CZĘŚĆ 1 Działanie przeciwutleniające i przeciwzakrzepowe glikozydów fenylopropanoidowych wyizolowanych z mioteł (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria i P. Ramosa)
Mar 06, 2022
Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jędrejek b, Agata Rolnik a, Rostysław Pietuchow a,
Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*
Uniwersytet w Łodzi, Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, 90-236 Ł'od'z, Polska
b Zakład Biochemii i Jakości Upraw, Instytut Gleboznawstwa i Uprawy Roślin, Państwowy Instytut Badawczy, 24-100 Puławy
Centrum Badań i Ochrony Bioróżnorodności, Zakład Biologii Środowiska, Instytut Biologii, Uniwersytet Jana Kochanowskiego, 25-406 Kielce, Polska
Abstrakt
Holopasożytnicze rośliny Orobanchaceae, w tymCistanche •, Orobanche i Phelipanche spp są znane z bogactwa glikozydów fenylopropanoidowych (PPG). Stwierdzono, że wiele związków PPG ma szerokie spektrum działania, takie jak środki przeciwdrobnoustrojowe, przeciwzapalne, przeciwutleniające i poprawiające pamięć. Aby lepiej zbadać potencjał bioaktywny miotły europejskich (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) i dziesięciu pojedynczych izolowanych składników fenylopropanoidowych, zbadaliśmy ich działanie przeciwrodnikowe, działanie ochronne przed utlenianiem w osoczu in vitro oraz wpływ na parametry krzepnięcia. Badane ekstrakty wykazały aktywność oczyszczającą 50-70% mocy Trolox. Ekstrakt Z OC, bogaty waktyozyd, miał o ponad 20% lepszy potencjał antyrodnikowy niż ekstrakt PR, który jako jedyny zawierał PPG pozbawione grupy katecholowej pierścienia B w jednostce acylowej. Ponadto stwierdzono, że tylko osiem badanych PPG wykazało potencjał antyoksydacyjny w osoczu ludzkim leczonym H2O2 / Fe; jednak trzy testowane PPG posiadały potencjał antykoagulacyjny oprócz właściwości przeciwutleniających. Wydaje się, że struktura PPG, zwłaszcza obecność grup acylowych i katecholowych, związana jest głównie z ich właściwościami antyoksydacyjnymi. Potencjał antykoagulacyjny tych związków jest również związany z ich strukturą chemiczną. Wybrane PPG wykazują potencjał do leczenia chorób sercowo-naczyniowych związanych ze stresem oksydacyjnym.
Aby uzyskać więcej informacji prosimy o kontakt:Joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche •tubulosa ma wiele efektów
1. Wprowadzenie
Stres oksydacyjny jest powszechnie znany ze swojego negatywnego wpływu na zdrowie organizmów żywych, w tym przyspieszonego starzenia się i niektórych nowotworów. Występowanie stresu oksydacyjnego wiąże się z zaburzoną równowagą między mechanizmami oksydacyjnymi i antyoksydacyjnymi (w tym enzymatycznymi (katalaza, peroksydaza glutationowa) i nieenzymatyczną (glutation) obroną) w komórkach organizmu [1]. Nadprodukcja reaktywnych form tlenu (ROS), w tym rodników utleniających i gatunków zamkniętych, jest jednym z głównych mechanizmów powstawania stresu oksydacyjnego. Jednak efekt biologiczny wywołany przez ROS zależy w dużej mierze od stężenia, czasu ekspozycji i lokalizacji. W normalnych warunkach (niskie stężenie) rodniki tlenowo-azotowe mogą pełnić rolę przekaźników wtórnych, ale na wyższym poziomie mogą zacząć reagować ze strukturami biologicznymi, takimi jak błony komórkowe [2]. Spośród wszystkich gatunków ROS rodnik hydroksylowy (HO.) powoduje jedno z największych uszkodzeń bio-makrocząsteczek: białek, lipidów i DNA. Wiadomo, że stres oksydacyjny odgrywa ważną rolę w wielu chorobach, w tym sercowo-naczyniowych. Zaburzenia układu krwionośnego były skorelowane i/lub poprzedzone zmianami różnych parametrów hemostazy i biomarkerów osocza [1,3].
