Natalenamidy A–C, cykliczne tripeptydy z Actinomadura Sp. RB99

Abstrakcyjny:

W ostatnich latach nasiliły się badania nad biochemią bakterii związanych z owadami. W połączeniu z analitycznymi procesami dereplikacji, badania te zapewniają potężną strategię identyfikacji strukturalnie i / lub biologicznie nowych związków. Niesyntetyzowane rybosomalnie cykliczne peptydy mają szerokie spektrum bioaktywności i wysoki potencjał leczniczy.

Tutaj opisujemy odkrycie trzech nowych cyklicznych tripeptydów: natalenamidy A – C (związki 1–3). Związki te zostały zidentyfikowane w bulionie hodowlanym grzybów związanych z termitami Actinomadura sp. RB99 przy użyciu metody dereplikacji opartej na chromatografii cieczowej (LC)/ultrafiolecie (UV)/spektrometrii masowej (MS). Struktury chemiczne nowych związków (1–3) ustalono na podstawie analizy kompleksowych metod spektroskopowych, w tym jednowymiarowych (1H i 13C) i dwuwymiarowych (1H-1}H-COSY, HSQC, HMBC) magnetyczno-nuklearnych spektroskopii rezonansowej (NMR) wraz z danymi ze spektrometrii mas z jonizacją przez elektrorozpylanie o wysokiej rozdzielczości (HR-ESIMS). Bezwzględne konfiguracje nowych związków zostały wyjaśnione za pomocą analizy Marfeya. Dzięki kilku testom bioaktywności dla tripeptydów odkryliśmy, że związek 3 wykazywał znaczące działanie hamujące na wytwarzanie melaniny indukowane przez 3-izobutyl-1-metyloksantynę (IBMX). Działanie związku 3 było podobne do działania kwasu kojowego, związku szeroko stosowanego jako materiał kosmetyczny o działaniu wybielającym skórę.

Jasna, gładka i delikatna skóra zawsze była celem orientalnych kobiet. Badania i rozwój środków wybielających do produktów do pielęgnacji skóry opierają się głównie na hamowaniu aktywności tyrozynazy.

Związki zawierające pierścienie benzenowe lub fenolowe struktury hydroksylowe mają potencjalne działanie wybielające, takie jak obecnie powszechnie stosowana substancja wybielająca arbutyna, która może wywierać działanie wybielające poprzez hamowanie aktywności tyrozynazy.

Odkryliśmy, że Cistanche deserticola ma działanie wybielające. Główny składnik aktywny Cistanche deserticola, glikozydy fenyloetanoidowe, jest rodzajem naturalnego związku glikozydowego. Badania wykazały, że glikozydy fenyloetanoidowe mogą hamować aktywność tyrozynazy i produkcję melaniny w melanocytach ludzkiego naskórka oraz działać wybielająco. skuteczność środka.

Kliknij proszek ekstraktu cistanche tubulosa

Słowa kluczowe:

termit rosnący na grzybach; Actinomadura sp.; tripeptydy; natalenamidy A-C; efekty wybielające skórę.

1. Wstęp

Analiza chemiczna ochronnych symbiontów bakteryjnych owadów hodowlanych wzbudziła w ostatnich latach duże zainteresowanie wśród chemików zajmujących się produktami naturalnymi [1–5]. Przy użyciu najnowocześniejszych procesów dereplikacji opartych na magnetycznym rezonansie jądrowym (NMR)/spektrometrii mas (MS) i ekologicznych testach biologicznych odkryto imponującą liczbę strukturalnie intrygujących produktów naturalnych, w tym kilka cyklicznych peptydów nie syntetyzowanych na rybosomach z mikrobiologicznych symbiontów [6]. Najbardziej znane przykłady obejmują przeciwgrzybiczą dentigerumycynę, cykliczny depsipeptyd wyizolowany z Pseudonocardia sp. [7] oraz gerumycyny A – C, cykliczne depsypeptydy zawierające kwas piperazowy zidentyfikowane w Pseudonocardia sp. [8].

Wykazano, że cykliczne peptydy wykazują szeroki zakres aktywności biologicznych, wspierając kilka syntetycznych podejść do tych farmakologicznie obiecujących struktur [9-12]. Ponad 40 cyklicznych leków peptydowych jest obecnie sprzedawanych i szeroko stosowanych w środowiskach klinicznych, a średnio co roku na rynek wchodzi około jeden nowy cykliczny lek peptydowy [13].

