Ekstrakt z liści oliwnych (Olea Europaea L) Nanocząstki lipidowe obciążone lipidami: Optymalizacja parametrów przetwarzania za pomocą projektu statystycznego Box-Behnken, charakterystyki in vitro i oceny aktywności przeciwutleniającej i przeciwdrobnoustrojowej Część 2

Proszę o kontaktoscar.xiao@wecistanche.compo więcej informacji

2.5.6 Ocena stabilności

Stabilność zoptymalizowanego preparatu (F9) zbadano zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Rady ds. harmonizacji (ICH)). Dyspersję SLN pobrano w trzech oddzielnych fiolkach szklanych (10 ml w każdej). Spośród trzech fiolek jedna była przechowywana w lodówce (4 stopnie ± 2 stopnie), druga w temperaturze pokojowej (25±2 stopnie /60±5 procent RH), a ostatnia była przechowywana w komorze stabilności (Thermo Scientific, Szwecja) przy 40±2 stopniach/75±5 procentach wilgotności względnej. W określonym punkcie czasowym, tj. 1,3,6 miesiąca, próbki zostały pobrane i zbadane pod kątem pewnych parametrów, takich jak wielkość cząstek, wydajność uwięzienia, potencjał zeta i PDI, itp., które zostały określone i porównane statystycznie z danymi w czasie zerowym (początkowe) . 2.5.7 Aktywność przeciwutleniająca

Jedną z najbardziej użytecznych metod wykrywania potencjału przeciwutleniającego jest metoda wolnych rodników 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylohydratu (DPPH)2. Aktywność wychwytywania rodników (tj. analizowanie ich zdolności do wychwytywania wolnych rodników DPPH) OLP-SLN oceniano spektrofotometrycznie przy długości fali 517 nm. Aktywność przeciwutleniającą OLP, jak również OPL-SLN, oznaczono metodą (DPPH). Przygotowano roztwór DPPH ({{10},1 mM) w etanolu. OLP-SLN (odpowiednik 0,2 mg/ml OLP) zdyspergowano w buforze fosforanowym i pozostawiono na 24 godziny w celu uwolnienia leku. Równoważne stężenie OLP (0.2 mg/ml) i ślepych SLN również przygotowano w tej samej pożywce. W tym badaniu kwas askorbinowy o stężeniu 0,2 mg/ml był przyjmowany jako wzorzec, a roztwór DPPH jako kontrolę.cistanche Australia3300 μl DPPH zmieszano w każdym roztworze OLP-SLN（500 μL）, ślepe SLNs i roztwór OLP（500 μL）. Każdą mieszaninę reakcyjną trzymano w łaźni wodnej z wytrząsaniem w temperaturze 37±0,5 stopnia przez 30 minut w warunkach chronionych przed światłem. Na koniec, absorbancję każdej próbki określono za pomocą spektrofotometru UV-widzialnego (Shimadzu 1800, Japonia) przy 517 nm z użyciem etanolu jako ślepej próby. Każdy eksperyment oceniano trzykrotnie, a wartości przedstawiono jako średnią ± SD. Wartość aktywności przeciwutleniającej w postaci procentowej aktywności zmiatania DPPH określono wzorem (równanie 2):

2.5.8 Badanie przeciwdrobnoustrojowe

Badanie przeciwdrobnoustrojowe SLN załadowanych OLP (zoptymalizowana partia F9) przeprowadzono przy użyciu metody dyfuzji w studzience agarowej. Do oceny użyto szczepów bakteryjnych, takich jak Staphylococcus aureus (Gram-dodatni) i Pseudomonas aeruginoza (Gram-ujemny). mL） każdej bakterii umieszczono pojedynczo na każdej sterylnej płytce z agarem odżywczym za pomocą sterylnych wacików inkubowanych w temperaturze 37±0,5 stopnia przez 1 godzinę.korzyści cistancheNa każdej płytce wykonano cztery dołki o średnicy około 8 mm każdy za pomocą sterylnego korkowiertarki. W tym przypadku do badania przeciwdrobnoustrojowego użyto ślepych SLN, kontroli pozytywnej (czysty ekstrakt), fizycznej mieszaniny (ekstrakt OLP plus ślepej próby) oraz SLN i zoptymalizowanego preparatu OLP-SLN（100 μL） i umieszczono je w każdym dołku . Płytki inkubowano w temperaturze 37±0,5 stopnia. W ustalonych punktach czasowych (6,12,24 godz.) płytki wyjęto i za pomocą suwmiarki zmierzono strefy zahamowania wokół ścian w mm.

Kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej

3. Wyniki i dyskusja

3.1 Wstępne badanie przesiewowe i wstępna optymalizacja zmiennych ukrytych w formie

The highest solubility of OLP was found to be in compri-to 888 ATO as depicted in Fig.1. The descending order of OLP solubility/100 gm in different lipid was compritol 188 ATO(36.93±4.92mg)>Precirol ATO 5(29.37±3.01 mg)>GMS(23.84±2.73mg)>palmitic acid(21.41±2.81 mg)>kwas stearynowy (16,25±1,65 mg). Compritol 888 ATO został użyty jako lipid do przygotowania SLN doustnych do przygotowania SLN.

Na podstawie wyników wstępnego badania przesiewowego, Tween 80 i Compritol 888 ATO zostały wybrane jako surfaktant i odpowiednio lipid. Inne parametry, takie jak stosunek leku do lipidu (1:3-1:6), stężenie środka powierzchniowo czynnego (procent, 1.5-4.5 procent) i szybkość homogenizacji (rpm, 3000-6000 rpm), Czas homogenizacji (2 godz.), czas sonikacji (10 min) ustalono przeprowadzając wstępne eksperymenty. Czynniki takie jak stosunek leku do lipidu (A), stężenie środka powierzchniowo czynnego (B) i homogenizacja (C) zostały ponownie zoptymalizowane przy użyciu metodologii powierzchni odpowiedzi (RSM) w połączeniu z 3-czynnikami i 3-poziomami BBD , a ich wpływ wykryto na czynniki zależne, takie jak wielkość cząstek (Y1), skuteczność uwięzienia (Y2) i PDI (Y3).

3.2 Przygotowanie SLN i optymalizacja SLNS z obciążeniem OLP

Wartości wstępnie zoptymalizowanych parametrów zgodnie z opisem

powyżej zostały dopasowane do BBD o konstrukcji eksperckiej. Skład łącznie siedemnastu preparatów został zbadany przez BBD z 5 punktami centralnymi. Wszystkie preparaty zostały opracowane, a wartości zależnych parametrów, takich jak wielkość cząstek, wydajność uwięzienia i PDI, zostały zbadane i dopasowane do BBD, aby uzyskać ostateczny wynik. Wygenerowano równania wielomianowe i wykresy 3D pokazujące wpływ czynników niezależnych na czynniki zależne. Dodatni znak równania wielomianowego badał wpływ dodatni, a znak ujemny wskazywał na ujemny wpływ na zmienne zależne. Analiza regresji wartości rzeczywistych i przewidywanych zmiennych zależnych oraz Analiza danych wariancji modeli przedstawiono odpowiednio w tabelach 1, 2 i 3. Model kwadratowy uznano za najlepiej dopasowany model dla wszystkich odpowiedzi, ponieważ w tym przypadku zaobserwowano najwyższą wartość współczynnika regresji.

3.3 Wpływ niektórych parametrów na wielkość cząstek (Y1)

Z BBD otrzymano następujące równanie wielomianowe wskazujące na wpływ różnych niezależnych czynników na wielkość cząstek (Y1):

Powyższe równanie wykazało, że Compritol 888 ATO wykazywał pozytywny wpływ na wielkość cząstek, podczas gdy tween 80 i homogenizacja wykazywały negatywny wpływ na wielkość cząstek.

Tutaj zmienne A, B, C, AB, BC i B” miały znaczący wpływ na wielkość cząstek.cholesterol cistancheAt a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05), podczas gdy pozostałe parametry okazały się istotne (p<0.0001)with adequate="" precision（="">4）（Tabela 3）.W oparciu o R²

(0.9996), model kwadratowy uznano za najlepiej dopasowany model z odpowiednim sygnałem (Tabela 4).

