 570 a 620 nm) i 639 nm (emisja zebrana między 663 a 738 nm) dla OPN, RPTF{{ 46}} i Cal-A, odpowiednio. W części próbek zaobserwowano autofluorescencję (AF), ale intensywność sygnału była znacznie niższa niż sygnały białkowe omówione w tym badaniu. Oceniano również wiązanie przeciwciał, które nie są specyficzne dla białek docelowych. Potwierdzono brak sygnałów IF z nieswoistego przeciwciała. Testy kontroli negatywnej przeprowadzono w celu oceny braku sygnałów fałszywie dodatnich (rysunek uzupełniający S5). Do barwienia przeciwciał zastosowano kontrole izotypowe w celu wykrycia jakiegokolwiek niespecyficznego wiązania. Konkretnie, podstawowymi przeciwciałami stosowanymi jako kontrolami były królicze (DA1E) mAb IgG XP kontrola izotypu (rozcieńczenie 1:100 Cell Signaling), mysie (G3A1) mAb IgG1 kontrola izotypu (rozcieńczenie 1:100 Cell Signaling) i owiec izotyp mAb IgG (1 :100 rozcieńczenie Novus) przy użyciu tych samych znakowanych fluorescencyjnie drugorzędowych przeciwciał jak powyżej. Profile linii skonstruowano za pomocą ImageJ, pokazując najwyższy i najniższy punkt kontrastu odpowiednio jako 100 procent i 0 procent dla każdego białka.