W ramach naszych ciągłych wysiłków zmierzających do zidentyfikowania strukturalnie nowych i / lub bioaktywnych metabolitów wtórnych z drobnoustrojów związanych z termitami [14-17], skupiliśmy się na Actinomadura sp. RB99, wyizolowany z termitów rosnących na grzybach, Macrotermes natalensis. Nasza strategia dereplikacji oparta na chromatografii cieczowej (LC)/ultrafiolecie (UV)/spektrometrii mas (MS) dostarczyła potencjalnie nowych bioaktywnych produktów naturalnych. W tym badaniu przedstawiamy izolację i identyfikację chemiczną trzech nowych cyklicznych tripeptydów, natalenamidu A – C (związki 1–3, ryc. 1), przy użyciu metody dereplikacji opartej na LC / UV / MS, a także ich oceny biologiczne pod kątem cytotoksyczności , przeciwzapalne i wybielające skórę.

2. Wyniki i dyskusja

2.1. Chromatografia cieczowa (LC)/ultrafiolet (UV)/spektrometria masowa (MS)-na podstawie izolacji związków 1–3

Actinomadura sp. RB99 wyizolowano z powierzchni robotnicy termitów (M. natalensis). Analiza filogenetyczna prawie kompletnej sekwencji 16S rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (rRNA) sugeruje, że szczep RB99 należy do rodzaju Actinomadura, z najbliższym sąsiadem Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Późniejsza analiza oparta na LC/UV/MS wzbogaconych ekstraktów kultur ujawniła zestaw charakterystycznych absorpcji UV z unikalnymi pikami jonów molekularnych zawierających atomy azotu.

Aby zidentyfikować odpowiednie metabolity i zbadać ich aktywność, przeprowadzono fermentację na dużą skalę przy użyciu zoptymalizowanych warunków wzrostu (100 płytek agarowych z 2 L agaru ISP2, pH 6, 10 dni w temperaturze 30°C) oraz ustaloną procedurę obróbki i wstępnego oczyszczania. stosowane [17]. Późniejsze frakcjonowanie pod kontrolą LC-UV/MS i powtarzalna półpreparatywna wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) doprowadziły do ​​wyizolowania trzech metabolitów o unikalnym wzorze NMR/MS. Przeprowadziliśmy badania wzrostu i pożywek przy użyciu różnych soli (NaCl, KBr 1–3 procent) i składów pożywek (pożywki ISP{16}}), aby naśladować środowisko naturalne i stymulować produkcję metabolitów, co również doprowadziło do obecności trzech nowych metabolity (patrz rysunek dodatkowy S19).

2.2. Wyjaśnienie strukturalne związków

Natalenamid A (1) otrzymano w postaci bezpostaciowego proszku. Określono, że wzór cząsteczkowy 1 to C19H25N3O5 z jonu cząsteczkowego z adduktem sodu przy m/z 398,1691 [M plus Na] plus (obliczono dla C19H25N3O5Na, 398,1692) przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją w trybie jonów dodatnich o wysokiej rozdzielczości (HR- ESIMS). Widmo w podczerwieni (IR) wykazało silne pasmo absorpcji przy 1670 cm-1, co sugeruje obecność grup amidowych w cząsteczce. Szczegółowa analiza danych 1H NMR 1 (tabela 1) wskazała typowe sygnały szkieletu peptydowego, wykazujące dwa sygnały metylowe (δH 0,91 (3H, d, J=7).{{29 }} Hz, H-3) i 0,92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), trzy sygnały metylenowe (δH 1,95 (1H, m, H-7} a), 2,27 (1 H, m, H-8 a), 2,36 (1 H, m, H-8 b), 2,48 (1 H , m, H{{5{57}}}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} } a) i 3,20 (1H, dd, J=14.{91}}, 5,0 Hz, H-12 b)), cztery sygnały metinowe (δH 2,02 (1H , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8, 5, 4,5 Hz, H-6) i 4,63 (1H, dd, J=8,0, 5,0 Hz, H-11)) oraz pięć nakładających się protonów aromatycznych (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18) i 7,24 (2H, m, H-15/17)).

Widmo 13C NMR (Tabela 1), wspomagane widmami HSQC i HMBC, wykazało łącznie 19 rezonansów węglowych odpowiedzialnych za dwa sygnały metylowe (δC 18,9 i 19,9), trzy sygnały metylenowe (δC 27.{8}}, 30 .6 i 38,8), dziewięć sygnałów metinowych (δ C 32,1, 55,6, 58,0, 60,4, 127,8, 129,5 (× 2) i 130,6 (× 2)), w tym pięć węgli aromatycznych, jeden węgiel olefinowy sygnał (δC 138,8) i cztery sygnały węgla karbonylowego (δC 173,2, 173,3, 174,8 i 181,3). W połączeniu z powyższymi danymi spektroskopowymi, szczegółowa kontrola dwuwymiarowego (2D) NMR (eksperymenty 1H-1H COSY, HSQC i HMBC) ujawniła obecność trzech aminokwasów w 1: glutaminianu (Glu), fenyloalaniny ( Phe) i waliny (Val) (ryc. 2). Łączność tych aminokwasów została określona przez korelacje HMBC H-1/C-5 i C-19, H-11/C-10 i C{ {50}} i H-6/C-5 i C-10 (Rysunek 2).

