Nowatorski test z wieloma biomarkerami do nieinwazyjnego ilościowego monitorowania urazu nerek

Drew Watson¹, Joshua YC Yang^1,2,3i inni

Abstrakcyjny:Obecny standard opieki nadnerkafunkcjonować, białkomocz i kreatynina w surowicy (SCr) są słabymi predyktorami wczesnego stadiumnerkachoroba. Środki, które mogą wykryćchronicznynerkachorobawe wcześniejszych stadiach są potrzebne, aby umożliwić interwencję terapeutyczną i zmniejszyć niekorzystne skutkichronicznynerkachoroba. Opracowaliśmy test na uszkodzenie nerek (KIT) i nową punktację KIT Score w oparciu o złożony pomiar i walidację wielu biomarkerów w unikalnym zestawie 397 próbek moczu. Test jest wykonywany na próbkach moczu, które nie wymagają przetwarzania w miejscu pobrania i bez docelowego sekwencjonowania lub amplifikacji. Staraliśmy się zweryfikować, czy wstępnie zdefiniowany test KIT, punktacja KIT i progi kliniczne korelują z ustalonymichronicznynerkachoroba(CKD) i mogą dostarczać informacji predykcyjnych dotyczących stanu wczesnego uszkodzenia nerek, wykraczających poza sam białkomocz i pomiary czynności nerek. Analizy statystyczne dla sześciu markerów DNA, białkowych i metabolitów przeprowadzono na podzbiorze pozostałości plamkowych próbek moczu zCKDspełniające kryteria kontroli jakości testu od pacjentów uczęszczających do laboratoriów klinicznych na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) w ramach trwającego badania prospektywnego zatwierdzonego przez IRB. Kryteria włączenia obejmowały dobór pacjentów z potwierdzonymCKDi normalne zdrowe kontrole; kryteria wykluczenia obejmowały niekompletne lub brakujące informacje dotyczące klasyfikacji próbek, opóźnienia logistyczne w transporcie/przetwarzaniu próbek moczu lub małą objętość próbki oraz ostre uszkodzenie nerek. Wielowymiarowa regresja logistycznanerkaurazStatystyka statusu i ilorazu prawdopodobieństwa została wykorzystana do oceny udziału wyniku KIT w przewidywaniunerkaurazstan i stadium PChN, a także ocenić potencjalny wkład punktacji KIT w wykrywaniu wczesnego stadiumCKDpoza tradycyjnymi miarami czynności nerek. Próbki moczu zostały przetworzone przez zastrzeżoną immunosondę do pomiaru DNA wolnego od komórek (cfDNA), metylowanego cfDNA, klusteryny, CXCL10, całkowitego białka i kreatyniny. KIT Score i stratyfikowana KIT Score Risk Group (wysokie kontra niskie) charakteryzowały się czułością i swoistością w wykrywaniu stanu uszkodzenia nerek (zdrowe lubCKD) 97,3 proc. (95% CI: 94,6–99,3 proc.) i 94,1 proc. (95% CI: 82,3–100 proc.). Ponadto u pacjentów z prawidłową czynnością nerek (szacowany współczynnik przesączania kłębuszkowego (eGFR) > 90), punktacja KIT wyraźnie identyfikuje osoby z predysponującymi czynnikami ryzykaCKD, którego nie można było wykryć za pomocą eGFR lub białkomoczu (p < 0.001).="" kit="" score="" ujawnia="" ciężar="" uszkodzenia="" nerek,="" który="" może="" jeszcze="" nie="" zostać="" w="" pełni="" rozpoznany,="" otwierając="" drzwi="" do="" wcześniejszego="" wykrycia,="" interwencji="" i="" zachowania="" funkcji="">

Słowa kluczowe:Test ZESTAWU; chronicznynerkachoroba; biomarker; nieinwazyjny; mocz; eGFR; cfDNA

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

1. Wstęp

Chronicznynerkachoroba(CKD) to ogólnoświatowy problem zdrowia publicznego, z globalnym obciążeniem 850 milionów ludzi.CKDjest obecnie uznawana za „ukrytą epidemię”, ponieważ większość pacjentów z wczesnymi stadiami PChN (około 11 procent światowej populacji dorosłych) pozostaje nierozpoznana, ponieważ nie mają objawów i są nieświadomi zwiększonego ryzyka problemów z sercem, infekcji , hospitalizacja i niewydolność nerek. W związku z tym PChN często nie jest uważana za poważny problem zdrowotny, mimo że dotyka dwa razy więcej chorych na cukrzycę (422 miliony) i ponad 20 razy więcej osób z rakiem (42 miliony) lub HIV/AIDS (36,7 miliona).

CKD is defined as a reduced renal reserve, persisting for >3 miesiące i/lub wcześniejszą diagnozę stanu o znanym ryzykunerkadamage [1]. CKD is defined in a five-stage classification system for the assessment of kidney injury as patients advance towards the need for dialysis or transplantation [2]. The current standard of care tests, the blood-based serum creatinine (SCr) assay (and its use to calculate the estimated glomerular filtration rate or eGFR [3]) and protein in the urine, detect CKD 3–5 (eGFR of s60 mL/min/1.73 m2 of body surface area). However, most cases of CKD 1–2 (CKD >60 ml/min/1,73 m2 powierzchni ciała) pozostają niewykryte. eGFR ma słabą czułość we wczesnym wykrywaniu PChN, ponieważ wrodzona nadmiarowość rezerwy nerkowej maskuje wczesny wzrost SCr. Biopsje nerek, często wywoływane w bardziej zaawansowanych stadiach PChN, mają wartość w ocenie patologii, ale są inwazyjne, drogie [4] i nie mogą być wykorzystywane do seryjnego monitorowania progresji PChN.

Wiele wyzwalaczy i czynników ryzyka rozpoczyna kaskadęnerkauszkodzenie wCKD, z progresją do niewydolności nerek (CKD 5). Ponad 10 milionów ludzi na całym świecie potrzebuje terapii ratującej nerki z dożywotnim wsparciem z dializy lub przeszczepu nerki. Chociaż dializa i przeszczep zapewniają funkcjonalną wymianę nerek, obie są nadal obciążone różnymi niekorzystnymi wpływami na zachorowalność i śmiertelność pacjentów. Istnieje również wyraźny wpływ PChN na inne układy narządów w ciele;CKDpacjenci mają większe ryzyko infekcji, zgonów sercowo-naczyniowych i raka [5].

