Galaktan chroni komórki drożdży przed śmiercią apoptotyczną.

Aby sprawdzić, czy galaktan maprzeciwapoptotycznenieruchomości,leczyliśmy mutanty drożdży z niedoborem genu antyapoptotycznego (fs1∆ i pep4∆) galaktanem i wystawialiśmy je na induktor apoptozy, H2O2. Podczas gdy Fis1 drożdży jest mitochondrialnym białkiem fuzyjnym izapobiega apoptozie, drożdże Pep4 jest wakuolową proteazą aspartylową ichroni komórki przed apoptozą indukowaną kwasem octowym80,81. Liczba CFU wykazała około 25–30 procentowy wzrost przeżywalności zarówno komórek pep4∆, jak i fs1∆ po potraktowaniu galaktanem w porównaniu z komórkami poddanymi stresowi apoptotycznemu indukowanemu przez 1 mM H2O2 (ryc. 5A). Wyniki testu punktowego wykazały również zgodność ze zliczeniami CFU, które wykazały lepszą przeżywalność antyapoptotycznych mutantów drożdży traktowanych galaktanem w warunkach stresu apoptotycznego (ryc. 5B). Nasze wyniki pokazują, że galaktan chroni komórki drożdży przed apoptotyczną śmiercią komórkową indukowaną przez H2O2.

Kliknij, aby kupić Cistęnche bogaty w galaktan

Darmowa wysyłka, dostawa na całym świecie.

Galaktan zmniejsza kondensację chromatyny. W tym badaniu przeprowadziliśmy barwienie AO / EB komórek drożdży wstępnie potraktowanych galaktanem. Komórki pep4∆ i fs1∆ z samym H2O2 w większości wydawały się żółto-pomarańczowe w porównaniu z WT, a zauważalne zmniejszenie liczby komórek o żółto-pomarańczowym kolorze zaobserwowano w komórkach wstępnie potraktowanych galaktanem, a następnie wystawionych na działanie H2O2. Pokazuje to, że liczba komórek apoptotycznych znacznie się zmniejszyła w redukcji pep4∆ i kondensacji chromatyny. Barwienie AO/EB jest metodą stosowaną do wykrywania apoptozy zarówno w komórkach drożdży, jak i ssaków. Oranż akrydynowy jest barwnikiem przepuszczalnym dla komórek, który z łatwością wybarwia kwasy nukleinowe zarówno w żywych, jak i nieżywych komórkach, podczas gdy bromek etydyny jest barwnikiem interkalującym DNA, który wchodzi tylko wtedy, gdy komórki są zdezintegrowane, apoptotyczne lub martwe. Ta selektywność barwienia AO/EB umożliwia wykrycie komórek w trzech różnych fazach, tj. żywych komórek o jednolitym zielonym zabarwieniu zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie, komórek wczesnej apoptozy z jasnozielonym jądrem z powodu kondensacji chromatyny, która wyróżnia się w cytoplazmie i późnych komórki apoptotyczne, które mają kolor od żółtego do pomarańczowego/jasnoczerwonego z powodu wniknięcia bromku etydyny do komórek50,51.

Galaktan zmniejsza fragmentację jądra.

Drożdże WT i mutanty z niedoborem antyapoptozy (pep4∆ i fs1∆) wstępnie potraktowane galaktanem lub bez galaktanu wystawiono na działanie H2O2 i poddano barwieniu DAPI. Zmutowane komórki drożdży z niedoborem antyapoptozy poddane wstępnej obróbce galaktanem wykazywały mniejszą fragmentację jądra i niską intensywność DAPI, podczas gdy te bez wstępnej obróbki galaktanem wykazywały znacznie wyższą fluorescencję i zwiększoną fragmentację jądra (ryc. 5D)52. Wskazuje to, że galaktan może skutecznie łagodzić fragmentację jądra wywołaną stresem oksydacyjnym, prowadzącą do rozpadu komórek. Wcześniej wykazano na myszach transgenicznych, że Bifidobacterium breve zmniejsza cechy apoptotyczne, takie jak zrzucanie komórek w komórkach nabłonka jelitowego, w którym pośredniczy EPS obecny na powierzchni błony Bifdobac. Raport pokazuje znaczące, zależne od dawki zmniejszenie złuszczania komórek i poziomów ekspresji markerów apoptozy. Bifidobacterium EPS chroniło komórki przed apoptotyczną śmiercią komórek poprzez modulowanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych szlaków sygnałowych apoptozy 82. Nasze wyniki, zgodnie z poprzednimi wynikami, wskazują, że galaktan EPS chroni drożdżowe mutanty z niedoborem genu antyapoptotycznego pep4∆ i fs1∆ ze stresu apoptotycznego wywołanego przez H2O2.