Z drugiej strony, wiele naturalnych substancji, takich jak polifenole i wielonienasycone kwasy tłuszczowe, zostało zidentyfikowanych jako silne przeciwutleniacze zdolne do zapobiegania powstawaniu i / lub zmniejszaniu reaktywnych form tlenu. Związki o takich właściwościach znajdują się w wielu produktach spożywczych i preparatach farmaceutycznych pochodzenia roślinnego. Dieta wzbogacona o świeże warzywa i owoce oraz terapie antyoksydacyjne oparte na naturalnych antyoksydantach są zatem powszechnie zalecane, ponieważ mogą obniżać poziom stresu oksydacyjnego i zapobiegać różnym procesom patofizjologicznym [4,5]. Polifenole roślinne to zróżnicowana grupa metabolitów wtórnych, wśród których kwasy fenolowe zajmują ważne miejsce, ponieważ są szeroko rozpowszechnione i wykazują różnorodne działanie biologiczne, takie jak środki przeciwdrobnoustrojowe, przeciwutleniające i przeciwzapalne. Glikozydy fenylopropanoidowe (PPG) są estrowymi krewnymi kwasu hydroksycynamonowego i stanowią główną/jedyną klasę metabolitów wtórnych obecnych w holopasożytniczych roślinach Orobanchaceae, w tym:Cistanche •, Orobanche i Phelipanche spp. Kilka gatunków z tej rodziny to poważne szkodniki upraw, których rolnicy chcą się pozbyć na polach (przykład Phelipanche ramosa), niewiele z nich jest stosowanych w farmakologii, podczas gdy większość ma niewielkie znaczenie dla ludzi. HerbaCistanche •jest szeroko stosowany w tradycyjnej medycynie azjatyckiej w leczeniu niedoboru nerek oraz jako środek wzmacniający odporność i pamięć, przeciwstarzeniowy i przeciwzmęczeniowy [6]. Analizy fitochemiczne różnych grup badawczych wykazały, że glikozydy fenylopropanoidowe, takie jak acetonid, echinakozyd i strona podium, są jednym z głównych składników aktywnych Herba Cistanche [7]. Niedawne badania kilku gatunków miotły znalezionych w Polsce przez Jędrejka i in. [8] wykazały, że ten materiał roślinny ma podobny skład jakościowy (dominacja PPG), ponadto jest równy lub nawet przewyższaCistanche •spp. pod względem zawartości substancji czynnych [8].
Cistanche deserticola ma wiele efektów, kliknij tutaj, aby dowiedzieć się więcej
Niniejsze badanie miało na celu ocenę potencjału przeciwrodnikowego i antyoksydacyjnego, a także wpływu na parametry hemostazy trzech ekstraktów z miotły (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Pheli- panache Arenaria – PA i P. ramosa – PR) bogatych w różne fenylo-
prostanoidy, a także ich pojedyncze składniki PPG. Zdolność przeciwrodnikową mierzono za pomocą testów kwasu 2,2′-azinobis-3-etylbenztioazolino-6-sulfonowego / ekwiwalentu boruloksowego (ABTS / TE) i 2,2-difenylo-1-pikrylhybrazylu (DPPH). Stres oksydacyjny w układzie badań osocza indukowano za pomocą rodnika hydroksylowego (H2O2/Fe), następnie peroksydację lipidów (oznaczenie gatunków reaktywnych kwasem tiobarbiturowym (TBARS)) i zmierzono poziom grup karbonylowych i tiolowych białek. Wśród określonych parametrów hemostazy znalazły się: aktywowany czas częściowej tromboplastyny (APTT), czas protrombinowy (PT) i czas trombinowy (TT).
2. Materiały i metody
2.1. Chemikalia
Rodnik 2,2-difenylo-1-pikrylhydrazylu (DPPH), kwas 2,2′-azinobis-3-et-ylbenztiazolino-6-sulfonowy (ABTS), nadsiarczan potasu, kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (Trolox), dimetylosulfotlenek (DMSO), kwas tiobarbiturowy (TBA), kwas mrówkowy (klasa LC-MS) i H2O2 zostały zakupione od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA). Metanol (klasa gradientowa HPLC) i acetonitryl (klasa LC-MS) zostały nabyte od firmy Merck (Darmstadt, Niemcy). Dziesięć fenylo-
związki propanoiczne badane w tej pracy, w tym 2′-O-acetyloakteozyd (97%), 2′-O-acetylopolumozyd (98%), 3-O-metylopoliumozyd (96%), acetonid (99%), arena wewnątrz (97%), krenatozyd (98%), tenipozyd (99%), poliumozyd (99%), kanalik A (96%) i wiedemanniozyd D (96%) zostały wcześniej wyizolowane przez nas z poniżej podanego materiału roślinnego [8]. Czystość związków oceniano za pomocą analizy UHPLC-PDA-MS. Ultraczysta woda została przygotowana we własnym zakresie przy użyciu systemu oczyszczania wody Milli-Q (Millipore Co.). Inne odczynniki były klasy analitycznej i były dostarczane przez krajowych dostawców komercyjnych.
2.2. Materiał roślinny
Rośliny kwitnące trzech gatunków miotłowych, w tym Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel i P. Ramos (L.) Pomel zostały zidentyfikowane przez prof. Renatę Piwowarczyk (Jan Kochanowski Uni- versity, Kielce, Polska) i zebrane z naturalnego źródła w Polsce.
Okazy bonowe (O. Caryophyllaceae – Chomento'wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), murawy kserotermiczne, pasożytnictwo Galium boreale, maj 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), psammoma- użytki zielone i ugorowane, pasożytowanie artemisia campestris, czerwiec 2014;
P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), pole, pasożytnictwo Solanum Lycopersicum, wrzesień 2014) są zdeponowane w Zielniku Uniwersytetu Jana Kochanowskiego w Kielcach (KTC). Materiał roślinny został liofilizowany i drobno zmielony przed ekstrakcją.
2.3. Przygotowanie ekstraktów z miotły
Sproszkowany materiał roślinny (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g i P. ramosa (PR) – 3 g) ekstrahowano 80% MeOH w temperaturze 40 ◦C i 1500 psi (ciśnienie rozpuszczalnika) przy użyciu przyspieszonego ASE 200
ekstraktor rozpuszczalnikowy (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Ekstrakty odparowywano i liofilizowano (liofilizator Gamma 2–16 LSC, Chrystus, Niemcy). Wydajność ekstrakcji dla OC, PA i PR wynosiła odpowiednio 55%, 37% i 43% wagowo materiału roślinnego. Ze względu na wysoką zawartość węglowodanów (dane nie pokazane), surowe ekstrakty zostały dodatkowo oczyszczone przez ekstrakcję w fazie stałej (SPE) na mikrokolumnie Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Cukry usunięto z 1% MeOH, a następnie związki odsetkowe wymyto 80% MeOH. Po usunięciu rozpuszczalnika ekstrakty OC, PA i PR zostały liofilizowane (liofilizator Gamma 2-16 LSC), a wydajność oczyszczania SPE wynosiła 53% (OC), 67% (PA) i 51% (PR).
2.4. Właściwości fitochemiczne ekstraktów z miotły
Analizy jakościowe i ilościowe ekstraktów z miotły przeprowadzono za pomocą systemu ACQUITY UPLC (Waters) połączonego z detektorem fotodiodowym (PDA) oraz tandemowym kwadrupolowym spektrometrem mas (TQD-MS/MS). Liofilizowane ekstrakty OC, PA i PR rozpuszczano w 50% metanolu w stężeniu 0,50 mg/ml, a następnie
chromatografowane na kolumnie BEH C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, Wody). Warunki chromatograficzne były następujące: temperatura pieca – 25 ◦C,
gradient liniowy 10→25% fazy ruchomej B (0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu) w fazie ruchomej A (0,1% kwas mrówkowy w H2O) w ciągu 12 min, natężenie przepływu – 0,4 ml/min, objętość wtrysku – 2 μL, zakres UV – 190–490 nm (rozdzielczość 3,6 nm). Analizę MS przeprowadzono w trybie jonów ujemnych z jonizacją elektrostrysku (ESI), stosując następujące ustawienia: zakres skanowania 100–1200 m/z; napięcie kapilarne 2,8 kV; napięcie stożka 35 V;
temperatura źródła 150 ◦C; temperatura rozpuszczania 450 ◦C; desolvation
przepływ gazu 900 l/h, a przepływ gazu stożkowego 100 l/h. Pozyskiwanie i przetwarzanie danych odbywało się za pomocą oprogramowania Waters MassLynx 4.1.
Piki glikozydu fenylopropanoidowego (PPG) zidentyfikowano poprzez porównanie uzyskanych danych LC-MS z danymi wcześniej wyizolowanych związków [8]. Kwantyfikacja PPG w ekstraktach z miotły została oparta na metodzie UPLC-UV z detekcją przy 330 nm i zewnętrzną kalibracją wzorcową przy użyciuaktyozyd(Sigma-Aldrich, 99%, HPLC) jako
standard grupowy. Liniowa krzywa kalibracyjna została przygotowana w sześciu stężeniach w zakresie 1–200 μg/ml i wykazała dobrą liniowość (R2
0,999). Wyniki ilościowe reprezentują średnią wartość SD trzech wstrzyknięć i zostały wyrażone w miligramachaktyozydekwiwalenty (eq) na gram ekstraktu (mgaktyozydeq/g).
2.5. Działanie przeciwrodnikowe in vitro
2.5.1. Test oczyszczania rodnikowego ABTS
Test przeciwrodnikowy ABTS przeprowadzono metodą opisaną przez Kontek i in. [9], z niewielkimi modyfikacjami w następujący sposób: do przygotowania odczynników użyto 20% MeOH (7 mM ABTS i 4,9 mM potasu na-
siarczan); roztwory ekstraktów OC, PA i PR, w czterech poziomach stężenia w zakresie 100-400 μg/ml, oraz roztwory Trolox, w sześciu poziomach stężenia w zakresie 10 250 μg/ml, przygotowano z 50% MeOH. Proporcja próbki do roztworu roboczego ABTS wynosiła 1:25 (v/v). Absorbancję przy 734 nm mierzono po 30 minutach inkubacji
w ciemności za pomocą spektrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio,
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).
Hamowanie absorbancji (%) obliczono w następujący sposób: [(Absecon-
trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.
Obliczono ekwiwalenty Trolox (TE) ekstraktów miotły
przy użyciu wzoru TE = msample/mstandard, gdzie m jest nachyleniem prostej
krzywe liniowe (hamowanie absorbancji a stężenie). Wartość TE
próbka opisuje jego znormalizowaną aktywność przeciwko Trolox (TEstandard =
1.0). Wartości IC50 dla ekstraktów OC, PA i PR oraz Trolox wynosiły
osiągnięte eksperymentalnie, a następnie zostały obliczone z ich linii prostej
krzywe (hamowanie absorbancji a stężenie) i są wyrażone w
μg/ml.
Test został przeprowadzony w trzech egzemplarzach, a wyniki są prezentowane
jako środki ± odchylenia standardowe (SD).
2.5.2. Test oczyszczania rodnikowego DPPH
Badanie przeciwrodnikowe DPPH przeprowadzono metodą opisaną przez Jedrejka i in. [8] oraz Brand-Williamsa i in. [10], z niewielkimi modyfikacjami w następujący sposób: roztwory ekstraktów OC, PA i PR, w czterech poziomach stężenia w zakresie 50▽ 250 μg/ml, oraz roztwory Trolox, na sześciu poziomach stężenia w zakresie 10▽ 250 μg/ml, zostały przygotowane z 50% MeOH. Proporcja próbki do DPPH wynosiła 1:19 (v/v). Absorbancję przy 517 nm mierzono po 30 minutach inkubacji w ciemności za pomocą spektrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio). Hamowanie absorbancji (%) obliczono w następujący sposób: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Wartości Trolox Equivalent (TE) i IC50 badanych próbek obliczono w taki sam sposób, jak w badaniu ABTS (sekcja 2.5.1). Test został przeprowadzony w trzech egzemplarzach, a wyniki przedstawiono jako środki ± SD.