Wczesne wykrycie uszkodzenia nerek ma kluczowe znaczenie, ponieważ leczenie w:CKD1–2 może skutkować zachowaniem nerek poprzez odwrócenie lub spowolnienie postępu uszkodzenia nerek [6]. Obecnie dostępne testy moczu nie są w stanie wykryć niskiego stopnia uszkodzenia nerek [7–14] i były oceniane głównie w ostrym uszkodzeniu nerek (AKI), ze słabym rozróżnieniem dla PChN [9]. W związku z tym istnieje krytyczna, niezaspokojona potrzeba opracowania czułej, ilościowej, nieinwazyjnej diagnostyki w celu wykrycia CKD 1–3. Wczesne wykrycie i wczesne leczenie PChN złagodziłoby globalne obciążenie chorobami i ograniczyłoby ogromne obciążenie finansowe krajowych budżetów opieki zdrowotnej [15–21].

The primary aim of this study was to perform an assessment of multiple novels and known urine biomarker measurements to conduct an inexpensive, portable assay, called the Kidney Injury Test (KIT) in consecutive patients presenting with CKD at a large tertiary health care system, and develop and independently validate a quantitative KIT Score to reflect the diferent CKD stages. The KIT assay performance was also directly compared to the current standard of care tests (eGFR and proteinuria). A secondary aim was to explore the accuracy of the KIT assay to detect and quantitate kidney injury in CKD 1–2, i.e., subjects with normal eGFR (>60) ale z predysponującymi czynnikami ryzyka PChN. Niniejszy raport opisuje proces selekcji biomarkerów, opracowywania algorytmów i niezależnej walidacji wyniku KIT jako nowej diagnostyki do oceny i kwantyfikacji zarówno wczesnego, jak i późnego stadiumnerkaszkoda.

2. Sekcja eksperymentalna

2.1. Wybór pacjenta

Resztkowy, losowy mocz zebrano od 1169 kolejnych pacjentów z laboratoriów klinicznych Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF) w ciągu 3 miesięcy, od października 2016 do stycznia 2017 roku, w ramach rutynowych badań klinicznych w Parnassus i Mission Bay kampusowe laboratoria kliniczne. Dobór próbek do diagnozy PChN został wzbogacony o próbki moczu uzyskane z poradni nefrologii, cukrzycy lub kardiologii UCSF. Aby zwiększyć moc statystyczną, badanie wzbogacono o pacjentów ze zwiększonym ryzykiem choroby nerek, stosując następujące kryteria: pacjent miał potwierdzone rozpoznanie PChN (kod ICD10 N18 [22]), brak rozpoznania PChN, ale aktualne rozpoznanie cukrzycy , nadciśnienie lub choroba autoimmunologiczna, brak PChN, ale dodatni wywiad rodzinny w kierunku PChN, brak PChN, ale w wieku powyżej 60 lat lub należący do mniejszości etnicznej. Pacjenci z AKI nie byli włączani do tego badania z następujących powodów: (1) pierwsze badanie dotyczące KIT koncentruje się na opracowaniu i walidacji ilościowych i funkcjonalnych wskaźników punktacji KIT w przewlekłym kontinuum progresji choroby nerek. AKI ma inną trajektorię z ostrym początkiem i rozdzielczością; (2) AKI może mieć całkowite lub niecałkowite ustąpienie urazu, dlatego obniżenie wyniku KIT po ustąpieniu AKI stanie się klinicznie interpretowalne, gdy zakresy KIT Score zostaną ustalone w tym artykule dla różnych funkcjonalnych stadiów PChN; (3) AKI jest jedną z przyczyn ryzyka PChN, ale większość przypadków PChN, takich jak cukrzyca i nadciśnienie, nie zaczyna się od AKI. Badanie KIT Score w AKI jest planowane jako badanie uzupełniające.

Na potrzeby opracowania KIT Score, odpowiednią przyczynę PChN lub predysponujący czynnik ryzyka PChN zebrano z elektronicznej dokumentacji medycznej (EHR), wraz ze zmiennymi demograficznymi i SCr, aby umożliwić obliczenie eGFR [23]. W przypadku każdego pacjenta obecność i przyczynę choroby nerek potwierdzono poprzez przegląd kliniczny dokumentacji medycznej i laboratoryjnej. Najczęstszymi przyczynami PChN w tej grupie były: choroby ogólnoustrojowe o podłożu immunologicznym, które mogą powodować uszkodzenie nerek (takie jak toczniowe zapalenie nerek, reumatoidalne zapalenie stawów, zespół Sjogrena), nadciśnienie tętnicze, cukrzyca (typ 1 i 2), choroba kłębuszków nerkowych (przypadki te biopsja potwierdzona nefropatią IgA, błoniastoproliferacyjnym kłębuszkowym zapaleniem nerek lub ogniskowym segmentowym stwardnieniem kłębuszków nerkowych) i uropatią zaporową (pęcherz neurogenny, zastawki tylne cewki i wodonercze). W kohorcie pacjentów z PChN 74,8% pacjentów miało 2 lub więcej diagnoz klinicznych, które byłyby istotne dla rozwoju i progresji PChN, podczas gdy 13,3% pacjentów miało cukrzycę i nadciśnienie jako podwójne czynniki ryzyka uszkodzenia nerek w przypadku braku klinicznej diagnozy PChN , co świadczy o wysokiej częstości występowania tych chorób współistniejących w populacji ogólnej. Przyczyna PChN nie została odfiltrowana, a wszystkie przyczyny PChN zostały uchwycone.

To avoid degradation of the biomarkers in the KIT assay, urine samples were either processed within an hour of collection or stored at 4 C and processed within 24 h. Samples were discarded or not included for analysis in this study if the sample volume was less than 2 mL, there were insufficient data to confirm patient CKD diagnosis, or there was a>24-godzinne opóźnienie w przetwarzaniu próbki ze względów logistycznych. Po powyższym procesie filtrowania mieliśmy ostateczną selekcję 343 unikalnych próbek moczu od 343 pacjentów. Otrzymaliśmy również dodatkowe próbki moczu od 54 zdrowych osób z grupy kontrolnej wybranych spośród ochotników, którzy mieli dobry stan zdrowia, z normalnym SCr, bez białkomoczu i bez możliwych do zidentyfikowania czynników ryzyka PChN. Badanie było zgodne z deklaracjami z Helsinek i Stambułu i zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną UCSF (IRB 16-21108), a IRB zrezygnowała z wymogu świadomej zgody.

2.2. Metody testu ZESTAWU

2.2.1. Przetwarzanie próbek

Próbki moczu pobierano do sterylnych pojemników (czysty połów, pustka śródstrumieniowa), niezależnie od krwiomoczu lub białkomoczu mikroskopowego lub makroskopowego. Próbki moczu wirowano przy 2000 x g przez 30 min w 4 oC. Supernatant oddzielono od osadu moczu zawierającego komórki i resztki komórek. pH supernatantu doprowadzono do 7,0 za pomocą Tris-HCl i przechowywano w _80oC w biorepozytorium UCSF do dalszej analizy.

