Efekty neuroprotekcyjne i mechanizmy procyjanidyn In Vitro i In Vivo Część 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

3. Dyskusja

Liczne badania wykazały, że komputery PC wykazują silne działanie przeciwrodnikowe i antyoksydacyjne ]25-27I, a stres oksydacyjny spowodowany nadmierną produkcją ROS i/lub upośledzeniem systemu obrony antyoksydacyjnej odgrywa kluczową rolę w chorobach neurodegeneracyjnych [ -6,28,29]. Jednak efekty neuroprotekcyjne i mechanizmy PC dotyczące uszkodzeń oksydacyjnych są nadal niejasne. Dlatego w badaniu tym zbadano wpływ i mechanizmy komputerów PC w neuroprotekcji.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

W niniejszym badaniu odpowiednie stężenia PCs poprawiły poziomy enzymów antyoksydacyjnych, w tym GSH-Px, CAT i SOD, ale zmniejszyły poziomy ROS i MDA w modelach uszkodzeń oksydacyjnych w porównaniu z pomiarami z użyciem samego H, O. Te obecne odkrycia były zgodne z wcześniejszymi badaniami, które sugerowały, że suplementacja o niskiej zawartości PC w diecie może poprawić aktywność GSH-Px, CAT i SOD u prosiąt odsadzonych od maciory [30]. Inne badanie sugerowało również, że komputery PC znacznie zwiększają aktywność CAT i SOD oraz zmniejszają zawartość MDA, poprawiając w ten sposób jakość nasienia kóz [31].

Cistanche może poprawić odporność

Szlak Nrf2/ARE jest ważnym szlakiem antyoksydacyjnym [32-34]. Normalnie Nrf2 znajduje się w cytoplazmie, gdzie jest związany z białkiem hamującym Keap135,36]. Po stymulacji H2O2, Nrf2 dysocjuje od Keap1, inicjuje endogenny system obrony antyoksydacyjnej, a następnie przemieszcza się do jądra [34,37,38]. Następnie wchodzi w interakcję z ARE, aby aktywować szereg genów chroniących komórki i antyoksydacyjnych, w tym GCLC, GCLM, NOO1 i HO-139,40]. W odpowiedzi na stres oksydacyjny, podobnie jak zmiany obserwowane podczas stymulacji H-O2, Nrf2 dysocjuje od Keap1 w cytozolu, a następnie jest translokowany do jądra, wiążąc się z sekwencją ARE, aby aktywować transkrypcję genów krioprotekcyjnych [41,42]. Zaobserwowaliśmy, że odpowiednie stężenia PC ułatwiły jądrową lokalizację Nrf2 w warunkach uszkodzenia H, O2-w komórkach PC12. Co więcej, odpowiednie stężenia PCs znacznie podwyższyły poziomy ekspresji NOO1, HO-1, GCLM i GCLC, z których wszystkie mogą bezpośrednio działać w celu eliminacji wolnych rodników i cząsteczek utleniających [43]. W związku z tym wyniki te wykazały, że odpowiednie stężenia PC zwiększały poziomy szlaku Nrf2/ARE. Następnie wyciszono gen Nfr2 za pomocą siRNA Nrf2 w celu dalszej oceny roli aktywacji Nrf2/ARE w neuroprotekcji za pośrednictwem PC przed uszkodzeniem oksydacyjnym wywołanym przez H, O2-. Komórki transfekowane siRNA Nrf2-wykazywały wyraźny spadek ekspresji Nrf2. Jednocześnie odkryliśmy, że nokaut Nrf2 znosił pośredniczoną przez PC ochronę przed osłabieniem żywotności komórek traktowanymi H2O, a nokaut Nrf2 znosił również działanie antyoksydacyjne PC. Wyniki te były zgodne z wcześniejszym badaniem, które sugerowało, że poprawa aktywacji szlaku Nrf2/ARE przyczynia się do neuroprotekcji [44]. Dlatego niniejsze wyniki wskazują, że szlak Nrf2/ARE może stanowić farmakologiczny cel PC w zapobieganiu neurodegeneracji.

4. Materiały i metody 4.1. Chemikalia i odczynniki

H2O2 zakupiono od HUSHI (HUSHI, Szanghaj, Chiny). CCK-8, NAC został zakupiony od Beyotime (Beyotime, Szanghaj, Chiny). PC, 2',7/-dioctan dichlorofluoresceiny, zestawy diagnostyczne MDA, GSH-Px, SOD i zestawy diagnostyczne CAT zostały zakupione w Solarbio (Solarbio, Pekin, Chiny). RNAi Plus, zestaw odczynników PrimeScript RT z gDNA Eraser i SYBR Premiks Ex Tag II zakupiono od Takara (Takara, Shiga, Japonia). Nrf2-siRNA, siRNA kontrolne i lipofektaminę 2000 otrzymano z GenePharma (GenePharma, Szanghaj, Chiny). Następujące przeciwciała pierwszorzędowe i odpowiadające przeciwciała drugorzędowe otrzymano z firmy Proteintech (Proteintech, Wuhan, Chiny): Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, lamin B i GAPDH.