Aby zidentyfikować konfigurację absolutną 1, zastosowano metodę Marfeya do określenia stereochemii wielokrotności -H (C-1, C-6 i C-11). Kwaśne hydrolizaty 1 i standardowych aminokwasów (L/D-Glu, Phe i Val) poddano derywatyzacji 1-fluoro-2,4-dinitrofenylo-5-L-alaniną amid (L-FDAA). Następnie derywatyzowaną mieszaninę 1 i aminokwasów wzorcowych analizowano metodą LC/MS w celu zbadania ich czasu retencji. Wszystkie konfiguracje absolutne ugrupowań Glu, Phe i Val określono jako formy L, w oparciu o czasy retencji pochodnych L-FDAA wynoszące 1 w porównaniu z czasami retencji standardowych aminokwasów. W ten sposób struktura 1 została wyjaśniona jako cykliczny tripeptyd pokazany na rycinie 1.

Natalenamid B (2) wyodrębniono w postaci bezpostaciowego proszku. Jego wzór cząsteczkowy (C20H27N3O5) wydedukowano na podstawie pików jonów cząsteczkowych z adduktem wodoru i sodu przy 390,2032 [M plus H] plus (obliczono dla C20H28N3O5, 390,2029) i 412,1849 [M plus Na] plus (obliczono odpowiednio dla C20H27N3O5Na, 412,1848). W porównaniu ze wzorem cząsteczkowym i danymi widmowymi NMR 1, związek 2 okazał się mieć dodatkową grupę CH2 w szkielecie peptydowym. Kompleksowa analiza jednowymiarowych (1D) (1H i 13C NMR) i 2D NMR (1H-1H COSY, TOCSY, HSQC i HMBC) widm 2 ujawniła istnienie trzech reszt aminokwasowych: Glu, Phe i Leu (leucyna). Sekwencję tych aminokwasów skonstruowano na podstawie korelacji HMBC H-1/C-6 i C-20, H-12/C-11 i C -20 i H-7/C-6 i C-11 (Rysunek 2). Aby określić konfigurację absolutną 2, przeprowadzono derywatyzację reszt Glu, Phe i Leu za pomocą L-FDAA, a następnie przeanalizowano metodą LC/MS. W danych LC/MS wykryto L-Glu, L-Phe i L-Leu porównując czasy retencji dla pochodnych L-FDAA 2 z tymi dla standardowych aminokwasów. Tak więc struktura chemiczna 2 została ustalona jako cykliczny tripeptyd pokazany na rycinie 1.

Dane HR-ESIMS w trybie dodatnim natalenamidu C (3) wykazały jony cząsteczkowe z adduktem wodoru i sodu przy 424,1870 [M plus H] plus (obliczone dla C23H26N3O5, 424,1872) i 446,1694 [M plus Na] plus (obliczone dla C23H25N3O5Na, 424.1692). Sugerowało to, że jego wzór cząsteczkowy to C23H25N3O5. Szczegółowa analiza widm 1D i 2D NMR 3 wykazała, że ​​jego struktura chemiczna była podobna do struktury 2, z wyjątkiem tego, że Leu został zastąpiony przez Phe w 3. Łączność trzech zidentyfikowanych aminokwasów w 3 została zweryfikowana za pomocą korelacji HMBC H-1/C-9 i C-23, H-15/C-14 i C-23 oraz H-10/ C-9 i C-14 (Rysunek 2). Stosując metodę Marfeya do związku 3, wyjaśniono, że absolutne konfiguracje wielokrotności -H (C-1, C-10 i C-15) to jeden L-Glu i dwa L -Części Phe. W związku z tym kompletną strukturę 3 określono, jak pokazano na rysunku 1.

Natalenamidy A – C to tricykliczne peptydy, przypuszczalnie pochodzenia nierybosomalnego. Obecnie kilka bioaktywnych tripeptydów cyklicznych zostało scharakteryzowanych jako produkty naturalne: cytotoksyczne 17-członowe tripeptydy cykliczne (np. OF4949 I–IV) wyizolowane z Penicillium rugulose [18]; przeciwgrzybicze sklerotomie AK, zidentyfikowane w bulionie fermentacyjnym bakterii halotolerujących [10]; i antyproliferacyjne psychrofilne E, wyizolowane z mieszanej kultury dwóch szczepów grzybów z rodzaju Aspergillus pochodzących z alg morskich [19].

2.3. Aktywności biologiczne związków 1-3

Ponieważ doniesiono, że cykliczne peptydy wykazują szeroki zakres aktywności biologicznych, skutki biologiczne wyizolowanych cyklicznych tripeptydów ({{0}}) oceniono za pomocą trzech bioaktywności. Cytotoksyczność związków 1-3 badano wobec czterech linii komórek rakowych (komórki raka piersi MCE7, komórki raka szyjki macicy HeLa, komórki ludzkiego raka płuc A549 i komórki raka wątroby HepG2) w różnych stężeniach (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 i 100 uM). Związek 1 nie wpływał na żywotność komórek MCF-7, HeLa ani A549. Jednak traktowanie komórek HepG2 100 µM związku 1 zmniejszyło żywotność komórek do 78,5 plus 3,2 procent (figura 3). Związek 2 zmniejszał żywotność komórek HeLa i A549 odpowiednio do 82,{27}},1 procenta i 73,{30}},0 procenta, ale nie wpływał na żywotność MCF-7 ani Komórki HepG2 (ryc. 3). Związek 3 nie wpływał na żywotność żadnej linii komórkowej (figura 3).

Następnie wykorzystano makrofagi RAW264.7 do zbadania przeciwzapalnego działania wyizolowanych związków. W celu wyeliminowania błędów w produkcji NO spowodowanych zmieniającymi się wskaźnikami przeżywalności komórek, zbadano nietoksyczne stężenia każdego związku. Jak pokazano na rycinie 4, związki 1–3 miały niewielkie działanie cytotoksyczne w komórkach RAW264.7 (ryc. 4A – C) i nie wywierały wpływu hamującego na wytwarzanie NO w komórkach RAW264.7 stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) (ryc. 4D – F) .

Hamujące działanie związków 1–3 na zawartość melaniny w komórkach B16F10 zbadano jako dowód ich działania wybielającego skórę (ryc. 5). Ponieważ zmiany żywotności komórek powodują błędy w produkcji i pomiarze melaniny, najpierw zbadaliśmy wpływ związków 1–3 na przeżycie komórek B16F10. Związki 1–3 nie wywierały działania cytotoksycznego w komórkach B16F10 w żadnym z zastosowanych stężeń (ryc. 5A – C). Następnie oceniliśmy hamujący wpływ związków na produkcję melaniny indukowaną 3-izobutyl-1- metyloksantyną (IBMX) w komórkach B16F10 (ryc. 5D – F). IBMX, dobrze znany stymulator melanogenezy, indukuje znaczny wzrost produkcji melaniny po pojedynczym zabiegu w komórkach czerniaka. Spośród ocenianych związków, związek 3 (w stężeniu 5–100 µM) wykazywał znaczące działanie hamujące syntezę melaniny za pośrednictwem IBMX w sposób zależny od dawki. Kwas kojowy, nasza kontrola pozytywna, był szeroko stosowany jako materiał kosmetyczny o działaniu wybielającym skórę [20]. Hamujący wpływ związku 3 na produkcję melaniny indukowaną przez IBMX był podobny do działania kwasu kojowego (Figura 5F), co sugeruje, że związek 3 działa jako silny inhibitor produkcji melaniny indukowanej przez IBMX w komórkach czerniaka B16F10.

Ponadto związek 3 był zanieczyszczony niewielką liczbą zanieczyszczeń, które określono jako analogi kwasów tłuszczowych na podstawie interpretacji danych spektroskopowych NMR i analizy LC / MS (materiały dodatkowe, rysunki S11 – S15 i S23). Aby zidentyfikować aktywność zanieczyszczeń, przeprowadzono dodatkowe eksperymenty z analogami kwasów tłuszczowych pod kątem ich działania hamującego na produkcję melaniny indukowaną przez IBMX w komórkach B16F10, co ujawniło, że badane związki nie miały działania wybielającego (materiały dodatkowe, rysunek S24). Tak więc, chociaż nie możemy wykluczyć, że zanieczyszczenia w związku 3 są odpowiedzialne za działanie hamujące na produkcję melaniny indukowaną przez IBMX, wydaje się to mało prawdopodobne.

3. Materiały i metody

3.1. Ogólne procedury eksperymentalne

Widma w podczerwieni zarejestrowano na spektrometrze Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA). Widma jonizacji przez elektrorozpylanie i HR-ESIMS mierzono na spektrometrze masowym do chromatografii cieczowej (LC) SI-2/LCQ DecaXP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Widma NMR, w tym eksperymenty 1H – 1H COSY, HSQC i HMBC, przeprowadzono przy użyciu spektrometru Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, USA) działającego przy 800 MHz (1H) i 200 MHz (13C), z przesunięcia chemiczne podane w ppm (δ). Preparatywna HPLC wykorzystywała pompę Waters 1525 Binary HPLC z Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Żel krzemionkowy 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) i żel krzemionkowy RP-C18 (230–400 mesh, Merck) zastosowano do chromatografii kolumnowej. Półpreparatywna HPLC wykorzystywała system Shimadzu Prominence HPLC z SPD { {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultrafiolet-widzialne (UV-Vis) detektory (Shimadzu, Tokio, Japonia). Analizy LC/MS przeprowadzono na systemie Agilent 1200 Series HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) wyposażony w detektor z matrycą diodową i spektrometr masowy ESI serii 6130 z analitycznym materiałem Kinetex (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Płytki Merck F254 wstępnie powlekane żelem krzemionkowym i płytki RP{33}} F254s zastosowano do cienkich chromatografia dwuwarstwowa (TLC) Plamy wykrywano na TLC w świetle UV lub przez ogrzewanie po spryskaniu roztworem aldehydu anyżowego i kwasu siarkowego.

3.2. Materiał mikrobiologiczny

Actinomadura sp. RB99 wyizolowano z powierzchni robotnicy termitów z rodzaju M. natalensis (kolonia Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) 2 stycznia {13}}10. Biomateriał umieszczono w czystych plastikowych torebkach i przetworzono w ciągu jednego dnia od pobrania. Termity przemyto sterylną dejonizowaną wodą, a bakterie wyizolowano przez wysianie otrzymanych zawiesin na pożywki o niskiej zawartości składników odżywczych z chityną (na litr: 4 g chityny, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 i 20 g agaru) [21]. Izolaty o morfologii podobnej do Actinobacteria przenoszono na agar ISP2 (na litr: 10 g ekstraktu słodowego, 4 g ekstraktu drożdżowego, 4 g glukozy i 20 g agaru) i hodowano dalej aż do uzyskania czystych izolatów.

3.3. Ekstrakcja DNA i amplifikacja reakcji łańcuchowej polimerazy

Actinomadura sp. RB99 hodowano w płynnej pożywce bogatej w składniki odżywcze ISP2 przez pięć do siedmiu dni w temperaturze 30°C. Komórki zebrano i ekstrahowano genomowy DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania genomowego DNA GenJet (nr K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta z następującymi zmianami: (a) traktowanie lizozymem przedłużono do 40 minut i (b) leczenie proteinazą K przedłużono do 40 minut. DNA oznaczano ilościowo fotometrycznie przy użyciu spektrometru Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Do badań filogenetycznych amplifikowano gen 16S rRNA przy użyciu zestawu starterów 1492R/27F. Każdą reakcję amplifikacji przygotowano w końcowej objętości reakcji 25 µl zawierającej 7,25 µl wody destylowanej, 5 µl buforu HF, 5 µl każdego startera (2,5 µM), {{10}},5 µl dNTP (10 µM), 0,25 µl polimerazy DNA Phusion High-Fidelity (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) i 2 µl wyekstrahowanego DNA (matryca). Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzono w następujących warunkach: 98 ◦C przez 38 s; 32 cykle 98 ◦ przez 30 s, 52 ◦C przez 45 s, 72 ◦C przez 1 min 20 s; i końcowe wydłużanie w 72 ◦C przez 8 min. Produkt PCR wizualizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a reakcje PCR oczyszczano stosując zestaw do oczyszczania PCR (Thermo Scientific). Fragmenty DNA sekwencjonowano w GATC (Konstanz, Niemcy).

3.4. Sekwencjonowanie i identyfikacja gatunków

Sekwencje oceniano pod kątem czystości i niedopasowań za pomocą BioEdit [22]. Sekwencje do przodu i do tyłu uzyskane dla każdego szczepu zostały połączone za pomocą BioEdit i przetestowane pod kątem chimer przy użyciu DECIPHER (//decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Otrzymane sekwencje zdeponowano w GenBank (numer dostępu: KY558684). Analizy blastów z prawie kompletnymi sekwencjami 16S rRNA (1368 bp) przeprowadzono przy użyciu bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) (referencyjne sekwencje RNA). Wyniki wskazują, że szczep RB99 należy do rodzaju Actinomadura. Sekwencje pierwszych 10 trafień pobrano z bazy danych NCBI i dopasowano do sekwencji 16S rRNA Actinomadura sp. RB99 przy użyciu usługi dopasowywania sekwencji Sina [23]. Zrekonstruowano dwa różne drzewa filogenetyczne za pomocą algorytmów łączenia sąsiadów lub algorytmów największej wiarygodności przy użyciu oprogramowania MEGA w wersji 7.0.26 [24–26]. Ewolucyjny model odległości Tamury i Nei został wykorzystany do wygenerowania ewolucyjnych macierzy odległości dla algorytmów największej wiarygodności i łączenia sąsiadów, z usunięciem kompletnych luk i brakujących danych [27]. W przypadku algorytmu największej wiarygodności zastosowano dyskretny rozkład gamma (plus G), a model zmienności szybkości pozwolił na ewolucyjną niezmienność niektórych miejsc (plus I). W przypadku algorytmu łączenia sąsiadów zmienność szybkości między witrynami modelowano za pomocą rozkładu gamma (plus G). Wartości ufności węzłów oceniono za pomocą analiz bootstrap na podstawie 1000 kroków resamplingu [28].