2.2.2. Biomarkery ZESTAWU

KIT wprowadza znormalizowane pomiary 6 pierwotnych biomarkerów moczu. Pierwszym biomarkerem był bezkomórkowy DNA (cfDNA): jako miara całkowitego obciążenia apoptotycznego uszkodzenia nerek [24], mierzony za pomocą zastrzeżonej 5' biotynylowanej oligonukleotydowej komplementarnej chemiluminescencyjnej sondy immunochemicznej, w celu specyficznego ukierunkowania fragmentów cfDNA w uszkodzeniu nerek [25]. Takie podejście przezwycięża ograniczenia czasochłonnego przetwarzania próbek, kosztownej amplifikacji PCR [26], wykrywania SNP ([27,28] lub metod sekwencjonowania DNA [29], w innym przypadku stosowanych do pomiaru cfDNA we krwi [27,30). Markery mierzone w teście ELISA obejmują metylowany cfDNA (m-cfDNA) w celu określenia proporcji cfDNA, które mogą być bardziej istotne dla uszkodzenia miąższu nerek [31, 32]; CXCL10 jako marker stanu zapalnego [33–37]; klusteryna jako marker uszkodzenia kanalików nerkowych [38, 39]; białko całkowite jako późny marker uszkodzenia kłębuszków nerkowych [40, 41]; oraz kreatynina jako marker normalizujący, ponieważ może mieć na nie wpływ masa ciała, odżywianie i/lub nawodnienie i jest wykorzystywana aby uniknąć konieczności czasowej zbiórki moczu [42,43].

2.3. Analiza statystyczna

2.3.1. Rozwój punktacji KIT

Do podzielenia 397-kohorty pacjentów na zestaw treningowy (n=233, z 37 zdrowymi osobami kontrolnymi) ze stratyfikacją według stanu uszkodzenia nerek zastosowano losowy próbkowanie. Wykorzystano losowe modelowanie lasu do identyfikacji zależności między różnymi markerami do wykrywania PChN z wysoką czułością. Modele predykcyjne zostały przeszkolone przy użyciu metod statystycznych i uczenia maszynowego w celu opracowania algorytmu KIT Score, we wszystkich sześciu wybranych biomarkerach DNA i białkowych, a wielowymiarowy podział tych pomiarów testowych oparto na zidentyfikowanych progach klinicznych poprzez włączenie SCr i dodatkowego znanego ryzyka zmienne dla PChN, takie jak rasa, płeć i wiek. Na koniec opracowano prosty model liniowy uwzględniający uzyskany podział w wyniku KIT Score z dodatkowym progiem do oceny niskiego i wysokiego ryzyka PChN.

2.3.2. Weryfikacja wyniku KIT

Niezależna podzbiór walidacyjny obejmujący 164 pacjentów, z 17 zdrowymi kontrolami, został następnie wykorzystany do prospektywnej walidacji wstępnie określonego testu KIT i wyniku KIT. Do porównania (pełnego) modelu z obecnym standardem testów opieki, samego białka w moczu i eGFR zastosowano regresję logistyczną. Za istotną uznano wartość p < 0,01="" dla="" odpowiedniego="" testu="" ilorazu="" wiarygodności.="" przeprowadzono="" analizy="" regresji="" logistycznej,="" aby="" ocenić="" dokładność="" wstępnie="" określonego="" progu="" punktacji="" kit="" dla="" kategorycznych="" (niskich="" i="" wysokich)="" grup="" ryzyka="" punktacji="" kit.="" obliczono="" czułość="" i="" swoistość="" uzyskanego="" ilościowego="" i="" jakościowego="" wyniku="" kit="" oraz="" 95-procentowe="" przedziały="">

T-test and logistic regression were used to compare the pre-defined KIT Score and model patient status (individuals predisposed to CKD versus healthy subjects), to assess its ability to distinguish subjects with early stages of CKD (eGFR 60–90, CKD 2) and normal eGFR but with predisposing risk factors for developing kidney damage (>90, CKD 1), od zdrowych ochotników (eGFR > 90), którzy nie mają znanych predysponujących czynników ryzyka. Za istotną uznano wartość p <>

3. Wyniki

Spośród 1169 zrekrutowanych pacjentów i zebranych próbek moczu, 201 próbki spełniły kryteria wykluczenia małej objętości moczu i zostały poddane selekcji z dalszej analizy, pozostawiając 968 pacjentów (dane demograficzne w Tabeli 1). Rozkład białkomoczu u tych 968 pacjentów (0 do 5469,73; mediana (IQR) 4,69 (0–39,11) mg/mmol) oraz zakres eGFR (obliczony dla wszystkich pacjentów z CKD [23] (ryc. 1C) ) podkreśla, że ​​uchwyciliśmy spektrum chorób PChN (ryc. 1A). Z tej kohorty 397 unikalnych pacjentów i próbek przetrwało kryteria wykluczenia (patrz Metody). Etiologia uszkodzenia nerek obejmowała szeroki zakres chorób, z nadciśnieniem jako przyczyną u 42 procent pacjentów (ryc. 1B). Ponad 60 procent pacjentów miało więcej niż jedną przyczynę uszkodzenia nerek. Biorąc pod uwagę, że jest to rzeczywistość dla większości pacjentów z PChN, zwłaszcza gdy przechodzą do późniejszych stadiów PChN, punktacja KIT została wymodelowana w celu wykrycia uszkodzenia nerek niezależnie od przyczyny. Pomimo tego, że białkomocz jest obecnie złotym standardem w nieinwazyjnej ocenie uszkodzenia nerek, nie stwierdzono korelacji między eGFR a stosunkiem białko/kreatynina w moczu (R2=00,087) i, jak wykazali inni badacze [44]. ], białkomocz był słaby w kategoryzacji stadiów PChN (ryc. 2).

Głównym celem tego badania było opracowanie złożonej skali KIT Score od {{0}} (niskie ryzyko) do 100 (wysokie ryzyko) i prospektywna ocena możliwości ilościowej skali KIT Score do wykrywania uszkodzenia nerek o wysokim stopniu czułości i specyficzności. Pokazujemy, że chociaż obecne pomiary czynności nerek (eGFR i białkomocz) pozwalają przewidzieć późną CKD (Tabela 2), ilościowa skala KIT Score od 0 (najniższe ryzyko) do 100 (największe ryzyko) dostarcza informacji predykcyjnych

na stan uszkodzenia nerek powyżej i poza białkomoczem i samą czynność nerek (współczynnik prawdopodobieństwa x {{0}}.507, wartość p < 0,0001)="" i="" przewyższa="" aktualny="" standard="" testów="" opieki="" (tabela="" 3).="" kreatynina="" w="" moczu="" jest="" wykorzystywana="" do="" celów="" normalizacji="" w="" algorytmie="" kit="" oraz="" kontroli="" zmian="" dobowych="" i="" nawodnień="" (w="" ten="" sposób="" eliminując="" konieczność="" pobierania="" próbek="" moczu="" w="" określonym="" czasie)="" i="" nie="" była="" istotna="" dla="" stadium="" pchn="" w="" analizach="" wieloczynnikowych="" (wartość="" p="0).">