4.2. Hodowlę komórkową

Komórki PC12 uzyskano z National Collection of Authenticated Cell Cultures. Komórki utrzymywano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i penicyliną-streptomycyną ?100 U/ml;100 ug/ml? w nawilżanym inkubatorze w 37°C z 5% CO2.

4.3. Testy żywotności komórek

Komórki PC12 wysiano na płytki 96-studzienkowe z gęstością 1x104 komórek/studzienkę. Komórki eksponowano na różne stężenia PCs lub NAC 20 μM） przez 24 godziny, po czym inkubowano je z 200 μM H2O2 przez 24 godziny. Następnie do każdej studzienki dodano 10 μLof CCK-8roztwór i inkubowano przez 1 godzinę, po czym zmierzono absorbancję przy 450 nm.

4.4. Utrzymanie ryb

Zgoda etyczna na wykorzystanie zwierząt została wydana przez Komitet Ochrony Zwierząt i Użytkowania Zwierząt Centrum Doświadczalnego Zwierząt na Uniwersytecie Zhejiang (ZJU2000125). Dorosły danio pręgowany (Danio rerio, szczep AB) uzyskano z laboratorium zwierząt na Uniwersytecie Zhejiang i utrzymywano w temperaturze 28±1C w 14/10-h cyklu światło/ciemność [21J. Ryby karmiono Artemia nauplii dwa razy dziennie. Aby wyprodukować zarodki, dorosłego danio pręgowanego umieszczono na noc w zbiornikach hodowlanych w stosunku samiec:samica 1:1. Tarło rozpoczęło się w ciągu 2 godzin po włączeniu świateł następnego ranka. Zarodki hodowano w wodzie zarodkowej w temperaturze 28 stopni [45].

4.5. Pomiary ROS

Aby zmierzyć produkcję ROS in vivo, larwy danio pręgowanego (szczep AB), 3 dni po zapłodnieniu （pdf） zostały wystawione na NAC（30 μM） lub różne stężenia PC w nieobecności lub w obecności 300 μM H,O, przez 4 dni. Następnie, w 7 pdf, różne grupy leczenia przeniesiono do płytki 24-dołkowej (10 larw danio pręgowanego na grupę) potraktowanych 20 uM roztworu dioctanu 2',7'-dichlorofluoresceiny i inkubowano przez 60 min w ciemność w 28,5 stopnia C [46]. Następnie larwy przemyto trzykrotnie pożywką zarodkową w celu usunięcia nadmiaru dioctanu 2'7'-dichlorofluoresceiny. Zabarwione larwy były następnie obserwowane i obrazowane pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym Olympus. Intensywność fluorescencji każdej pojedynczej larwy określono ilościowo za pomocą oprogramowania Image].

Aby zmierzyć wytwarzanie ROS in vitro, komórki PC12 wysiano na 6-studzienkowe płytki z gęstością 2x10* komórek/studzienkę. Komórki eksponowano na różne stężenia PC lub NAC (20 µM) przez 24 godziny, a następnie inkubowano z 200 µM HO przez 24 godziny. Komórki inkubowano z 10 µM roztworu dioctanu 2',7'-dichlorofluoresceiny w ciemności przez 30 min; następnie roztwór barwnika usunięto, a komórki przemyto trzy razy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Następnie komórki obserwowano i obrazowano pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym Olympus. Intensywność fluorescencji komórek określono ilościowo za pomocą oprogramowania Image].

4.6.Ocena MDA, GSH-Px, SOD i CAT

Larwy danio pręgowanego （szczep AB） at3 pdf eksponowano na NAC （30 μM） lub różne stężenia PC w nieobecności lub w obecności 300 μM H2O, przez 4 dni. 7 danio pręgowanego dpf znieczulono tetrakainą i homogenizowano po eutanazji na lodzie. MDA, GSH-Px, CAT i SOD analizowano jednocześnie, zgodnie z instrukcjami producenta. Każdy eksperyment zawierał 20 larw, a każdy zmierzony wskaźnik powtórzono w trzech powtórzeniach.

Komórki PC12 wysiano na płytki 6-dołkowe z gęstością 2x10* komórek/dołek. Komórki eksponowano na różne stężenia PC lub NAC (20 µM) przez 24 godziny, a następnie inkubowano z 200 µM H2O przez 24 godziny. Następnie komórki PC12 zebrano i inkubowano z buforem do lizy. Aktywności MDA, GSH-Px, SOD i CAT mierzono przy użyciu odpowiednich zestawów testowych, zgodnie z protokołami każdego producenta. Każdy zmierzony wskaźnik powtórzono w trzech powtórzeniach.