2.6. Roztwory podstawowe badanych związków roślinnych i ekstraktów do doświadczeń z osoczem ludzkim
Roztwory podstawowe badanych związków i ekstraktów roślinnych przygotowano w 50% DMSO. Ostateczne stężenie DMSO w badanych próbkach było niższe niż 0,05%, a jego efekty określono we wszystkich doświadczeniach.
2.7. Izolacja osocza ludzkiego
Krew ludzką, czyli osocze, pozyskiwano od sześciu stałych dawców (niepalących mężczyzn i kobiet) do banku krwi (Łódź, Polska) i ośrodka medycznego (Łódź, Polska). Krew pobrano jako roztwór CPD (cytrynian/ fosforan/dekstroza; 9:1; v/v krew/CPD) lub roztwór CPDA (cytrynian/fosforan/dekstroza/adenina; 8,5:1; v/v; krew/CPDA). Dawcy nie przyjmowali żadnych leków ani substancji uzależniających (w tym tytoniu, alkoholu i suplementacji antyoksydacyjnej) przez co najmniej dwa tygodnie przed oddaniem krwi. Nasza analiza próbek krwi została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej dla Badań na Ludziach i zatwierdzona przez Komisję ds. Etyki Badań w Doświadczeniach Na Ludziach uniwersytetu łódzkiego. Osocze przygotowano przez odwirowanie świeżej krwi ludzkiej w dawce 4500x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Stężenie białka obliczono, mierząc absorbancję badanych próbek przy 280 nm, zgodnie z procedurą Whitakera i Granuma [11].
2.8. Markery stresu oksydacyjnego w osoczu ludzkim
2.8.1. Pomiar peroksydacji lipidów
Peroksydację lipidów w osoczu określono ilościowo, mierząc stężenie substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS). Stężenie TBARS obliczono przy użyciu molowego współczynnika ekstynkcji (ε = 156 000 M 1 cm 1 ). Metoda jest opisana dokładniej inaczej [12,13]. 2.8.2. Pomiar grupy karbonylowej Poziom grup karbonylowych obliczono przy użyciu molowego współczynnika ekstynkcji (ε = 22 000 M 1 cm 1 ) i wyrażono jako nmol grup karbonylowych/mg białka osocza, według Bartosza [13] oraz Levine'a i in. [14]. 2.8.3. Oznaczanie grupy tiolowej Zawartość grupy tiolowej w białkach osocza mierzono spektrofotometrycznie za pomocą czytnika nanopłytek SPECTROstar Nano (BMG LABTECH, Niemcy) przez absorbancję przy 412 nm z kwasem 5,5′ -ditiol-bis-(2-nitrobenzoesowym). Metoda jest opisana bardziej szczegółowo w innym miejscu [15–17].
2.9. Parametry hemostazy
2.9.1. Pomiar czasu protrombinowego (PT)
PT oznaczono koagulometrycznie za pomocą koagulacji optycznej
Litery wskazują wyniki testu Tukeya (p< 0.05),="" values="" with="" the="">
litera w wierszu nie różni się znacząco.
2.9.2. Pomiar czasu trombinowego (TT)
TT wyznaczono koagulometrycznie za pomocą optycznego analizatora koagulacji (model K-3002, Kselmed, Grudziądz, Polska), zgodnie z metodą opisaną przez Malinowską i in. [18].
2.9.3. Pomiar czasu częściowej tromboplastyny czynnej (APTT)
APTT został określony koagulometrycznie za pomocą optycznego analizatora koagulacji K-3002 (Kselmed, Grudziądz, Polska) według Malinow ska i in. [18].
2.10. Analiza danych Przeprowadzono test Q-Dixona w celu wyeliminowania niepewnych danych.
Dane zostały przetestowane pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu Shapiro-Wilka i równości wariancji z testem Levene'a. Statystycznie istotne różnice zidentyfikowano za pomocą ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya lub testu Kruskala-Wallisa. Porównania uznano za istotne w p< 0.05.="" the="" values="" are="" presented="" as="" means="" ±="">
