Część 1: Polaryzacja mikrogleju M1 tłumiona akteozydami poprzez zahamowaną ścieżkę sygnalizacyjną NF-κB i odzyskiwanie funkcji mitochondriów za pośrednictwem AMPK

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Pls kliknij tutaj, aby przejść do części 2!

Abstrakcyjny:

Tło:Choroba Alzheimera (AD)jest najczęstszym rodzajem demencji. Podczas gdyakteozyd z ziela cistanche(ACT), związek wyizolowany z Cistanchetubulosa, posiada właściwości neuroprotekcyjne. Jednak mechanizm leżący u podstaw regulacji polaryzacji mikrogleju pozostaje słabo zdefiniowany.Metody:W niniejszym dokumencie zastosowano model AD indukowanej AlCl3- u larw zebry, aby odkryć skuteczność terapeutyczną ACT. Do wykazania roli ACT w polaryzacji mikrogleju wykorzystano komórki BV-2. Połączono sekwencje RNA, HPLC-Q-TOF-MS, western blot i dokowanie molekularne, aby potwierdzić jego mechanizm.Wyniki:ACT znacząco złagodził eksperymentalne dyskinezy i zaburzenia układu nerwowego u zebry. Następnie hamował polaryzację M1 i promował fenotyp M2 w indukowanych LPS komórkach BV-2. W pierwszej kolejności wykazaliśmy, że ACT wywiera silny wpływ transkryptomiczny, który obejmuje regulację kluczowych szlaków sygnalizacyjnych w żywieniu, biosyntezę argininy, a także biosyntezę pantotenianu i CoA, korelując z funkcją mitochondriów. AKT(akteozyd z ziela cistanche) leczenie zmniejszało polaryzację M1 mikrogleju poprzez hamowanie szlaku sygnałowego NF-κB. A szlaki metaboliczne zostały dodatkowo potwierdzone przez HPLC-Q-TOF-MS. Ponadto, ACT skorygował nadmiar ROS w celu przywrócenia funkcji mitochondriów poprzez mediowaną przez AMPK regulację w górę PGC-1 i UCP-2, zgodnie ze zmianami metabolicznymi. Co ciekawe, ACT może bezpośrednio wiązać się zarówno z NF-κB, jak i AMPK, o czym świadczy dokowanie molekularne.Wnioski:Badania dostarczyły infuzyjnego mechanizmu ACT i zilustrowały nową perspektywę opartą na dysfunkcji mitochondriów, aby ujawnić związek między metabolizmem a polaryzacją mikrogleju.

Tło:

Choroba Alzheimerachoroba(AD) jest powszechną chorobą neurodegeneracyjną, której towarzyszą zaburzenia funkcji poznawczych i dyskineza [1]. Charakteryzuje się ciężką utratą neuronów, blaszkami starczymi i splotami neuro¦brillary [2]. Patogeneza AD jest wielowymiarowa i związana z neuroinarmacją. Neuroinarmacja jest napędzana przez aktywację komórek glejowych, ściśle związaną z rozwojem AD[3, 4]. Podczas progresji i zaostrzenia neuroin§amacji mikroglej jest uważany za kluczowy czynnik. Mikroglej to podstawowe komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Jest ściśle związany z kaskadą procesów, obejmujących rozwój mózgu, utrzymywanie neutralnego środowiska, a także reagowanie na urazy i naprawy[1]. Co więcej, mikroglej może być stymulowany do fenotypu M1, a ekspresja cytokin proinarmacyjnych jest zwiększona, gdy wystąpiły choroby związane z neuroinacją, takie jak AD[5]. Badania wykazują również, że polaryzacji na fenotyp M1 często towarzyszą zaburzenia metaboliczne[6], powodujące zachwianie równowagi metabolizmu energetycznego i dysfunkcję mitochondriów[7]. Te niekorzystne zmiany wywodzą się z neurodegeneracji, a nawet AD.

akteozyd z ziela cistanche(ACT), glikozyd fenyloetanoidowy, pochodzi głównie z Cistanchetubulosa. Coraz więcej dowodów sugeruje, że ACT posiada liczne właściwości farmakologiczne, w tym działanie neuroprotekcyjne[8], przeciwzapalne[9] i przeciwutleniające[10]. W szczególności doniesiono, że ACT poprawia upośledzenie uczenia się i pamięci, a także zwiększa metabolizm energii u szczurów indukowanych streptozotocyną [11]. Sugerowano również, że hamuje apoptotyczną śmierć komórek neuronalnych i uszkodzenia mitochondriów u myszy doświadczalnych z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia [12]. Jednak mniej badań koncentrowało się na wpływie ACT na polaryzację mikrogleju M1/M2. W szczególności nie przeprowadzono różnych mechanizmów, takich jak naprawa funkcji mitochondriów i regulacja metabolizmu komórkowego. Ponadto mechanizm ACT przyczyniający się do polaryzacji mikrogleju M1/M2 pozostaje niezbadany.