Stwierdzono, że wielkość cząstek różnych partii mieści się w zakresie 112,35-277,46 nm. Jeśli inne zmienne były utrzymywane na stałym poziomie, wielkość cząstek zwiększano po zwiększeniu stosunku leku do lipidu (Tabela 1, partia F1 2370,05 nm i F2 259,57 nm). Może to być spowodowane agregacją cząstek z powodu niewystarczającej ilości środka powierzchniowo czynnego do dyspergowania cząstek. Z drugiej strony surfaktant (1,5-40,5 procent) wykazywał negatywny wpływ na wielkość cząstek (tabela 1, partia F1 2370,05 nm i F3 1120,35 nm ). Może to być spowodowane zmniejszeniem napięcia międzyfazowego między fazą wodną i lipidową, co zapobiega agregacji cząstek). Szybkość homogenizacji wykazywała negatywny wpływ (Tabela 1, partia F5 187.46 nm i F7 134.27 nm) na wielkość cząstek ze względu na generowanie dużej siły, która rozbija cząstki, a tym samym zmniejsza rozmiar cząsteczki. Równanie 3 wskazuje, że wpływ środka powierzchniowo czynnego (wartość współczynnika -40,87) wykazywał bardziej widoczny wpływ na wielkość cząstek w porównaniu z szybkością homogenizacji (wartość współczynnika -24,97).skutki uboczne cistanche deserticolaNa rysunku 2 zbadano wpływ różnych niezależnych parametrów na wielkość cząstek.

Cistanche może przeciwdziałać starzeniu

3.4 Wpływ niektórych parametrów na skuteczność uwięzienia (Y2)

Z BBD uzyskano następujące równanie polimeru pokazujące wpływ różnych niezależnych parametrów na skuteczność pułapkowania:

Tutaj zmienne A, B, C, AB, AC, BC, A i B² miały istotny wpływ na skuteczność pułapkowania. Przy 95-procentowym przedziale ufności brak dopasowania był nieistotny (p<0.05)while the="" remaining="" parameters="" were="" found="" to="" be=""><0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabela 3). Za najlepiej dopasowany model z odpowiednim sygnałem uznano model kwadratowy（R²=0.9991） (tab. 4).

Z powyższego równania 4 obserwuje się, że lipid (kompritol 888ATO) wykazywał pozytywny wpływ, podczas gdy pozostałe dwa parametry wykazywały negatywny wpływ na skuteczność pułapkowania. Środek powierzchniowo czynny (wartość współczynnika -7,23) miał bardziej widoczny efekt w porównaniu z szybkością homogenizacji (wartość współczynnika -5,76). Pozytywny wpływ lipidów na skuteczność pułapkowania (Tabela 1, partia F1 i F2) wynikał z dostępności większej ilości lipidów do akomodacji dostępnych leków. Zaobserwowano zmienny wpływ na skuteczność pułapkowania. W początkowej fazie, przy zwiększaniu surfaktanta, wartość skuteczności pułapkowania wzrastała, ale przy dalszym zwiększaniu surfaktanta zmniejszała się z powodu wycieku leku do środowiska zewnętrznego (Tabela 1, partia F1 i F3). Szybkość homogenizacji wykazywała negatywny wpływ na skuteczność uwięzienia ze względu na większą siłę ścinającą, która może odpowiadać za wydalenie leku (Tabela 1, partia F5 i F7). Na rysunku 3 zbadano wpływ różnych niezależnych parametrów na

3.5 Wpływ niezależnych parametrów na PDI(Y3)

Poniższe równanie wielomianowe pokazujące wpływ różnych parametrów na PDI:

Here,variables like A,B, C,AB,AC,BC,A2,and C°had a significant effect on the PDI. At a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05), podczas gdy pozostałe parametry okazały się istotne (p<0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabela 3). Za najlepiej dopasowany model z odpowiednim sygnałem uznano model kwadratowy (R=0.9991) (tab. 4).