We also developed a qualitative KIT Score, an approach that can have important implications for population kidney risk assessment. A pre-defined risk threshold of 18.5 was established in the training data, allowing the separation of the KIT Scores into low (s18.5) and high risk (>18,5) grupy uszkodzeń nerek. Zostało to potwierdzone w zestawie testowym w celu dostarczenia informacji predykcyjnych dotyczących stanu uszkodzenia nerek powyżej i poza białkomoczem i eGFR (współczynnik prawdopodobieństwa wynosił x=44,244, wartość p <>

Szacowana czułość i swoistość wskaźnika KIT Score w wykrywaniu PChN wynosi odpowiednio 97,3% (bootstrap 95% CI: 94,6, 99,3%) i 94,1% (bootstrap 95% CI: 82,3, 100%). W przeciwieństwie do tego, czułość i swoistość białkomoczu wyniosła odpowiednio 46,9 procent (przedział ufności bootstrap 95 procent: 38,8, 55,8 procent) i 88,2 procent (przedział ufności bootstrap 95 procent: 70,6, 100 procent) dla tych samych próbek. Podobnie czułość SCr wyniosła 65,6 procent (bootstrap 95 procent CI: 57,4, 73,8%). Oszacowanie ujemnych i dodatnich wartości predykcyjnych w skali KIT Score zależy od częstości występowania choroby, stąd jako przykład można posłużyć się częstością występowania nadciśnienia tętniczego. Częstość występowania nadciśnienia w ogólnej populacji USA wynosi około 33 procent. W konsekwencji szacowana dodatnia i ujemna wartość predykcyjna ilościowego wyniku KIT dla nadciśnienia wyniosłaby odpowiednio ~89,1% i 98,2%.

Poniżej przedstawiamy udział poszczególnych biomarkerów w punktacji KIT (Tabela 4). Ilość cfDNA w moczu była wysoce zmienna w różnych kategoriach chorób nerek i nie korelowała niezależnie ze stopniem zaawansowania PChN. Korelacje między poszczególnymi biomarkerami były niewielkie (największa korelacja R2=0.14 występowała między eGFR a białkiem), co sugeruje, że każdy z biomarkerów dostarcza niezależnych informacji w celu przewidywania stanu uszkodzenia nerek. Analizy głównych składowych (PCA) (Rysunek 2B) wyjaśniają związek niezależnych liniowych kombinacji biomarkerów z całkowitą zmiennością w pomiarach testu i podkreślają ważny wkład m-cfDNA, cf-DNA i CXCL10 jako zapewniający niezależną wartość w generowanie złożonej punktacji KIT Score. Klasteryna była jedynym biomarkerem stanu uszkodzenia nerek, który nie był istotny w analizach wieloczynnikowych (wartość p=0,1671). Czynniki te podkreślają, że pomimo opublikowanych danych dotyczących korelacji między obfitością cfDNA we krwi a dysfunkcją nerek [27, 28], cfDNA z moczu w tych warunkach nie wystarczy, i warto włączyć wiele biomarkerów do opracowania złożonej punktacji KIT dla Ocena PChN.

CXCL10 is a key inflammatory cytokine dysregulated in immune-mediated renal injury [45–51]. To evaluate where CXCL10 identifies a specific cause of CKD, such as immune-mediated causes of renal injury from systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-positive vasculitis, we evaluated which CKD categories had a high abundance of urinary CXCL10. Interestingly, only ~30% of the immune-mediated cohort had very high CXCL10 values (>100 pg/ml), podczas gdy w wielu próbkach z uszkodzeniem nerek o podłożu immunologicznym wartości te były niskie i mogą odzwierciedlać remisję choroby lub ekspozycję na immunoterapię. Ku naszemu zaskoczeniu około 30% kohort z nadciśnieniem i cukrzycą miało również wysoki poziom CXCL10 w moczu, bez żadnych zidentyfikowanych ogólnoustrojowych chorób o podłożu immunologicznym. Nie było związku między poziomem CXCL10 w moczu a stadium PChN.

Figure 2C displays the KIT Score, shown here as a function of CKD stage (based on the eGFR) and matched with presence (red dots) or absence (black dots) of proteinuria (threshold cut of urine protein/creatinine ratio of >0.2). The healthy controls are marked in green and are shown in a pre-CKD 1 or CKD 0 stage where the eGFR is >90 ml/min/1,73 m2 jak w CKD 1, bez białkomoczu ani zidentyfikowanego ryzyka uszkodzenia nerek. Ważne jest, aby pamiętać, że ~ 15% zdrowych osób z grupy kontrolnej, które zostały tutaj przebadane, ma łagodny wzrost wyniku KIT (tuż powyżej progu wysokiego ryzyka wynoszącego 18,5). Na tym etapie badania nie możemy stwierdzić, czy zdrowi kontrolni z wyższymi wynikami KIT mają niewykryte czynniki ryzyka uszkodzenia nerek, ponieważ wszyscy badani zostali zdeidentyfikowani.

Tabela 5 przedstawia rozkład średniej punktacji KIT według stadium PChN i dla zdrowych ochotników, i odnotowujemy istotną trajektorię wzrostu punktacji KIT przez zaawansowanie PChN. Skala KIT pozwala łatwo odróżnić CKD 1 i 2 (28,9; 95% CI: 27,9; 29,9) od zdrowych ochotników bez PChN (11.0; 95% CI: 9,5; 12,6); wartość p < 0.00001).="" w="" porównaniu="" ze="" zdrowymi="" osobami="" z="" grupy="" kontrolnej="" istnieje="" silny="" związek="" między="" wynikiem="" kit="" a="" predyspozycją="" do="" uszkodzenia="" nerek,="" nawet="" u="" osób="" z="" prawidłową="" czynnością="" nerek="" w="" ckd="" 1="" (egfr=""> 90), ze współczynnikiem prawdopodobieństwa x=148.4 (wartość LR p < 0,0001)="" i="" próg="" testu="" 18,5="" miały="" czułość="" i="" swoistość="" odpowiednio="" 92,9="" (dokładny="" 95="" procent="" ci:="" 87,0="" procent="" 96,7="" procent)="" i="" 94,4="" procent="" (dokładny="" 95="" procent="" ci:="" 84,6="" 98,8="" procent).="" ten="" sam="" efekt="" został="" dodatkowo="" wzmocniony="" dla="" zdolności="" testów="" kit="" ​​do="" wykrywania="" zarówno="" ckd="" 1,="" jak="" i="" 2,="" ze="" współczynnikiem="" prawdopodobieństwa="" x="196,5" (wartość="" p="" lr="">< 0,0001),="">

the >18.5 KIT Score threshold having a sensitivity of 95.8% (exact 95% CI: 92.2, 98.1%) for early CKD detection. A total of 60% of patients in CKD 1 have elevated KIT Scores >18,5, mimo że mają „prawidłową” czynność nerek i nie mają białkomoczu. To są dokładnie ci pacjenci docelowi, których chcemy uchwycić za pomocą testu KIT, ponieważ ich wczesna CKD nie zostałaby wykryta przez obecny standard testów opieki. W rzeczywistości, KIT Score identyfikuje 92% pacjentów z CKD 1, u których nie występuje białkomocz, jako mających wczesne uszkodzenie nerek. W CKD 2-3, chociaż około 60% pacjentów nie ma białkomoczu, wynik KIT wykrywa wszystkich pacjentów jako pacjentów wysokiego ryzyka i zapewnia różne ilościowe pomiary obciążenia urazem CKD każdego pacjenta. W CKD 4–5 białkomocz i wyniki KIT są bardziej zgodne, ponieważ uszkodzenie nerek jest zaawansowane, a białkomocz jest rozpoznawany jako późny marker uszkodzenia nerek.

Tak więc te zbiorcze wyniki wyraźnie pokazują, że test osiąga swoje pierwotne i drugorzędne cele przewidywania uszkodzenia nerek z większą czułością niż obecny standard testów opieki (eGFR, SCr, białkomocz) i, w przeciwieństwie do naszych obecnych testów klinicznych, wynik KIT może dokładnie zidentyfikować bardzo wczesne stadia PChN w badaniach populacyjnych.

4. Dyskusja

Siłą napędową opracowania testu KIT i KIT Score było rozpoznanie ogromnego i narastającego ciężaru nierozpoznanego uszkodzenia nerek [52], połączonego ze słabością obecnego standardu testów opieki [53] w wykrywaniu rzeczywisty i „ukryty” ciężar choroby nerek. Śledzenie uszkodzeń nerek u osób poprzez pobieranie próbek moczu zawsze było bardzo pożądanym celem, ponieważ biologiczny sygnał z moczu może dostarczyć bardzo pouczającego wglądu w stan zdrowia nerek. Niemniej jednak badanie moczu w celu przewidzenia uszkodzenia nerek, niezależnie od przyczyny, pozostaje klinicznie niezaspokojoną potrzebą i wyzwaniem biochemicznym do wykonania, ponieważ w moczu znajduje się wiele substancji zakłócających, takich jak proteazy [54,55], co powoduje degradację biomarkerów i wysoka międzyosobnicza zmienność pH moczu — wszystko to może utrudniać opracowanie solidnego testu laboratoryjnego. Ukierunkowane badania proteomiczne [56–59], napędzane protokołowanym pobieraniem próbek moczu z prospektywnych badań klinicznych, obejmujących dekadę (w naszych laboratoriach na Uniwersytecie Stanforda i UCSF), doprowadziły do ​​opracowania standardowych procedur operacyjnych (SOP) dla zbierania moczu, stabilizacji , przetwarzanie, ocena substancji zakłócających, konserwacja i transport z odległych miejsc do centralnego laboratorium przetwórczego [60]. Ponadto ponad dekada transkrypcyjnych i opartych na LC-MS/MS badań proteomicznych moczu [48,50,58,61–64] zaowocowała głębszym biologicznym zrozumieniem uszkodzenia nerek w różnych przyczynach PChN, co doprowadziło do selekcji biomarkerów do włączenia do testu KIT w celu przedstawienia uszkodzenia w różnych przedziałach wewnątrznerkowych.

Te kompleksowe poszukiwania doprowadziły nas do sześciu biomarkerów: cDNA, metylowanego cfDNA, klusteryny, CXCL10, kreatyniny i białka moczu. Wolne od komórek DNA zostało uznane za czuły marker obciążenia chorobą w osoczu pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi [65,66] i nowotworami [67]. Jednak ich użyteczność w osoczu jest ograniczona w przypadku wielu chorób i stanów chorobowych, ponieważ całkowite obciążenie cfDNA odzwierciedlałoby skumulowane procesy różnych chorób, podczas gdy pomiar DNA wolnego od komórek lub narządu w osoczu wymaga zaawansowanych technologii sekwencjonowania i bioinformatyka [68,69]. Jednakże, ponieważ cfDNA w moczu specyficznie odzwierciedla wkład nerki, test KIT cfDNA umożliwia niezwykle czułe wykrywanie uszkodzenia nerek za pomocą niedrogiego testu opartego na teście ELISA. Pomiar zmetylowanych fragmentów cfDNA zapewnia dodatkową swoistość dotyczącą rodzaju uszkodzenia. Podczas gdy globalna hipermetylacja jest powiązana z uszkodzeniem nerek o podłożu immunologicznym i zwiększonym zwłóknieniem, globalna hipometylacja jest związana z osłabieniem nerek związanym ze starzeniem się i uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym nerek [31,32,70]. Podobnie jak w przypadku naszego uzasadnienia pomiaru cfDNA, stwierdzamy, że globalne zmiany stanu metylacji cfDNA umożliwiają dokładne rozróżnienie między stanami choroby nerek bez potrzeby sekwencjonowania loci-specyficznego lub PCR.

CXCL10 jest dobrze znanym markerem uszkodzenia o podłożu immunologicznym w różnych kontekstach ze względu na jego rolę jako liganda dla receptora CXCR3 [33,34,37,45,51,71]. Wcześniej wykazaliśmy, że CXCL10 i cfDNA, mierzone za pomocą testu KIT, mogą wykryć przewlekłą dysfunkcję przeszczepu płuc w przeszczepie płuc, a także odrzucenie przeszczepu nerki [35,72,73]. Co zaskakujące, w niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że istnieje znaczna liczba pacjentów z tradycyjnie nieimmunologicznymi chorobami nerek, takimi jak nadciśnienie tętnicze i cukrzyca typu 2, którzy mieli podwyższony poziom CXCL10, co potencjalnie wskazuje na szerszą użyteczność w wykrywaniu wczesnego stadium uszkodzenia nerek. Wcześniejsze badania wykazały, że cukrzyca typu 2 ma istotny składnik, w którym pośredniczy CXCL10-[74] i zidentyfikowały CXCL10 wytwarzaną przez komórki śródbłonka jako czynnik przyczyniający się do nadciśnienia pierwotnego [75]. Nasze odkrycia sugerują, że CXCL10 może identyfikować nie tylko pacjentów z uszkodzeniem nerek o podłożu immunologicznym, ale także z innymi przyczynami, które mają tendencję do podstępnego prezentowania późnych objawów klinicznych w stosunku do progresji choroby.

Całkowite białko i klusteryna w moczu są dobrze znanymi markerami dysfunkcji nerek [38,40,41], a kreatynina jest dobrze zweryfikowanym biomarkerem normalizującym [42,43]. Co zaskakujące, stwierdzamy, że po analizach wieloczynnikowych klusteryna nie ma znaczenia w naszym modelu uszkodzenia nerek w kontekście innych naszych biomarkerów. Może to wynikać z wielu przyczyn, w tym jego korelacji ze stosunkiem białka całkowitego do kreatyniny, którego składniki są już uwzględnione w modelu [38], a także dużej zmienności plamki spowodowanej ultradobowymi rytmami ciasno skorelowane poziomy klusteryny w osoczu i moczu [76,77].

Wczesne wykrycie uszkodzenia nerek ma bardzo ważne konsekwencje w ograniczaniu postępu PChN i pozytywnie wpływa na opiekę zdrowotną na całym świecie. Ponieważ zmiany hemodynamiczne nerek są bardzo wrażliwe na zaburzenia ogólnoustrojowe, natychmiastowe korzyści przyniesie lepsze leczenie głównych przyczyn PChN, zwłaszcza lepsza i ścisła kontrola ciśnienia krwi [78], stabilność i ścisła kontrola hiperglikemii [79] oraz wczesne wykrywanie i szybka immunomodulacja w celu zniesienia zapalenia i uszkodzenia nerek w chorobach układowych o podłożu immunologicznym, takich jak toczeń rumieniowaty układowy [80] i reumatoidalne zapalenie stawów [81]. Utrzymujące się i wczesne podwyższenie wyniku może wywołać obrazowanie nerek w celu oceny uropatii zaporowej, z natychmiastową interwencją w celu zapobieżenia wysokiemu ciśnieniu wewnątrznerkowemu i postępującemu włóknieniu śródmiąższowemu nerek i wypadaniu kanalików nerkowych. Wczesne wykrycie uszkodzenia nerek najprawdopodobniej nastąpi w warunkach podstawowej opieki zdrowotnej, gdzie dostępność szybkiego, prostego testu z ilościowym odczytem wyniku oceny ryzyka nerek może spowodować wcześniejsze skierowanie do nefrologa w celu kontroli ciśnienia krwi, dieta modyfikacja, leczenie choroby naczyń wieńcowych i/lub obwodowych, podstawowa przyczyna PChN oraz rozważenie leczenia oszczędzającego nerki [82, 83]. Możliwość ilościowego śledzenia rozdzielczości KIT Score w czasie zapewnia możliwość śledzenia rozwiązania uszkodzenia nerek. Oprócz możliwości stosowania leków lub wsparcia w celu lepszej kontroli choroby ogólnoustrojowej, nowe leki chroniące nerki, takie jak inhibitory SGLT2 i inne [84], dodatkowo podkreślają, jak ważna jest możliwość wykrycia bardzo wczesnego uszkodzenia nerek. i odwróć to.

Opóźnienia w wykryciu uszkodzenia nerek, a co za tym idzie skierowanie pacjenta, jest istotną przeszkodą w wprowadzeniu nowych pacjentów do skutecznych schematów leczenia, podczas gdy nadal mają oni szansę na zmaksymalizowanie korzyści płynących z terapii oszczędzającej nerki. Aby podkreślić, jak wielu pacjentów „przeocza” możliwość rozpoznania PChN we wcześniejszych stadiach choroby, pacjenci z ESRD korzystają z oddziału ratunkowego w tempie sześciokrotnie wyższym niż średnia krajowa dla dorosłych w USA — z czego połowa skutkuje przyjęciem do szpitala [85]. W związku z tym, oprócz wykorzystania skali KIT Score do śledzenia regeneracji nerek, ogromne znaczenie ma również wykorzystanie tego testu do śledzenia postępu uszkodzenia nerek, tak aby w razie potrzeby można było podejmować interwencje w celu ustabilizowania progresji trajektorii KIT Score. Obserwacja, że ​​jedna trzecia pacjentów z etiologią PChN spowodowaną nadciśnieniem lub cukrzycą ma również silne środowisko immunologiczne/zapalne w związku z uszkodzeniem nerek, sugeruje, że ocena biologicznej heterogeniczności różnych kategorycznych chorób przez poszczególne wartości biomarkerów w teście KIT, i inne badania przesłuchań, pozwolą na bardziej zindywidualizowane podejście do leczenia pacjentów z CKD.

Planowane i trwające badania są w toku, w ramach których seryjna ocena wstępnie zdefiniowanego testu KIT Score z predefiniowanym testem KIT pozwoli nam ocenić wartość poszczególnych biomarkerów w teście podczas uszkodzenia nerek i powrotu do zdrowia. Ponadto nawiązujemy współpracę z partnerami farmaceutycznymi, w ramach której seryjną ocenę testu KIT można wykorzystać jako środek do nieinwazyjnego i dokładnego śledzenia wczesnych uszkodzeń nerek spowodowanych nefrotoksycznością leków, nieodłączną od wielu modulatorów odporności, takich jak kalcyneuryna inhibitory [86] i środki anty-TNF [87]; chemioterapeutyki, takie jak cisplatyna [88], aminoglikozydy [89] i nowsze immunoterapie [90], a także ekspozycja na radionuklidowe środki kontrastowe do celów obrazowania [91]. Do analizy gromadzone są dodatkowe kohorty, w których pacjenci byli obserwowani długotrwale w trakcie progresji PChN, co pozwoli nam lepiej zrozumieć ziarnistą trajektorię punktacji KIT i być może pomóc w doprecyzowaniu stadiów PChN.

Ponieważ wybrano biomarkery testu, a test został opracowany z myślą o wykrywaniu bardzo wczesnego uszkodzenia nerek, zaobserwowaliśmy również, że test KIT może wykryć, że niewielki procent „normalnych” kontroli wykazuje wyniki KIT w moczu oscylujące przy wysokim próg ryzyka 18,5. Chociaż nie zostało to potwierdzone, możliwe jest, że nie jest to szum testu, a te przypadki są prawdziwie pozytywne z bardzo wczesną identyfikacją ryzyka uszkodzenia nerek w stadium przed CKD 1 lub CKD 0. Ponieważ 96 procent osób z PChN nie zdaje sobie sprawy, że ją ma [92], jednym z istotnych wyzwań w opracowywaniu modeli uszkodzenia nerek jest wysokie prawdopodobieństwo, że pacjenci rekrutowani jako zdrowi pacjenci faktycznie mają wczesny etap choroby nerek. Na przykład projekt dotyczący długowieczności człowieka, kierowany przez Craiga Ventera z testem Health Nucleus, szeroko zsekwencjonował i przeprowadził dodatkowe badania przesiewowe dorosłych osób bez objawów i znalazł kliniczne korelaty potencjalnej choroby u 21 procent ich „zdrowych” uczestników badania, w tym pacjentów urologicznych. /choroby nerek, co sugeruje potrzebę wzmożonych badań przesiewowych. Dotyczy to zwłaszcza chorób, w których wczesna interwencja może opóźnić lub nawet odwrócić postęp choroby. Uważamy, że CKD i uszkodzenie nerek jako całość stanowią przykład choroby, w której jest to prawdą, ponieważ liczne interwencje związane ze stylem życia i interwencje terapeutyczne mogą zapobiegać dalszemu postępowi pogarszania się funkcji nerek [6,82,83,92].

Ograniczeniem obecnego projektu badania jest wykorzystanie populacji wzbogaconej o pacjentów z CKD z ośrodka opieki trzeciego stopnia. Osobnicy uzyskani z większej liczby badań przesiewowych i środowisk mogą być bardziej reprezentatywni dla populacji ogólnej, szczególnie w wykrywaniu wczesnego stadium PChN. Dodatkowo badanie było przekrojowe i mogło nie w pełni odzwierciedlać wczesną i późną fazę PChN. Planowane są badania podłużne monitorujące pacjentów z objawami we wczesnym stadium PChN w celu lepszej oceny możliwości wczesnego wykrywania w skali KIT oraz wpływu wczesnego wykrywania na progresję PChN. Wreszcie, możliwe jest dalsze zwiększenie punktacji KIT o dodatkowe biomarkery, aby umożliwić lepszą diagnostykę różnicową CKD i zminimalizować potrzebę oznaczania stężenia kreatyniny i białkomoczu w surowicy.

Nie można podkreślić pozytywnego wpływu ekonomicznego wczesnego wykrywania uszkodzenia nerek i jego leczenia. Prawie jedna trzecia budżetu Medicare jest przeznaczona na leczenie uszkodzeń i chorób nerek w Stanach Zjednoczonych. Utrata funkcji nerek w CKD 5 stanowi dodatkowe obciążenie fiskalne w wysokości ~80 USD000 rocznie z powodu wspomagania dializami. Chociaż przeszczep nerki umożliwia pacjentom odstawienie się od dializy, to niedobór dawców nerki, zarówno żywych, jak i nieżyjących, przeszczep nerki kosztuje około 100 USD,000, a następnie koszty leczenia podtrzymującego około 20 USD,{{ 6}}/rok, skutkuje tylko niewielkim ubytkiem w budżecie Medicare na dializy [93]. Oczekuje się, że trajektoria liczby pacjentów z PChN będzie nadal rosnąć na całym świecie, z większymi tendencjami do otyłości, co skutkuje wzrostem liczby osób z nadciśnieniem tętniczym i cukrzycą [94]. Ponadto różnice etniczne w chorobach nerek napędzają problemy narodowej opieki zdrowotnej, wymagając populacyjnych badań przesiewowych z biopsją nerek w celu wczesnego wykrycia uszkodzenia nerek spowodowanego chorobą nerek IgA w Azji Południowo-Wschodniej [95], gdzie choroba nerek IgA jest główną przyczyną niewydolności nerek . Włączenie czułego, nieinwazyjnego testu do wykrywania uszkodzenia nerek, w celu zastąpienia inwazyjnych, kosztownych procedur biopsji o wysokiej zachorowalności, przyniosłoby znaczne korzyści społeczno-ekonomiczne dla tych zagrożonych populacji.

Cistanche tubulosa zapobiega chorobom i urazom nerek, kliknij tutaj, aby pobrać próbkę

Podsumowując, badanie to dostarcza wzorca biomarkerów testu KIT, procesu opracowywania algorytmu testu KIT, definicji KIT Score i jego wydajności we wczesnym wykrywaniu uszkodzenia nerek oraz jego bezpośredniego porównania z obecnym standardem testów opieki. Niniejsze badanie sugeruje, że test KIT może być stosowany (1) jako test przesiewowy, gdy istnieje obawa chorób współistniejących, o których wiadomo, że zwiększają ryzyko PChN, takich jak zachorowalność na układ sercowo-naczyniowy, otyłość, cukrzyca, bez udokumentowania nieprawidłowej pracy nerek funkcja według aktualnych testów; (2) jako dodatkowy test do monitorowania obciążenia i dokładnej progresji PChN u pacjentów, u których obecny standard testów opieki już wykrył uszkodzenie nerek, tj. u pacjentów ze stwierdzoną wcześniej istniejącą PChN w różnych stadiach choroby nerek; (3) umożliwienie wrażliwej oceny powrotu do zdrowia po urazie nerek w przypadku narażenia na różne terapie i opcje leczenia chroniące nerki. Potrzebne są i planowane dalsze badania w celu przeprowadzenia długotrwałego badania przesiewowego pacjentów w czasie, aby lepiej zrozumieć naturalną historię postępu PChN, korzyści z wczesnego wykrywania, interwencji i monitorowania oraz punkty infekcji, w których uszkodzenie PChN staje się stałe i postępujące .

Autorskie Wkłady:MMS, JYCY, DW i TKS zaprojektowali badania i eksperymenty; JML, ID, VL, SS, DL, KS, RS, AC, PC.L. i ML, przeprowadzili eksperymenty; DW, JYCY, RDS i MMS przeanalizowali dane; DW, JYCY i MMS stworzyli figury; JYCY, DW, RDS, TKS i MMS sporządzili i zrewidowali artykuł; wszyscy autorzy dokonali krytycznej korekty manuskryptu pod kątem ważnych treści intelektualnych i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu. Firma MMS miała pełny dostęp do wszystkich danych w badaniu i bierze odpowiedzialność za integralność danych oraz dokładność analizy danych.

Finansowanie:MMS i TKS mają wsparcie badawcze z NIH (NIAID i NIDDK). Fundatorzy nie brali udziału w projektowaniu badań, gromadzeniu danych, analizie, decyzji o publikacji lub przygotowaniu rękopisu.

Podziękowanie:Jesteśmy wdzięczni za pomoc lekarzy, koordynatorów klinicznych, personelu badawczego, pacjentów i rodzin pacjentów.