Galactan przedłuża CLS S. cerevisiae.

Aby ocenić przeciwstarzeniowe działanie galaktanu, wykonaliśmy test CLS z WT i mutantami drożdży (sod2∆, tsa1∆ i ctt1∆) z traktowaniem galaktanem. SOD2 jest manganem SOD, zlokalizowanym w macierzy mitochondrialnej. Delecja SOD2 sprawia, że ​​komórki są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny i wysokie tempo mutacji, ponieważ mtDNA jest bardziej dostępny dla RFT generowanych w mitochondriach83 i jest jednym z genów związanych z chronologiczną długością życia drożdży. TSA1 jest peroksydazą tioredoksyny (przeciwutleniacz specyficzny dla tiolu), która jest związana zarówno z cytoplazmą, jak iz rybosomami. TSA1 bierze udział w nadawaniu odporności komórki na stres oksydacyjny wywołany nadtlenkiem wodoru, a brak TSA1 wpływa na długość życia komórek drożdży. Innemu przeciwutleniającemu mutantowi ctt1∆ użytemu w eksperymencie CLS brakuje CTT1, katalazy cytozolowej zaangażowanej w detoksykację nadtlenku wodoru.

Figura 6 przedstawia wpływ galaktanu na CLS zmutowanych szczepów drożdży pozbawionych genów przeciwutleniających. Podczas gdy komórki WT traktowane galaktanem EPS wykazywały ~ 10 procentowy wzrost żywotności, sod2∆, tsa1∆ i ctt1∆ wykazały 15-20 procentowy wzrost żywotności (ryc. 6). Mitochondrialne ROS prowadzą do starzenia się i uszkodzeń jądrowego DNA, a SOD2 bierze udział w usuwaniu akumulacji ROS w mitochondriach. TSA1 i CTT1 biorą udział w detoksykacji nadtlenku gromadzonego w cytoplazmie, który jest znacznie wyższy w starzejących się komórkach. Nasze wyniki testu CLS wskazują, że EPS usuwa mitochondrialne, jak również cytoplazmatyczne gromadzenie się ROS, zapobiega starzeniu się lub cechom przypominającym śmierć komórek i wydłuża CLS w komórkach drożdży pozbawionych SOD2, TSA1 i CTT154.