3.5. Ekstrakcja i izolacja

Actinomadura sp. RB99 hodowano w 5{55}} ml bulionu ISP2 przez siedem dni w 3{64}} ◦C (hodowla wstępna) i użyto do zaszczepienia 100 płytek agarowych ISP2. Płytki inkubowano przez 10 dni w temperaturze 30°C, pocięto na małe kawałki, skonsolidowano i zanurzono na noc w MeOH. Fazę MeOH przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Ekstrakt MeOH (20 g) rozpuszczono w wodzie destylowanej (700 ml), a następnie trzykrotnie rozdzielono rozpuszczalnikiem EtOAc (700 ml), otrzymując 1,1 g pozostałości. Frakcję rozpuszczalną w EtOAc (1,1 g) z ekstraktu MeOH załadowano na kolumnę z żelem krzemionkowym (230–400 mesh) do chromatografii i eluowano gradientowym układem rozpuszczalników CH2Cl2-MeOH (100:1 do 1: 1, v/v). Dało to sześć frakcji (A – F), które poddano analizie opartej na LC-UV/MS. Analiza dereplikacji przy użyciu własnej biblioteki spektralnej UV zasugerowała istnienie pomniejszych analogów peptydów we frakcji E. Wykazywały one prosty wzór UV przy około 220 nm i unikalne piki jonów o formule cząsteczkowej zawierające atomy azotu. Frakcję polarną E (233 mg) frakcjonowano metodą preparatywnej HPLC w układzie faz odwróconych (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, USA) stosując CH3CN/H2O (1:9 do 9:1, obj. /v, układ gradientowy, szybkość przepływu: 5 ml/min), aby uzyskać pięć podfrakcji (E1–E5). Podfrakcję E2 (27 mg) oczyszczono za pomocą półpreparatywnej HPLC w układzie faz odwróconych (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) z 33% MeOH/H2O (układ izokratyczny, szybkość przepływu: 2 ml/min. ) uzyskując związek 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Związki 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) i 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) wyizolowano z podfrakcji E3 (15 mg) metodą półpreparatywnej fazy odwróconej HPLC z elucją 43 procent MeOH/H2O (układ izokratyczny, szybkość przepływu: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamid A (1)

3.5.2. Natalenamid B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Kwasowa hydroliza związków 1–3

Łączną ilość 0,4 mg każdego związku (1–3) hydrolizowano z 6 N HCl (500 µl) przez 1 godzinę w 110 ◦C. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej hydrolizaty 1–3 odparowano w celu usunięcia śladów HCl. Do mieszanin hydrolizatu dodano wodę destylowaną (500 µl), a następnie odparowano w celu usunięcia śladów HCl; proces ten przeprowadzono trzykrotnie.

3.7. Oznaczanie konfiguracji bezwzględnej aminokwasów w 1–3

Mieszaniny hydrolizatów (1–3), jak również wzorcowe aminokwasy (L/D-Leu, Glu, Phe i Val) rozpuszczono w 1 N NaHCO3 (100 µl), a następnie potraktowano z 50 ul L-FDAA (10 mg/ml w acetonie). Kolejno każdy hydrolizat ogrzewano przez 10 min w temperaturze 80°C. Każdą mieszaninę zadano 2 N HCl (50 ul) i zatężono pod próżnią. Pozostałość rozpuszczono w 300 ul MeOH. Każdą podwielokrotność (5 µl) pobraną z mieszanin hydrolizatu wstrzyknięto bezpośrednio do LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, szybkość przepływu 0,3 ml/min) i pełny skan w dodatnim i ujemnym tryby jonowe (zakres skanowania od m/z 100 do 1000) zastosowano do identyfikacji czasów retencji aminokwasów derywatyzowanych L-FDAA.

Fazę ruchomą, składającą się z kwasu mrówkowego w wodzie destylowanej ({{0}},1% obj./obj.) (A) i acetonitrylu (B), prowadzono w następującym układzie gradientowym: 20–40 procent (B) przez 10 minut, 100 procent (B) izokratycznie przez 5 minut, a następnie 20 procent (B) izokratycznie przez 5 minut, aby przeprowadzić procedurę płukania kolumny po zakończeniu cyklu. Czasy retencji derywatyzowanych L-FDAA aminokwasów stosowanych jako wzorce wynosiły 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H]) plus), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus) i 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus). Czasy retencji derywatyzowanych hydrolizatów 1–3 wynosiły L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) i L-Val (22,5 min) od 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) i L-Leu (25,6 min) z 2; i L-Glu (16,9 min) i L-Phe (25,7 min) od 3.