Z równania 5 wynika, że ​​wszystkie trzy niezależne parametry, takie jak stosunek lipidów leku, surfaktant i szybkość homogenizacji, miały pozytywny wpływ na PDI. Dominujący efekt wynikał z szybkości homogenizacji (wartość współczynnika 0.048), a następnie lipidów (wartość współczynnika 0.046), a najmniejsza była surfaktant (wartość współczynnika 0,014). Dzięki homogenizacji energia kinetyczna układu stała się nieco wysoka, co powoduje zderzenia i agregację nanocząstek lipidów (Tabela 1, Partia F9 i F11). Wysokie stężenie środka powierzchniowo czynnego dało więcej małych cząstek, które tworzą mostek z dużymi cząstkami, a tym samym powodują niejednorodność, co zwiększa PDI. Zwiększenie stężenia lipidów przy stałym poziomie środka powierzchniowo czynnego powodowało koagulację cząstek, co skutkuje niejednorodnym rozkładem wielkości cząstek. Rysunek 4 badał wpływ różnych zmiennych niezależnych na PDI). W oparciu o trzy cechy charakterystyczne, tj. wielkość cząstek, skuteczność zatrzymywania i PDI, partię F9 uznano za zoptymalizowaną formulację o wartości wielkości cząstek, wydajności zatrzymywania i PDI odpowiednio 277,46 nm, 80,48% i 0,275.

3.6 Charakterystyka OLP-SLN

3.6.1 Ocena wielkości cząstek, PDI i potencjału zeta

Stwierdzono, że wartość wielkości cząstek, PDI i potencjału zeta zoptymalizowanej partii (F9) wynosi odpowiednio 277,46 nm, 00,282 (ryc. 5A) i -230,18 mV. Mała wartość PDI(<0.5)indicates the="" uniform="" or="" mono="" distribution="" of="" particles="" without="" any="" aggregation="" in="" the="" developed="" slns="" dispersion.="" a="" similar="" finding="" was="" observed="" by="" yasir="" et="" al.="">dawkowanie cistanche redditpodczas produkcji SLN ładowanych buspironem do dostarczania z nosa do mózgu. Zarówno wielkość cząstek, jak i ładunek powierzchniowy są ważne w przypadku dostarczania leków w postaci nanocząstek. Uważa się, że wielkość cząstek mniejsza niż 500 nm jest unikaniem mechanizmu fagocytozy indukowanego przez makrofagi. Potencjał Zeta w postaci ujemnego ładunku powierzchniowego (około -20 mV) jest pożądany dla właściwej stabilności nanoformulacji. Zaobserwowana wartość potencjału zeta wyniosła -23.18 mV, co wskazuje na dobrą stabilność fizyczną

dyspersji SLN. Ważną rolą ujemnych nanocząstek powierzchniowych jest ich przyciąganie do dodatnio naładowanych białek z uszkodzonych tkanek i pomoc w regulacji procesu utleniania”. Opracowany zoptymalizowany preparat

(F9) spełnia oba kryteria wielkości cząstek i ładunków powierzchniowych.

3.6.2 Badanie morfologiczne

Zoptymalizowana partia opracowanych OLP-SLN (F9) wskazuje z grubsza kulisty kształt obserwowany w badaniu TEM (ryc. 5B).

3.6.3 Skuteczność uwięzienia (w procentach)

Stwierdzono, że skuteczność zatrzymywania opracowanych partii SLN OPL mieści się w zakresie 50,17-86,46%, przy czym 80,48% zoptymalizowanej formulacji (F9) wskazuje na dobrą zdolność zatrzymywania leku przez rozwinięte SLN. 3.6.4 Badanie różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) Właściwości, takie jak krystaliczność i zachowanie termiczne opracowanych OLP-SLN, są ważnymi właściwościami, które zapewniają ich zastosowanie w dostarczaniu leków. Termogram DSC OLP (lek), lipid (kompritol 888 ATO) i zoptymalizowany preparat (F9) przedstawiono na ryc. 6. Widmo termiczne OPL wykazało krótki i szeroki pik endotermiczny przy 65,23 stopnia, ale wzrósł do 100,96 stopień . Compritol 88ATO wykazywał endotermiczny pik przy 70,5 stopnia, który przypominał swoją temperaturą topnienia. Pik charakterystyczny OLP był nieobecny na termogramie zoptymalizowanego preparatu (F9). Tutaj zaobserwowano tylko jeden stosunkowo szeroki pik, około 67,81 stopnia, oznaczający uwięzienie OLP w macierzy lipidowej, co prowadzi do powstania OLP-SLN4.