Komórkowy stres oksydacyjny jest ściśle związany z procesem starzenia i ma duży wpływ na występowanie wielu chorób związanych z wiekiem, takich jak:cukrzyca, choroba układu krążenias,zaburzenia neurodegeneracyjnei nowotwory. Stres oksydacyjny i stan zapalny to dwa powiązane ze sobą zdarzenia, które odgrywają główną rolę w patologii wielu chorób przewlekłych. Ostatnie doniesienia sugerują ścisły związek między wpływem mikroflory jelitowej na zaburzenia związane z wiekiem. Mikrobiom jelitowy chroni wyściółkę nabłonka jelitowego przed uszkodzeniem komórek wywołanym przez szlaki zapalne wywołane stresem oksydacyjnym. Złożona mikroflora jelitowa wchodzi w interakcje z ROS i systemem obrony antyoksydacyjnej, pomagając w usuwaniu wolnych rodników i zapobieganiu stanom zapalnym. a także może regulować stan oksydacyjny ośrodkowego układu nerwowego poprzez produkcję neuroprzekaźników, takich jak GABA, dopamina i serotonina. Mikrobiom ma również działanie immunomodulujące, zapobiega rozległej kolonizacji drobnoustrojów chorobotwórczych i zapewnia odporność na wiele infekcji drobnoustrojowych83. Wiele mikrobiologicznych polisacharydów zostało przetestowanych w różnych modelach i stwierdzono, że mają wysoki potencjał przeciwutleniający, działanie przeciwzapalne i funkcje ochronne komórek, co zostało potwierdzone przez modulowanie odpowiednich poziomów biomarkerów, w których pośredniczą te egzopolisacharydy82,84. Stwierdzono, że te cząsteczki mają działanie neuroprotekcyjne, zapobiegając blaszkom amyloidowym i śmierci neuronów w eksperymentalnych modelach choroby Alzheimera. Wykazano również, że niektóre z nich zwiększają aktywność SOD, zmniejszają poziomy markerów neurotoksycznych i hamują śmierć neuronów dopaminergicznych w eksperymentalnych modelach choroby Parkinsona.

Theproces starzeniacharakteryzuje się podwyższonym utlenianiem komórkowym, co prowadzi do zwiększonej akumulacji uszkodzeń DNA, podwyższonego tempa mutacji i zmniejszenia żywotności komórek. Wcześniej wykazano, że ROS indukują apoptotyczną śmierć komórek w chronologicznie starzejących się komórkach drożdży, a suplementacja komórek naturalnymi związkami może wydłużyć żywotność starzejących się komórek47,85. Nasze wyniki dotyczące przeciwstarzeniowego działania galaktanu EPS z W. confusa na drożdże sod2∆, tsa1∆ i ctt1∆ pokazują, że galaktan EPS chroni komórki drożdży przed ROS i apoptozą wywołanymi starzeniem oraz zwiększa ich żywotność. Ludzkie homologi tych genów biorą udział w zapewnianiu ochrony przed związanymi z wiekiem zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i nowotworami. Nasze wyniki sugerują, że suplementacja galaktanem EPS może uratować komórki pozbawione tych genów obrony przeciwutleniającej przed śmiercią komórkową związaną z wiekiem i zmniejszyć ryzyko rozwoju chorób związanych z wiekiem.

Wniosek

Stres oksydacyjnyjest przyczyną wielu niekorzystnych procesów wewnątrz komórek, co prowadzi do różnych chorób i zaburzeń. Galactan z W. confusa KR780676 Weissella confusa KR780676 wykazywał wyraźnywłaściwości przeciwutleniającezarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo. Badanie to wyraźnie wykazało, że galaktan chroni drożdżowe mutanty przeciwutleniające przed zewnątrzkomórkowym stresem oksydacyjnym. Galaktan chronił również zmutowane komórki z niedoborem antyapoptozy przed stresem apoptotycznym, w którym pośredniczy oksydacyjny, o czym świadczy zmniejszona fragmentacja jądra. Galaktan obniżył poziom ROS, wydłużając ich oczekiwaną długość życia i chroniąc komórki przed stresem oksydacyjnym. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki dowodzą, że galaktan ma zdolność łagodzenia stresu oksydacyjnego w środowisku poprzez wychwytywanie wolnych rodników. Interesujące byłoby przetestowanie potencjału przeciwutleniającego i przeciwstarzeniowego galaktanu w wyższych modelach komórek eukariotycznych, takich jak linie komórkowe ssaków, a także w modelach zwierzęcych. Galaktanowi przypisuje się silną aktywność prebiotyczną, a aktywność przeciwutleniająca może odgrywać znaczącą rolę w zmniejszaniu stresu oksydacyjnego w jelitach, oprócz utrzymywania homeostazy jelitowej. Dzięki różnym właściwościom technologicznym przypisywanym galaktanowi, takim jak silne właściwości emulgujące, znalazłby ogromne zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym jako naturalny składnik funkcjonalny.