Konflikt interesów:MMS, DW i JYCY są założycielami firmy KIT Bio, Inc. (Los Altos, CA, USA), której własność intelektualna jest wyłączną własnością Regents, University of California San Francisco i posiada licencję KIT Bio. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów

1. KIT Bio, 665 3rd Street, San Francisco, CA 94107, USA; drew@kit.bio (DW); joshua.yang@ucsf.edu (JYCY)

2. Klinika Chirurgii, University of California San Francisco, San Francisco, CA 94143, USA;

reuben.sarwal@ucsf.edu (RDS); tara.sigdel@ucsf.edu (TKS); juliane.liberto@ucsf.edu (JML);

izabella.damm@ucsfmedctr.org (identyfikator); wiktorialouie11@gmail.com (VL); shristisigdel@gmail.com (SS); peichen@berkeley.edu (P.-CL)

3. Masters in Translational Medicine Program, University of California Berkeley, Berkeley, CA 94720, USA; devonlivingstone@berkeley.edu (DL); Katarzyna_soh@berkeley.edu (KS); archakra@berkeley.edu (AC); liangmichael@berkeley.edu (ML)

Bibliografia

1. KDIGO 2012. Wytyczne praktyki klinicznej dotyczące oceny i postępowania w przewlekłej chorobie nerek; KDIGO: Bruksela, Belgia, 2013.

2. Lewin, A.; Stevens, PE Podsumowanie KDIGO 2012 CKD Wytyczne: Za kulisami, potrzeba wskazówek i ram dla postępu. Nerka wewn. 2014, 85, 49–61. [Odn.]

3. Levey, AS; Stevensa, LA; Schmid, CH; Zhang, YL; Castro, AF; Feldman, HI; Kusek, ŚJ; Eggers, P.; Van Lente, F.; Greene, T.; i in. Nowe równanie do oszacowania szybkości filtracji kłębuszkowej. Anny. Stażysta. Med. 2009, 150, 604-612. [Odsyłacz] [PubMed]

4. Khati, New Jersey; Gorodenker, J.; Hill, MC Biopsje jamy brzusznej pod kontrolą USG. USG Q. 2011, 27, 255–268. [Odsyłacz] [PubMed]

5. Fried, funkcja nerek LF jako predyktor śmiertelności pozasercowej. J. Am. Soc. Nefrol. 2005, 16, 3728–3735. [Odn.]

6. Qaseem, A.; Hopkinsa, RH; Słodkie, DE; Starkey, M.; Shekelle, P. Badania przesiewowe, monitorowanie i leczenie stadium 1 do 3 PChN: wytyczne dotyczące praktyki klinicznej z CGC ACP. Anny. Stażysta. Med. 2013, 159, 835-847. [PubMed]

7. Mishra, J.; Dent, C.; Tarabishi, R.; Mitsnefes, MM; Ma, Q.; Kelly, C.; Ruf, SM; Zahedi, K.; Shao, M.; Fasola, J.; i in. Lipokalina neutrofilowa związana z żelatynazą (NGAL) jako biomarker ostrego uszkodzenia nerek po operacji kardiochirurgicznej. Lancet 2005, 365, 1231-1238. [Odn.]

8. Parikh, CR; Jani, A.; Mielnikow, WY; Faubel, S.; Edelstein, CL Urinary Interleukina-18 jest markerem ostrej martwicy kanalików nerkowych u ludzi. Jestem. J. Nerka Dis. 2004, 43, 405-414. [Odsyłacz] [PubMed]

9. Han, WK; Bailly, V.; Abichandani, R.; Thadhani, R.; Bonventre, JV Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1): Nowy biomarker uszkodzenia kanalika proksymalnego nerki u człowieka. Nerka wewn. 2002, 62, 237-244. [Odsyłacz] [PubMed]

10. Matteucci, E.; Carmellini, M.; Bertoniego, C.; Boldrini, E.; Mosca, F.; Giampietro, O. Wskaźniki wydalania w moczu wielu wskaźników nerkowych po przeszczepieniu nerki: znaczenie kliniczne dla wczesnego wyniku przeszczepu. Ren. Ponieść porażkę. 1998, 20, 325–330. [Odn.]

11. Lybarger, JA; Lichtveld, MÓJ; Amler, RW Niewydolność nerek Badania biomedyczne nerek u osób narażonych na działanie substancji niebezpiecznych w środowisku. Ren. Ponieść porażkę. 1999, 21, 263–274. [Odn.]

12. Donadio, C.; Tramontiego, G.; Lucchesi, A.; Giordani, R.; Lucchetti, A.; Bianchi, C. Gamma-glutamylotransferase jest niezawodnym markerem kanalikowych efektów środków kontrastowych. Ren. Ponieść porażkę. 1998, 20, 319-324. [Odsyłacz] [PubMed]

13. Nouwen, EJ; De Broe, ME Ludzkie jelita a niespecyficzna tkankowo fosfataza alkaliczna jako uzupełniające markery moczowe dla kanalika proksymalnego. Nerka wewn. Suplement 1994, 47, S43–S51. [PubMed]

14. Gatta, A.; Mazzella, G.; Amodio, P.; Menon, F.; Angeli, P.; Schiaffino, E.; Schmid, C. Wykrywanie wczesnych etapów nefropatii kadmowej — porównanie wzorców mikroskopii świetlnej i elektronowej z wydalaniem enzymów moczowych. Nefron 1989, 51, 20-24. [Odsyłacz] [PubMed]

15. Locatelli, F.; Del Vecchio, L.; Pozzoni, P. Znaczenie wczesnego wykrywania przewlekłej choroby nerek. Nefrol. Wybierz. Przeszczep. 2002, 17 (Suppl. 11), 2–7. [Odn.]

16. Remuzzi, G.; Ruggenenti, P.; Perico, N. Przewlekłe choroby nerek: Renoprotekcyjne korzyści z hamowania układu renina-angiotensyna. Anny. Stażysta. Med. 2002, 136, 604–615. [Odn.]

17. Gansevoort, RT Za dużo nefrologii? Epidemia PChN jest realna i niepokojąca. Widok PRO. Nefrol. Wybierz. Przeszczep. 2018, 34, 577–580. [Odn.]

18. Coresh, J.; Byrd-Holt, D.; Astor, pne; Briggs, JP; Eggers, PW; Lacher, DA; Hostetter, TH Świadomość, występowanie i trendy w przewlekłej chorobie nerek wśród dorosłych w USA, 1999 do 2000. J. Am. Soc. Nefrol. 2005, 16, 180–188. [Odsyłacz] [PubMed]

19. Coresh, J.; Wei, GL; McQuillan, G.; Brancati, Floryda; Levey, AS; Jones, C.; Klag, MJ Rozpowszechnienie wysokiego ciśnienia krwi i podwyższonego poziomu kreatyniny w surowicy w Stanach Zjednoczonych: ustalenia z trzeciego badania National Health and Nutrition Examination Survey (1988-1994). Łuk. Stażysta. Med. 2001, 161, 1207-1216. [Odsyłacz] [PubMed]

20. McClellan, WM; Rycerz, DF; Karp, H.; Brown, WW Wczesne wykrywanie i leczenie choroby nerek u hospitalizowanych pacjentów z cukrzycą i nadciśnieniem: istotne różnice między praktyką a opublikowanymi wytycznymi. Jestem. J. Nerka Dis. 1997, 29, 368-375. [Odn.]