3.6.5 Uwalnianie leku in vitro

Stwierdzono, że uwalnianie leku ze zoptymalizowanego preparatu OLP-SLN (F9) wynosi 95,29±8,13 procent, jak pokazano na Fig.7. Uwalnianie ze zoptymalizowanej formulacji wykazywało dwu-

wzór fazowy tj. początkowe szybkie uwalnianie (23,83±4,51 w ciągu pierwszej godziny) dzięki uwalnianiu leku zaabsorbowanego na powierzchni, a później przedłużone (95,29±8,13 procent w ciągu 24 godzin) dzięki uwalnianiu leku z macierzy SLN. Kinetykę uwalniania preparatu zoptymalizowanego pod względem formy OLP wykryto przez umieszczenie uzyskanych danych dotyczących uwalniania leku w różnych modelach kinetycznych, jak przedstawiono graficznie na Fig.8. Stwierdzono, że maksymalna wartość R²（0.9984） jest dla modelu kinetycznego pierwszego rzędu. Dlatego za najlepiej dopasowany model uznano kinetykę pierwszego rzędu. Stwierdzono, że mechanizm uwalniania jest typu dyfuzji Ficka z wartością wykładnika uwalniania(n)0.441.

3.6.6 Ocena stabilności

W odpowiednich warunkach przechowywania oczekuje się, że każda opracowana postać dawkowania będzie stabilna do czasu jej użycia (data ważności). Tutaj opracowana zoptymalizowana formulacja OLP-SLN (F9) była przechowywana w określonych warunkach przechowywania zgodnie ze specyfikacją podaną przez wytyczne ICH. Preparat przechowywany w temperaturze 4 ± 2 stopni (lodówka) i warunki pokojowe (25 ± 2 stopnie / 60 ± 5 procent wilgotności względnej) nie były znacząco (p<0.05) differ="" from="" the="" initial="" data(zero="" time)in="" respect="" of="" particle="" size,="" pdi,="" surface="" charge(zeta="" potential)="" and="" entrapment="" efficiency.="" a="" significant=""><0.05)in zeta="" potential(-19.27="" mv)and="" entrapment="" efficiency="" (73.29%)and="" a="" significant=""><0.05)in particle="" size(388.37="" nm)was="" observed="" in="" the="" formulation="" stored="" at="" 40±2℃/75±5%="" rh.it="" might="" be="" due="" to="" the="" partial="" loss="" of="" surfactant="" covering(hence="" zeta="" potential="" reduced)which="" leads="" to="" aggregation="" of="" particles(hence="" particle="" size="" increased)and="" leakage="" of="" a="" drug="" in="" the="" external="" environment="" (hence="" entrapment="" efficiency="">

3.6.7 Aktywność przeciwutleniająca

Głównym działaniem OLP jest zapobieganie peroksydacji poprzez oczyszczanie z wolnych rodników oraz przyczynianie się do łagodzenia urazów spowodowanych stresem oksydacyjnym. Jak pokazano na ryc. 9, wolny OLP wykazywał 48,38±5.28 5 procent przeciwutleniacza, co jest istotnie (p<0.01)less than="" the="" anti-oxidant="" activity="" (67.93±7.37%)of="" optimized="" formulation(f9).="" this="" could="" be="" due="" to="" the="" nano-size="" of="" the="" lipid="" particles="" which="" offered="" a="" higher="" surface="" area="" for="" the="" chemical="" quenching="" and="" also="" protect="" the="" olp="" in="" the="" external="" environment.="" no="" absorbance="" was="" found="" for="" the="" blank="" slns="" and="" hence="" blank="" slns="" did="" not="" exhibit="" any="" radical="" scavenging="" activity.="" similar="" findings="" were="" reported="" previously".="" the="" value="" of="" anti-oxidation="" activity="" for="" ascorbic="" acid="" was="" supposed="" to="" be="" 69.42±5.38%="" which="" was="" not="" significantly=""><0.05)from the="" optimized="" formulation(f9).="" 3,6.8="" anti-microbial="">

Badanie wykazało potencjał przeciwdrobnoustrojowy opracowanej formulacji SLN OLP(F9) przeciwko bakteriom takim jak Staphylococcus aureus (Gram-dodatni) i Pseudomonas aeruginosa (Gram-ujemny), jak pokazano na ryc. do ślepej próby, ponieważ nie zawierał ekstraktu OLP.