4.7. Całkowita ekstrakcja RNA, odwrotna transkrypcja i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym

Larwy danio pręgowanego （szczep AB） w 3 dpf eksponowano na NAC（30 μM） lub różne stężenia PCs w nieobecności lub w obecności 300 μM H, O, przez 4 dni. Po traktowaniu RNA ekstrahowano przy użyciu RNAiso, zgodnie z instrukcjami producenta. RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu PrimeScript RT Kit z gumką do gDNA, zgodnie z instrukcjami producenta (Takara, Shiga, Japonia). Ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono za pomocą systemu Applied Biosystems Vi-7 Real-Time PCR z użyciem SYBR Premix Ex TaqII -aktyna została użyta jako gen referencyjny, a względną ekspresję genu obliczono za pomocą 2-AACt metoda. Stosowane sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 1.

4.8. Transfekcja siRNA Nrf2

Nrf2-siRNA został użyty do znokautowania Nrf2. Komórki PC12 wysiano na 6-studzienkowych płytkach hodowlanych, a następnie transfekowano siRNA Nrf2-siRNA (80 nM) lub siRNA kontrolnym przy użyciu Lipofectamine 2000, zgodnie z instrukcjami producenta.

4.9.Przygotowanie białka pełnokomórkowego, cytoplazmatycznego i jądrowego

Do ekstrakcji białka z całych komórek, komórki zebrano i inkubowano z buforem do lizy RIPA zawierającym 1% PMSF i 1% koktajlu inhibitorów proteazy przez 30 min na lodzie. Lizaty komórkowe odwirowano, a supernatant zebrano i przechowywano. W celu przygotowania frakcjonowania subkomórkowego próbki komórek poddano obróbce przy użyciu zestawu do ekstrakcji białek jądrowych i cytoplazmatycznych. Zawartość białka oznaczono za pomocą testu BCA. 4.10. Western Blotting

Porcjowane próbki białka rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeniesiono na membrany z difluorku poliwinylidenu. Bloty następnie inkubowano z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: Nrf2, Keapl, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B lub GAPDH. Następnie membranę płukano TBST przez 5 min; powtórzono to 5 razy. Następnie bloty inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą. Na koniec prążki białkowe zwizualizowano przy użyciu odczynnika do wykrywania Western blotting ECL-plus.

4.11. Test zachowania lokomotorycznego

Larwy danio pręgowanego （szczep AB） w 3 pdf zostały wystawione na NAC（30 μM） lub różne stężenia PCs w nieobecności lub w obecności 300 μM HO przez 4 dni. Następnie, w 7 pdf, potraktowane larwy umieszczono na płytkach 24-dołkowych (jedna ryba na dołek i 12 larw na grupę). Do pomiaru zachowania lokomotorycznego larw danio pręgowanego użyliśmy Any-labiryntu 4.73 i obliczyliśmy całkowitą odległość przebytą w ciągu 10 minut [47].

4.12.Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. W celu określenia istotności statystycznej zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) i testy wielokrotnego rozstępu Duncana, a różnice uznano za istotne, gdy p<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">

5. Wnioski

Podsumowując, niniejsze odkrycia wskazują, że PC wywierają działanie neuroprotekcyjne poprzez aktywację szlaku Nrf2/ARE i jego dalszych enzymów detoksykacji i enzymów antyoksydacyjnych. Podsumowując, komputery PC mogą mieć ochronny wpływ na zaburzenia neurodegeneracyjne.

Autorskie Wkłady:Konceptualizacja, JCandJZ.(Jiajin Zhu); metodologia, JC; oprogramowanie, YC; walidacja, YZ., JZ(Jiawen Zhao) i HY; analiza formalna, JC; dochodzenie, YC; zasoby, JZ(iajin Zhu); kuratorstwo danych, JC; pisanie — przygotowanie oryginalnego projektu, JC; pisanie – recenzja i redakcja, JZ.(iajin Zhu); wizualizacja, JC; nadzór, DL; administracja projektu, JZ(Jiajin Zhu); pozyskiwanie finansowania, JZ(Jiajin Zhu). Wszyscy autorzy przeczytali i zgodzili się na opublikowaną wersję rękopisu.

Finansowanie:Badania te nie otrzymały finansowania zewnętrznego.

Oświadczenie instytucjonalnej komisji rewizyjnej:Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyki Ochrony i Użytkowania Zwierząt Centrum Doświadczalnego Zwierząt Uniwersytetu Zhejiang (ZJU20200125). Oświadczenie o świadomej zgodzie: Nie dotyczy.

Oświadczenie o dostępności danych:Dane zawarte są w artykule. Konflikty interesów: Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Dostępność próbek: Próbki związków nie są dostępne u autorów.

Ten artykuł pochodzi z Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules