Neuroprotekcyjne działanie ekstraktu z liści Glochidion Zeylanicum przeciwko toksyczności wywołanej przez H2O2/glutaminian w hodowanych komórkach neuronalnych i toksyczności wywołanej przez A u Caenorhabditis Elegans 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

3.3.Neuroprotekcyjne działanie ekstraktu GZM przeciwko indukowanemu glutaminianem stresowi oksydacyjnemu w hodowanych komórkach neuronalnych (HT22 i Neuro-2a)

Aby zbadać, czy GZM działa przeciwko uszkodzeniom oksydacyjnym, zbadano wewnątrzkomórkowy poziom ROS. Dowody na toksyczność indukowaną glutaminianem w komórkach HT22 i Neuro-2a zostały pokazane przez zwiększoną wewnątrzkomórkową produkcję ROS (1.7-1.9-krotnie) (Figura 4a,b). Wytwarzanie wewnątrzkomórkowych ROS indukowane glutaminianem zostało wyraźnie zmniejszone przez wspólne traktowanie ekstraktem GZM (Figura 4a,b). Dalej zbadaliśmy endogenne enzymy antyoksydacyjne, aby wspierać ochronne działanie ekstraktu GZM po ekspozycji na glutaminian. Zmierzono ekspresję enzymów antyoksydacyjnych, w tym transferazy S-glutationowej (GST), peroksydazy glutationowej (GPx), katalazy (CAT) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD). W naszym poprzednim badaniu stwierdzono, że najwyższe stężenie ekstraktu GZM – 10 ug/mL – wykazuje silne działanie przeciwutleniające in vitro i in vivo [11]. Zgodnie z raportem, najwyższe stężenie ekstraktu GZM (10 ug/ml) wykazywało silną neuroprotekcję w komórkach HT22 i Neuro-2a (rysunki 2-4). Ponadto ekstrakt GZM (10 ug/ml) zwiększył ekspresję genów enzymów antyoksydacyjnych, w tym SOD1,SOD2, GPx, GST i GSTa2, zarówno w komórkach HT22, jak i Neuro-2a, z wyjątkiem CAT (Rysunek 4c, d ). Wyniki wskazują, że ekstrakt GZM chroni przed cytotoksycznością indukowaną glutaminianem/H2O2-poprzez hamowanie wewnątrzkomórkowej produkcji ROS i indukcję ekspresji enzymu antyoksydacyjnego.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

3.4. Wpływ ekstraktu GZM na ekspresję szlaków SIRT1/Nrf2

Aby określić mechanizm leżący u podstaw neuroprotekcyjnych efektów ekstraktu GZM, zbadaliśmy poziomy ekspresji SIRT1 i Nrf2. Odkryliśmy, że neurony traktowane GZM znacząco zwiększyły poziomy białka SIRT1 i Nrf2 (Rysunek 5a,b). Ponadto, leczenie GZM potencjalnie modulowało szlak sygnałowy SIRT1/Nrf2 – regulowane geny przeciwutleniaczy NQO1, GCLM, EAAT3 i SIRT1 (Figura 5c, d). Odkrycia wskazują, że ekstrakt GZM wzmacnia szlak sygnałowy SIRT1/Nrf2, aby promować obronę komórkową przed toksycznymi obrażeniami.

3.5.Wpływ ekstraktu GZM na aktywność wzrostu neurytów w komórkach neuro-2a

Do badania różnicowania neuronów jako przedstawicieli wykorzystano komórki Neuro-2a[18]. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, deprywacja surowicy (DMEM uzupełniona 1% FBS) indukowała rozrost neurytów w Neuro-2a [18]. Komórki Neuro-2a poddane działaniu ekstraktu GZM spowodowały wzmocnienie neurytogenezy. Potraktowane ekstraktem GZM komórki Neuro-2a zwiększyły długość neurytów (30,92 µm) i liczbę komórek zawierających neuryty (52,35 procent) w porównaniu z kontrolą (1 procent FBS) (długość neurytów, 16,30 µm; komórek, 22,26 procent) (Figura 6a,bg).

cistanche może przeciwdziałać starzeniu

Aby dodatkowo zapewnić występowanie aktywności odrostu neurytów, ekspresję markerów odrostu neurytów, białka związanego ze wzrostem 43 (GAP-43) [19] i teneuryny-4 (Dziesięć-4) [20] zostały ustalone. Ekstrakt GZM znacząco podwyższył ekspresję GAP-43 i Dziesięć-4 zarówno na poziomie mRNA, jak i białka w komórkach Neuro-2a w porównaniu z kontrolą DMSO (1 procent FBS ) (Figura 6c-f) sugerując wpływ ekstraktu GZM na neurytogenezę.

3.6. Neuroprotekcyjne działanie ekstraktu GZM przeciwko porażeniu wywołanemu przez A u C.elegans

W celu dalszego zbadania neuroprotekcyjnego działania ekstraktu GZM in vivo zastosowano transgeniczne szczepy C. elegans z ekspresją A. Najpierw zbadaliśmy wpływ ekstraktu GZM na porażenie wywołane przez A u transgenicznych robaków CL4176 i CL2006. W naszym poprzednim badaniu ekstrakt GZM wykazał odporność na stres oksydacyjny i właściwości wydłużenia życia u C. elegans przy nietoksycznym stężeniu （1-5 ug/mL）【11】. Szczep kontrolny CL802 (nie eksprymujący A) nie wykazywał porażenia, pomimo leczenia (dane nieprzedstawione) przy badanym stężeniu (1-5 ug/ml).cistanche wirkungOdkryliśmy, że robaki CL4176 traktowane ekstraktem GZM wykazywały znaczne opóźnienie w PT50 (czas potrzebny do sparaliżowania 50% nicieni) w porównaniu z kontrolą DMSO (Figura 7a) (Tabela S1, Materiały dodatkowe). Podobnie, ekstrakt GZM wykazywał również opóźnienie wywołanego przez A paraliżu transgenicznych robaków CL2006 w okresie dorosłości (Figura 7b). Wyniki sugerują, że ekstrakt GZM chroni C.elegans przed uszkodzeniami wywołanymi przez A.

3.7.Neuroprotekcyjne działanie ekstraktu GZM przeciwko defektom wywołanym przez A w zachowaniu chemotaksji u C.elegans

Aby potwierdzić neuroprotekcyjne działanie ekstraktu GZM u C.elegans, przeprowadzono test chemotaksji z użyciem robaków transgenicznych CL2122 i CL2355. Stwierdzono, że transgeniczne robaki CL235 eksprymują A 1-42 w komórkach neuronalnych, co skutkowało defektami wrażliwości na chemotaksję 【21】. Ponieważ ekstrakt GZM w stężeniu 1-5 ug/ml opóźnił porażenie opóźnione u transgenicznych robaków CL4176, do wszystkich następnych eksperymentów wybrano ekstrakt GZM o stężeniu 5 ug/ml. Aby określić potencjalny wpływ ekstraktu GZM na zachowanie chemotaksji, jako atraktant użyliśmy diacetylu. Wyniki wyrażono jako wskaźnik chemotaksji w porównaniu z nietraktowaną kontrolą. Po pierwsze stwierdziliśmy, że traktowanie ekstraktem GZM nie wpłynęło na zachowanie chemotaksji mutanta CL2122 (transgeniczny szczep kontrolny) (Figura 7d). Robaki CL2355 traktowane ekstraktem GZM wykazywały znacznie lepszą odpowiedź chemosensoryczną na atraktant (diacetyl) w porównaniu z nietraktowaną kontrolą (Figura 7c), co wskazuje, że ekstrakt GZM ma potencjał do poprawy zachowania chemotaktycznego u C. elegans przeciwko A.bioflawonoidy cytrusowePodsumowując, wpływ ekstraktu GZM na A-zależne zachowanie C. elegans może zapewnić możliwość rozszyfrowania neuroprotekcji za pośrednictwem ekstraktu GZM przed AD.

4. Dyskusja

Choroba Alzheimera (AD) jest schorzeniem neurodegeneracyjnym występującym powszechnie w populacjach osób starszych na całym świecie [1]. Obecnie nie ma zadowalającego leczenia szerokiego zakresu stanów patologicznych związanych z AD. Stres oksydacyjny jest silnie skorelowany z chorobami neurodegeneracyjnymi, szczególnie AD [3].korzyści cynomoriumNaturalne produkty zawierające silne przeciwutleniacze mogą być stosowane jako leczenie alternatywne lub do zapobiegania chorobom neurodegeneracyjnym. W obecnym badaniu zbadaliśmy wpływ ekstraktu GZM na neurodegenerację. Jest to pierwsze doniesienie opisujące neuroprotekcyjne działanie ekstraktu z liści GZ in vitro (hodowane komórki neuronalne HT22 i Neuro-2a) oraz in vivo (C.elegans).

Toksyczność neuronalna wywołana stresem oksydacyjnym jest uważana za jeden z głównych czynników powiązanych z rozwojem chorób neurodegeneracyjnych, w tym AD [3]. Wysoki poziom glutaminianu aktywuje produkcję ROS, prowadząc do neurotoksyczności, uszkodzenia komórek nerwowych, a ostatecznie do śmierci komórek nerwowych [4,6]. Ponadto nadtlenek wodoru (H2O2) jest powszechnym istotnym mediatorem stresu oksydacyjnego w komórkach neuronalnych [22]. W związku z tym w tym badaniu glutaminian i H2O2 zastosowano jako środki neurotoksyczne w celu wywołania śmierci komórek nerwowych. Do badania neuroprotekcyjnego działania przeciwko toksyczności glutaminianu wykorzystano mysie hipokampowe neuronalne komórki HT22 pozbawione jonotropowych receptorów glutaminianu [6]. Ponadto, mysie komórki nerwiaka niedojrzałego Neuro-2a są szeroko stosowane jako reprezentanci w badaniach nad wzrostem neurytów i różnicowaniem neuronów [23]. Najpierw określono neuroprotekcyjne działanie ekstraktu GZM przeciwko toksyczności wywołanej przez H-Oz/glutaminian przy użyciu komórek HT22 i Neuro-2a. Odkryliśmy, że ekstrakt GZM wywierał silne działanie neuroochronne przeciwko cytotoksyczności indukowanej glutaminianem/H2O2-w obu komórkach HT22 i Neuro-2a.

Stres oksydacyjny po ekspozycji na glutaminian może być przyczyną degradacji strukturalnej, uszkodzenia DNA i dysfunkcji mitochondriów, które odgrywają ważną rolę w śmierci komórek nerwowych [6]. W naszym badaniu żywotność komórek traktowanych samym glutaminianem była niezwykle niska (około 50% niższa) w porównaniu z nietraktowanymi komórkami kontrolnymi. Ponadto, znaczny wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu ROS wykryto w komórkach HT22 (1,7--krotny) i Neuro-2a (1,9-krotny) po traktowaniu glutaminianem w porównaniu z nietraktowaną kontrolą. W konsekwencji, cytotoksyczność indukowana glutaminianem w komórkach neuronalnych (HT22 i Neuro-2a) rzeczywiście była powiązana ze wzrostem wewnątrzkomórkowego ROS, co potwierdza poprzednie doniesienia [24]. Endogenne enzymy antyoksydacyjne, CAT, SOD, GST i GPx odgrywają zasadniczą rolę w neuroprotekcji poprzez zapobieganie uszkodzeniom komórek, w których pośredniczą ROS [25-27]Odkryliśmy, że ekstrakt GZM może przeciwdziałać cytotoksyczności wywołanej przez H-Oz/glutaminian poprzez hamowanie wewnątrzkomórkowe Produkcja ROS i zwiększenie ekspresji genów antyoksydacyjnych odpowiadających poprzedniemu doniesieniu, w którym ekstrakty GZ stymulowały ekspresję Sod-3 i Gst-4 u C.elegans [11].

Czynnik transkrypcyjny NRF2 (czynnik związany z czynnikiem jądrowym 2-czynnikiem erytroidalnym 2) jest głównym mechanizmem komórkowym odpowiedzi na stres oksydacyjny i uszkodzenie komórek [28-31]. Szlak sygnalizacyjny SIRT1/Nrf2 jest ważnym szlakiem sygnalizacyjnym równoważącym stres oksydacyjny, który jest aktywnie zaangażowany w różne choroby neurodegeneracyjne [25,26]. SIRT1 zarządza czynnikami transkrypcyjnymi, w tym Nrf2, który działa jako główny regulator systemu obrony antyoksydacyjnej. Nrf2 wiąże się z elementem odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE), prowadząc do zwiększonej ekspresji enzymów detoksykujących (faza II) (GPx, GSTol i GSTa2) oraz genów antyoksydacyjnych (SOD,CAT,NQO1,GCLM i EAAT3)[25,26] .Zgodnie z doniesieniami ekspresja białek SIRT1 i Nrf2 oraz genów antyoksydacyjnych, w tym NQO1, GCLM, EAAT3 i SIRT1, uległa zwiększeniu po leczeniu GZM. Ponadto, przez ekspresję endogennego enzymu antyoksydacyjnego, SOD, GPx, GSTol i GSTa2 również uległy znacznemu zwiększeniu, co może być spowodowane aktywacją Nrf2/ARE. Wyniki są zgodne z naszym poprzednim badaniem, w którym wykazano, że ekstrakty GZleaf zapewniają odporność na stres oksydacyjny u C. elegans poprzez mechanizmy zależne SKN-1/Nrf-2 [11]. Łącznie nasze odkrycia sugerują, że właściwości obronne ekstraktu GZM w hodowlach neuronalnych (HT22 i Neuro-2a) obejmują szlak sygnałowy SIRT1/Nrf2. Wykazano, że NRF2 wpływa na kierunek metabolizmu glutaminy pochodzącego z glutaminy, w tym na wytwarzanie antyoksydacyjnego glutationu (GSH) w celu utrzymania homeostazy redoks[13]. W tym badaniu najpierw skupiliśmy się na właściwościach przeciwutleniających ekstraktu GZM poprzez ścieżkę sygnalizacyjną SIRT1/Nrf2, która jest dobrze znaną obroną antyoksydacyjną. Odkryliśmy, że ekstrakt GZM wzmacnia szlak sygnałowy SIRT1/Nrf2, aby promować obronę komórkową przed toksycznymi obrażeniami. Niemniej jednak badanie wpływu ekstraktu GZM na szlak sygnalizacyjny SIRT1/Nrf2 w warunkach toksyczności indukowanej glutaminianem jest interesującym tematem potwierdzającym właściwości przeciwutleniające ekstraktu GZM poprzez szlak sygnalizacyjny SIRT1/Nrf2.

Brak równowagi między wolnymi rodnikami a przeciwutleniaczami (stres oksydacyjny) jest powiązany z progresją chorób neurodegeneracyjnych [1,3]. W ciągu ostatniej dekady związki polifenolowe były intensywnie badane pod kątem działania neuroprotekcyjnego ze względu na ich właściwości przeciwutleniające[13,32-35].metoda ekstrakcji flawonoidów pdfCo więcej, w alternatywne leczenie chorób neurodegeneracyjnych. W związku z powyższym, nasze odkrycia są poparte tym, że korzystny wpływ GZM na działanie neuroprotekcyjne jest prawdopodobnie uzależniony od jego aktywności przeciwutleniającej.

Neuritogeneza lub rozrost neurytów odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju neuronów [32].pustynny hiacyntWłaściwości rozrostu neurytów ekstraktu GZM określono przy użyciu komórek Neuro-2a. Wykazano, że ekstrakt GZM wywiera działanie na wzrost neurytów, ponieważ zwiększa długość neurytów i liczbę komórek zawierających neuryty. Ponadto zjawiska te zostały dodatkowo potwierdzone przez zwiększoną ekspresję markerów odrostu neurytów GAP-43 i Ten-4. W kilku badaniach stwierdzono, że polifenole, w tym kwas galusowy [32, 34], mają katechinę [ 13,40,41] i kwercetyna [33,42,43] promują aktywność rozrostu neurytów. Za obserwowane zachowanie może odpowiadać obecność związków fenolowych oraz kwasu galusowego, katechiny i kwercetyny w ekstrakcie GZM (rysunek uzupełniający S1)[1,12].

Łysinki A i białka tau są dobrze znanymi cechami charakterystycznymi AD [4,45]. Nieprawidłowa produkcja i odkładanie A odgrywają ważną rolę w patogenezie AD [44].C.el egans jest użytecznym organizmem modelowym do zrozumienia neurodegeneracji związanej z wiekiem [47]Ten robak ma podstawowy układ nerwowy, który zawiera tylko 302 neurony, które kompleksowo mapują łączność neuronalna [47]. Ponadto transgeniczny robak wykazuje akumulację karbonylków białkowych i ROS, podobnie jak w przypadku AD [48]. W ten sposób wykorzystaliśmy ustaloną korelację między ekspresją A a widocznymi objawami, w tym paraliżem i zachowaniem chemotaksji, w transgenicznym modelu C.elegans. Po raz pierwszy zbadano fenotyp paraliżu w szczepach A wyrażających (w mięśniach) CL4176 i CL2006. Ekstrakt z GZM opóźniał indukowany przez A początek i paraliż starczy odpowiednio u transgenicznych robaków CL4176 i CL2006. Aby połączyć toksyczność A z funkcjami neurologicznymi, zbadano zachowanie chemotaksji szczepu eksprymującego A (w neuronach)CL2355. Stwierdzono, że ekstrakt GZM wykazuje poprawę w defektach behawioralnych chemotaksji u transgenicznych robaków CL2355 przeciwko A . Łącznie wyniki te wskazują, że ekstrakt GZM chroni funkcje mięśniowe i neurologiczne u C elegans przed toksycznością wywołaną przez A. Różne badania wykazały, że czynniki transkrypcyjne DAF-16 i SKN-1 odgrywają kluczową rolę w odkładaniu A u nicieni [47,48]. W naszych poprzednich badaniach udowodniliśmy, że ekstrakt z liści GZM może stymulować odporność na stres oksydacyjny poprzez szlaki sygnałowe DAF-16/FoxO i SKN-1/Nrf-2, co prowadzi do poprawy długość życia i zdrowie C. elegans [11]. Spekulujemy, że DAF-16/FoxO i SKN-1/Nrf-2 mogą odgrywać rolę w ochronie przed toksycznością A za pośrednictwem ekstraktu GZM.

W kilku badaniach stwierdzono, że przeciwutleniacze fenolowe mogą chronić przed neurotoksycznością indukowaną przez glutaminian, peptydy A i stres oksydacyjny, który zależy głównie od szlaków sygnałowych Nrf2/ARE [13,17,49-52]. Ekstrakt GZM zawiera związki fenolowe, w tym kwas galusowy, katechinę i kwercetynę (rysunek uzupełniający S1)[1,12]. Zatem działanie neuroprotekcyjne, w którym pośredniczy szlak sygnałowy SIRT1/Nrf2 może wynikać z obecności związków bioaktywnych w ekstrakcie GZM. Potrzebne są dalsze badania, aby potwierdzić udział efektów neuroprotekcyjnych i zbadać więcej możliwych celów ekstraktu GZM.

5. Wnioski

Podsumowując, w tym badaniu wykazano neuroprotekcyjne działanie ekstraktu GZM przeciwko toksyczności wywołanej przez H202/glutaminian/A i właściwościom wzrostu neurytów. Ekstrakt GZM chroni przed toksycznością oksydacyjną indukowaną H4O2/glutaminian poprzez hamowanie akumulacji wewnątrzkomórkowych ROS i zwiększanie endogennych enzymów antyoksydacyjnych poprzez szlak sygnałowy SIRT1/Nrf2. Ponadto ekstrakt GZM chroni przed toksycznością wywołaną przez A u C. elegans. Oprócz działania neuroprotekcyjnego, ekstrakt GZM wykazywał korzystne działanie w promowaniu aktywności odrostu neurytów. Głównymi celami terapii neuroprotekcyjnej stały się przeciwutleniacze, które są ze sobą powiązane w procesie przezwyciężania toksyczności wywołanej stresem oksydacyjnym i aktywności indukującej wzrost neurytów. Ekstrakt GZM wykazuje właściwości neuroprotekcyjne, które nie tylko chronią przed toksycznością indukowaną H202/glutaminianem/A, ale także promują aktywność odrostu neurytów. Neuroprotekcyjne działanie ekstraktu GZM zostało z powodzeniem potwierdzone w hodowlach komórek neuronalnych (HT22 i Neuro-2a) oraz modelach C. elegans. Niniejsze badanie potwierdza po raz pierwszy korzystne działanie neuroprotekcyjne ekstraktu GZM, sugerując, że G.zeylanicum może być kandydatem na neuroprotektanty w profilaktyce i leczeniu AD oraz innych zaburzeń neurodegeneracyjnych związanych ze stresem oksydacyjnym. Jednak potrzebne są dalsze badania w bardziej złożonych organizmach modelowych, aby naświetlić aktywne składniki ekstraktu GZM i szlaki mechanistyczne zaangażowane w neuroprotekcję w celu wsparcia terapeutycznego potencjału ekstraktów roślinnych do alternatywnego lub wspomagającego leczenia chorób neurodegeneracyjnych.

Ten artykuł pochodzi z Biology 2021, 10, 800. https://doi.org/10.3390/biology10080800 https://www.mdpi.com/journal/biology