3.8. Testy cytotoksyczne z wykorzystaniem komórek rakowych

Komórki MCF7, HeLa i A549 zakupiono z American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Komórki HepG2 zakupiono z Korean Cell Line Bank (Seul, Korea). Komórki MCF7 hodowano w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. Komórki HeLa i A549 hodowano w minimalnej podstawowej pożywce Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. Komórki HepG2 hodowano w pożywce Minimum Essential Medium uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. Warunki hodowli utrzymywano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Cytotoksyczność badano na tych czterech ludzkich liniach komórkowych (MCF7, HeLa, A549 i HepG2) przy użyciu zestawu do oznaczania żywotności komórek EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonia). Pokrótce, 5 x 103 komórek/studzienkę wysiano w 96-płytkach studzienkowych. Po 24 godzinach komórki traktowano związkami we wskazanych stężeniach. Po 72 godzinach inkubacji zastosowano zestaw do oznaczania żywotności komórek EZ-CyTox. Po 2 godzinach inkubacji zmierzono absorbancję przy 450 nm z odniesieniem przy 620 nm. Żywotność komórek obliczono jako procent kontroli.

3.9. Działanie przeciwzapalne

Linię komórkową mysich makrofagów RAW264.7 zakupiono z American Type Culture Collection. Komórki hodowano w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny i inkubowano w 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Żywotność komórek mierzono przy użyciu zestawu do wykrywania żywotności komórek Ez-Cytox. Komórki inkubowano w 96- płytkach studzienkowych w stężeniu 2500 komórek na studzienkę przez 24 godziny i traktowano wskazanymi stężeniami związków 1–3 przez 24 godziny. Następnie do każdej studzienki dodano odczynniki Ez-Cytox. Gęstość optyczną przy 450 nm mierzono po 1 godzinie za pomocą czytnika mikropłytek (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) w celu oszacowania żywotności komórek. W oddzielnym doświadczeniu komórki RAW264.7 inkubowano w 96-płytkach z dołkami w stężeniu 30,{23}} komórek na dołek przez 24 godziny. Po głodzeniu surowicy przez 12 godzin komórki traktowano wstępnie związkami 1–3 przez 1 godzinę, a następnie stymulowano 1 µg / ml LPS przez 24 godziny. Absorbancję pożywki hodowlanej w reakcji Griessa mierzono przy 540 nm przy użyciu czytnika mikropłytek PowerWave XS w celu oszacowania poziomu NO.

3.10. Pomiar zawartości melaniny

Linię komórkową czerniaka myszy, B16F10, zakupiono z American Type Culture Collection. Komórki hodowano w DMEM z dodatkiem 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny i inkubowano w 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Komórki B16F10 inkubowano w 6 cm szalkach hodowlanych w ilości 250, 000 komórek na studzienkę w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 100 µg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny przez 24 godziny. Komórki przemyto dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie stymulowano IBMX i inkubowano z różnymi stężeniami związków 1–3 lub kwasu kojowego (kontrola pozytywna) w pożywce RPMI bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 10 procent FBS, 100 jednostek /ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny przez 24 i 48 godzin. Absorbancję pożywki hodowlanej mierzono przy 405 nm przy użyciu czytnika mikropłytek PowerWave XS w celu oszacowania zawartości melaniny. Wyniki wyrażono jako krotność zmiany w porównaniu z kontrolą (komórki niestymulowane przez IBMX).

3.11. Analiza statystyczna

Wszystkie dane, w tym żywotność komórek, produkcję NO i melaniny przedstawiono jako wartość średnią i odchylenie standardowe (SD). Wszystkie testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach i powtórzono co najmniej trzy razy. W tym badaniu uwzględniono tylko kilka powtórzeń każdego eksperymentu komórkowego, dlatego do analizy statystycznej przyjęto metodę analizy nieparametrycznej. Do analizy statystycznej każdej zmiennej zastosowano test Kruskalla-Wallisa. Do wszystkich analiz wykorzystano pakiet statystyczny SPSS (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS Statistics wersja 21, Boston, MA, USA). Istotność statystyczną uznano przy wartości p niższej niż 0,05.

4. Konkluzje

Nasz raport zawiera analizę chemiczną izolatów drobnoustrojów z termitów rosnących na grzybach. Trzy nowe cykliczne tripeptydy, natalenamidy A – C (1–3), zostały wyizolowane i scharakteryzowane strukturalnie z bulionu hodowlanego Actinomadura sp. RB99 przy użyciu metody dereplikacji opartej na LC-UV/MS. Wszystkie wyizolowane związki oceniono pod kątem aktywności biologicznej przy użyciu testów komórkowych. Związki 1 i 2 wykazywały słabą cytotoksyczność odpowiednio wobec komórek HepG2 i HeLa/A549. Żaden z wyizolowanych związków nie wykazywał znaczącego wpływu hamującego na wytwarzanie NO w komórkach RAW264.7 stymulowanych LPS. Związek 3 wykazywał znaczące działanie hamujące syntezę melaniny za pośrednictwem IBMX w sposób zależny od dawki. Efekt był podobny do kwasu kojowego, który jest używany jako materiał kosmetyczny o działaniu wybielającym skórę.