Bibliografia

1. Blokhina, O., Virolainen, E. & Fagerstedt, KV Przeciwutleniacze, uszkodzenia oksydacyjne i stres związany z niedoborem tlenu: przegląd. Ann. Nerw. 91(2), 179-194 (2003).

2. Finkel, T. & Holbrook, NJ Utleniacze, stres oksydacyjny i biologia starzenia. Natura 408(6809), 239 (2000).

3. Seifried, HE, Anderson, DE, Fisher, EI i Milner, JA Przegląd interakcji między przeciwutleniaczami w diecie a reaktywnymi formami tlenu. J. Nutr. Biochem. 18(9), 567-579 (2007).

4. Stief, TW Fizjologia i farmakologia tlenu singletowego. Med. hipotezy. 60(4), 567-572 (2003).

5. Valko, M. i in. Wolne rodniki i przeciwutleniacze w prawidłowych funkcjach fizjologicznych i chorobach człowieka. Int. J. Biochem. Biol komórkowy. 39(1), 44-84 (2007).

6. Wickens, AP Starzenie się i teoria wolnych rodników. Oddech. Fizyol. 128(3), 379-391 (2001).

7. Aruoma, OI Wolne rodniki, przeciwutleniacze i międzynarodowe odżywianie. Azja Pac. J. Clin. Nutr. 8(1), 53–63 (1999).

8. Wade, CR, Jackson, PG, Highton, J. & van Rij, AM Peroksydacja lipidów i dialdehyd malonowy w płynie maziowym i osoczu pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Clin. Chim. Akta. 164(3), 245-250 (1987).

9. Ye, S., Liu, F., Wang, J., Wang, H. & Zhang, M. Aktywność przeciwutleniająca egzopolisacharydu wyizolowanego i oczyszczonego z morskiego Pseudomonas PF -6. węglowodany polim. 87(1), 764–770 (2012).

10. Liu, F., Ooi, VEC & Chang, ST Wychwytywanie wolnych rodników przez ekstrakty polisacharydowe z grzybów. Nauka o życiu. 60(10), 763-771 (1997).

11. Aruoma, OI Wolne rodniki, stres oksydacyjny i przeciwutleniacze w zdrowiu i chorobie człowieka. J. Am. Chemia naftowa. soc. 75(2), 199-212 (1998).

12. Cai, L., Zou, S., Liang, D. & Luan, L. Charakterystyka strukturalna, działanie przeciwutleniające i hepatoprotekcyjne polisacharydów z Sophorae tonkinensis Radix. węglowodany polim. 184, 354–365 (2018).

13. Chanda, S. & Dave, R. Modele in vitro do oceny aktywności przeciwutleniającej i niektórych roślin leczniczych posiadających właściwości przeciwutleniające: przegląd. Afr. J. Mikrobiol. Rez. 3(13), 981–996 (2009).

14. Fan, J. i in. Aktywność przeciwutleniająca polisacharydów Chuanminshen violaceum. węglowodany polim. 157, 629–636 (2017).

15. Huang, L. i in. Wpływ wysokociśnieniowej obróbki mikrofluidyzacyjnej na właściwości fizykochemiczne i aktywność przeciwutleniającą polisacharydu z Mesona chinensis Benth. węglowodany polim. 200, 191–199 (2018).

16. Li, C. i in. Skład flawonoidów i aktywność przeciwutleniająca żółtych kwiatów piwonii drzewiastej (Paeonia sekcja Moutan). J. Agric. Chemia spożywcza. 57(18), 8496–8503 (2009).

17. Maity, P. i in. Badania strukturalne, immunologiczne i antyoksydacyjne -glukanu z jadalnego grzyba Entoloma barwny album. węglowodany polim. 123, 350–358 (2015).

18. Mau, JL, Lin, HC & Chen, CC Właściwości przeciwutleniające kilku grzybów leczniczych. J. Agric. Chemia spożywcza. 50(21), 6072-6077 (2002).