Maksymalną strefę inhibicji dla kontroli pozytywnej i mieszaniny fizycznej (ekstrakt OLP plus ślepe SLN) zaobserwowano w ciągu pierwszych 6 godzin. Po tym czasie (pierwsze 6h) nie nastąpiła zmiana w strefie zahamowania kontroli pozytywnej i mieszaniny fizycznej. Wartość strefy inhibicji dla kontroli pozytywnej przeciwko Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus wynosiła odpowiednio 7,5±1,25 mm i 8±1,30 mm. Podobnie, wartość strefy zahamowania dla mieszaniny fizycznej (ekstrakt OLP plus ślepe SLN) przeciwko Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus wynosiła odpowiednio 8,25±1,9 mm i 8,60±2,1 mm. Z drugiej strony SLN obciążone OLP wykazywały działanie przeciwdrobnoustrojowe przez dłuższy czas (do 24 godzin) w porównaniu z wolnym OLP i mieszaniną fizyczną. Wynika to z przedłużonego uwalniania OLP z preparatu SLN. Działanie przeciwdrobnoustrojowe SLN załadowanych OLP przeciwko obu bakteriom gram-dodatnim

i bakterie Gram-ujemne obserwowano do 24 godzin. Efekt przeciwdrobnoustrojowy OLP-SLN był istotnie (p<0.001)more than="" that="" of="" olp="" extract="" and="" physical="" mixture="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus.="" the="" value="" of="" the="" zone="" of="" inhibition="" of="" opl-slns="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus="" was="" observed="" at="" 14.75±2.25="" mm="" and="" 16.30±2.1="" mm="" in="" 24="" h="" respectively.="" moreover,="" study="" findings="" indicated="" that="" all="" formulations="" containing="" olp="" extract="" exhibited="" better="" anti-microbial="" efficiency="" towards="" gram-positive="" staphylococcus="" aureus="" as="" compared="" to="" gram-negative="" pseudomonas="" aeruginosa,4".="" to="" the="" best="" of="" our="" knowledge,="" the="" previous="" report="" showed="" that="" the="" major="" constituents="" for="" antimicrobial="" activity="" present="" in="" the="" olive="" extract="" are="" cyclotrisiloxane="" hexamethyl(36.98%),="" cyclo-tetrasiloxane="" octamethyl(15.18%),="" and="" cyclopentasilox-ane="">

4. Wniosek

W tym badaniu proszek ekstraktu z liści oliwnych, który był mniej stabilny w normalnych warunkach środowiskowych, został z powodzeniem przekształcony w stabilną formułę SLN. Zoptymalizowana formuła wykazała obiecującą wielkość cząstek, skuteczność zatrzymywania oraz ładunki powierzchniowe. Zoptymalizowany preparat wykazywał wzór przedłużonego uwalniania leku do 24 godzin po kinetyce uwalniania leku pierwszego rzędu i mechanizmie uwalniania leku typu dyfuzji Ficka. Przeprowadzono badanie stabilności i zoptymalizowany preparat (F9) był stabilny w podanych warunkach przechowywania. Preparat OLP wykazywał obiecujące właściwości przeciwutleniające, co uzasadnia metoda testu DPPH. Działanie przeciwdrobnoustrojowe na bakterie Gram-dodatnie (Staphylococcus aureus) i Gram-ujemne (Pseudomonas aeruginosa). Wreszcie stwierdzono, że SLN mogą być obiecującymi nośnikami dostarczania proszku ekstraktu z liści oliwnych.

Ten artykuł pochodzi z J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)