Celem niniejszego doniesienia było zbadanie skuteczności terapeutycznej ACT, a także podstawowego mechanizmu molekularnego ACT w AD. W tym przypadku ACT wykazał znaczące działanie neuroprotekcyjne w larwach zebry zebry wywołanej przez AlCl3-. Ponadto ACT skutecznie hamował polaryzację M1 i promował fenotyp M2 w indukowanych przez LPS komórkach BV-2. Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) zintegrowane z metodą metabolomiczną w celu lepszego zrozumienia mechanizmu ACT w regulacji polaryzacji mikrogleju. Zbadano zależność między metabolizmem a polaryzacją mikrogleju pod względem funkcji mitochondriów. Badanie to zapewni nowy szacunek dla dalszych badań ACT jako potencjalnego środka terapeutycznego do leczenia AD.

Metody:

Zwierzęta i grupowanie modeli:

W tym badaniu wybrano zeberę typu dzikiego (szczep AB, 4 miesiące) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Utrzymywano je w cyklu światło/ciemność 14/10 godzin w temperaturze 28 stopni, zgodnie z poprzednią metodą[13]. Wytworzono naturalny nawóz i normalnie rozwinięte zarodki i hodowano do 3 dni po zapłodnieniu (dpf) w inkubatorze do naświetlania. Wszystkie eksperymenty z zebrami przeprowadzono pod nadzorem Komisji Etyki Zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Farmaceutycznego.

Larwy zebry zostały podzielone na sześć grup i leczone od 3 dpf do 7 dpf: grupa kontrolna, grupa modelowa, grupa modelowa z chlorowodorkiem donepezilu (DPZ), grupa modelowa i ACT. Grupę kontrolną utrzymywano w pożywce z 0,2% DMSO, a grupę modelową traktowano 150 µM AlCl3 (pH 5,8). Model plus grupa DPZ była jednocześnie traktowana AlCl3 i 8 μM DPZ. Model plus grupy ACT były wspólnie traktowane AlCl3 i różnymi stężeniami ACT (200, 100, 50 μM). AKT(akteozyd z ziela cistanche)(Czystość HPLC Większa lub równa 98 procent) otrzymano z Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Chiny). AlCl3·6H2O i DPZ zakupiono od Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Szanghai Chiny).

Analiza behawioralna

Ruchy larw Zebra¦sh rejestrowano za pomocą analizatora behawioralnego ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) przy 28 stopniach. Krótko mówiąc, parametry behawioralne i przetwarzanie wyników były zgodne z metodą, którą opracowaliśmy wcześniej[13]. Tutaj wybrano średnią prędkość (AS), zmianę prędkości (ΔS), wskaźnik powrotu dyskinezy (DRR) i wydajność odpowiedzi (RE, procent) do oceny powrotu dyskinezy u zebry.

Po traktowaniu od 3 dpf do 7 dpf zebrano larwy zebry do pomiaru aktywności AChE i ChAT. W oparciu o protokół producenta, aktywność wykryto za pomocą zestawów ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Szanghaj, Chiny). Stężenia białka w różnych próbkach określono metodą BCA.

Komórki BV-2 wysiano oddzielnie na płytce 6-dołkowej (n=6/grupę). Po traktowaniu pożywkę usunięto, a komórki przemyto trzykrotnie zimnym PBS. Następnie natychmiast wystawiony na działanie ciekłego azotu w celu zahamowania metabolizmu komórek. Komórki zebrano zimnym 80% metanolem (1 ml/studzienkę) i zawiesinę przeniesiono do 2 ml probówki Eppendorfa. Aby ułatwić strącanie białka, energicznie worteksuj przez 1 min i wiruj przy 13 000 obr./min przez 15 min w 4 stopniach. Zawiesinę komórek przeniesiono do nowej 2 ml probówki Eppendorfa i osuszono w strumieniu azotu i przechowywano w -80 stopniu do analizy. Osuszoną pozostałość rekonstytuowano w 150 µl wstępnie schłodzonego 25% acetonitrylu. Aby zapewnić stabilność i dokładność analizy sekwencji, równe objętości (10 μl) każdej próbki komórek połączono jako próbki kontroli jakości (QC). Podczas wykrywania metabolitów próbki te wstrzykiwano po każdych sześciu próbkach komórek, aby potwierdzić ich stabilność. Próbkę 1 µl wstrzyknięto do HPLC-Q-TOF-MS.

Analizę HPLC-Q-TOF-MS przeprowadzono na układzie HPLC Agilent 1290 połączonym ze spektrometrem masowym Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Rozdział przeprowadzono na kolumnie ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm). Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego-wody (obj./obj.; A) i acetonitrylu (B).

Szybkość §ow ustawiono na {{0}},4 ml/min z następującymi optymalnymi warunkami elucji gradientowej: 0 do 2 min, 5% B; 2 do 20 min, 5% do 95% B (tryb jonów dodatnich); 0 do 2 min, 5% B; 2 do 20 min, 5 do 95 procent B (tryb jonów ujemnych). Parametry pracy spektrometru mas ustalono następująco: temperatura gazu 320 stopni; gaz suszący, 10 l/min; nebulizator, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.

Surowe dane były obsługiwane przez oprogramowanie MassHunter Workstation Software w wersji B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Surowe dane zostały wstępnie przetworzone przez platformę XCMS. Analizę głównych składowych (PCA) i częściową analizę dyskryminacyjną najmniejszych kwadratów (PLS-DA) znormalizowanych danych przeprowadzono za pomocą MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). W połączeniu z literaturą, metabolity różnicowe (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">