Podziękowanie:

Jesteśmy głęboko wdzięczni Michaelowi Thomasowi-Poulsenowi (Wydział Biologii Uniwersytetu Kopenhaskiego, Dania) za wsparcie naszych badań terenowych.

Konflikt interesów:

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Bibliografia

1. Newman, DJ; Cragg, GM Produkty naturalne jako źródła nowych leków od 1981 do 2014. J. Nat. Szturchać. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Miszra, BB; Tiwari, VK Produkty naturalne: ewoluująca rola w przyszłym odkrywaniu leków. Eur. J. Med. chemia 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Naturalne produkty z drobnoustrojów związanych z owadami. Beilstein J. Org. chemia 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Bakteryjne symbionty w systemach rolniczych stanowią strategiczne źródło odkryć antybiotyków. J. Antybiotyk. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Ponowne pojawienie się naturalnych produktów do odkrywania leków w erze genomiki. Nat. Wielebny Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, Hiszpania; Fischbachb, MA; Walsh, CT Całkowita biosynteza: Rekonstytucja szlaków poliketydowych i nierybosomalnych in vitro. Nat. Szturchać. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Och, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, nadtlenek polienu z mutualistycznej Streptomyces sp. Org. Łotysz. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Usiądź, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Zmienne architektury genetyczne wytwarzają praktycznie identyczne cząsteczki w bakteryjnych symbiontach mrówek hodujących grzyby. proc. Natl. Acad. nauka Stany Zjednoczone 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Niski, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Judin, AK; Zaretsky, S. Racjonalne projektowanie inhibitorów kalpainy w oparciu o peptydomimetyki kalpastatyny. J. Med. chemia 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Cykliczne tripeptydy z halotolerującego grzyba Aspergillus sclerotiorum PT 06-1. J. Nat. Szturchać. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Mosznikowa, A.; El-Sayed, NS; Adochit, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andriejew, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Nowe cykliczne peptydy wrażliwe na pH. nauka Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosynteza cyklicznego tripeptydu psychrofilowego zawierającego nitro. J. Antybiotyk. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Cykliczne peptydy terapeutyczne: przeszłość, teraźniejszość i przyszłość. bież. Opinia. chemia Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycyna ze Streptomyces sp. związanego z termitami. chemia nauka 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A – C, glikozydy izoflawonoidowe z termitów związanych ze Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Szturchać. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; i in. Makrotermycyny A – D, glikozylowane makrolaktamy z termitów Amycolatopsis sp. M39. Org. Łotysz. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; i in. Izolacja, biosynteza i chemiczne modyfikacje rubterolonów A-F: Rzadkie alkaloidy tropolonu z Actinomadura sp. 5–2. chemia Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, nowe inhibitory aminopeptydazy B. II. Wyjaśnienie struktury. J. Antybiotyk. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debet, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, cykliczny tripeptyd z gąbki Vanuatu Reniera n. sp. J. Nat. Szturchać. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Środki hipopigmentujące: Zaktualizowany przegląd aspektów biologicznych, chemicznych i klinicznych. Pigm. Czerniak komórkowy Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, Dania; Poulsen, M. Badanie potencjału promieniowców jako symbiontów obronnych w termitach rosnących na grzybach. Mikrob. eko. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Przyjazny dla użytkownika edytor dopasowywania sekwencji biologicznych i program do analizy dla Windows 95/98/NT. Kwasy nukleinowe Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Dokładne, wysokoprzepustowe dopasowanie wielu sekwencji genów rybosomalnego RNA. Bioinformatyka 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Metoda łączenia sąsiadów: nowa metoda rekonstrukcji drzew filogenetycznych. Mol. Biol. ewolucja 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Drzewa ewolucyjne z sekwencji DNA: podejście maksymalnego prawdopodobieństwa. J. Mol. ewolucja 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Molekularna analiza genetyki ewolucyjnej wersja 7. 0 dla większych zbiorów danych. Mol. Biol. ewolucja 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Oszacowanie liczby podstawień nukleotydów w regionie kontrolnym mitochondrialnego DNA u ludzi i szympansów. Mol. Biol. ewolucja 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Granice ufności dotyczące filogenezy: podejście wykorzystujące bootstrap. Ewolucja 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Dostępność próbek:

Próbki związków nie są dostępne u autorów.

For more information:1950477648nn@gmail.com